CN1357037A - 生物活性材料的保存方法 - Google Patents
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Abstract
可以将生物活性材料不经冻干通过干燥方法保存在玻璃样海藻糖基质中。该方法包括:将该生物活性材料和脱乙酰壳多糖形成团聚体,然后对团聚体和海藻糖溶液的混合物进行脱水。在比经典冻干法短得多的一个周期时间内,可以保存生物活性材料例如病毒、蛋白质和核酸,以提供能够通过重新水化的材料。当从保存的材料中制备疫苗时本发明尤其有用。
Description
本发明涉及生物活性材料例如病毒、细菌和生物分子的保存。具体地，本发明涉及一种超快方法，通过此方法可以采用脱乙酰壳多糖和二糖海藻糖保存这些材料。采用此方法可以实现对生物分子和微生物的长期保存，尤其是可以制备减毒活疫苗。
通过脱水和渗透压浓缩(osmoconcentration)保存生物可降解材料是一项普通的古老技术。当必需保存敏感生物分子时，通过脱水进行的简单干燥将无法胜任此任务，因为结构水的除去会引起随后的变性和生命活性的丧失。在液氮中低温贮藏和冻干已被接受为长期保存敏感生物分子的方法，后一种方法被广泛应用于保存减毒活疫苗。
通过延长第二个冻干周期以便使残留水分含量(RM)减少至大约1％-2％，已经使冻干牛瘟疫苗的耐热性获得了提高。按Mariner，J.C.等，Vet.Microbiol.，1990，21，195-209所描述的，这需要长达72小时的长时间和高能量消耗操作周期。由此方法制备的疫苗称作“THERMOVAX”，而与标准疫苗区分开。
正如以上提及的，目前使用的这些方法均耗时，并涉及高能量的投入。而且，冻干仅赋予终产品中等水平的耐热性，而且仍需要冷藏降低贮存过程中的变质。对于在热带气候下使用的活疫苗而言，这尤其是一个问题，因为这些疫苗会丧失效力而导致不幸的结果，即在难于监测“冷链(cold chain)”的热带国家中野外实施的接种计划将最终导致给患者接种低标准的或，在某些情况下，无效的疫苗。
在进化的自然选择过程中，某些植物和动物物种获得了出色而精巧的耐受极度脱水的能力，以致可以在有害环境中极长时间地保持休眠，并能在重新水化后仍具有完全的生命活性。实例包括更苏植物鳞叶卷柏(Selaginella lepidophyla)、海虾Artemia salina(Clegg，J.，J.Comp.Biochem.Physiol.，1967，20，801-809)、酵母类酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Coutinho，E.，生物技术杂志(Journalof Biotechnology)，1988，7，23-32)、和缓步动物Macrobiotushufelandi(Kinchin，I.M.，生物学家(Biologist)，1995，42，4)。这些生物被称为隐生的，而它们存活的方法被称作低温生活。所有表现出此能力的动物和植物物种都含有二糖海藻糖(α-D-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡糖苷)。海藻糖在大多数隐生生物中一般以约0.2g/g细胞干重的量存在，这使得这些生物可以抵抗极度脱水、高温、X-射线，以及在一些缓步动物物种中还可以抵抗高达600Mpa的压力。
Colaco等，生物技术(Biotechnology)1992，10，1007-1011，描述了采用海藻糖快速干燥生物材料的益处。该方法主要涉及在预先形成的固体基质例如纤维素纤维上，或在用于诊断目的例如ELISA或实验室中类似诊断应用的塑料板表面上，干燥限制性酶和免疫球蛋白。然而，当上升至工业应用时，例如大规模的商业疫苗生产，由于必需在部分密封的小瓶中采用必需的无菌技术操作大得多的单位数量和体积，这些技术产生多个问题。为了满足大规模疫苗生产的操作要求，即典型的1.0ml以上的单位体积和20升的生产批量，需要不同的策略以在经济上可接受的时间内除去该体积的水。在大气压力下，即使在最高的生理耐受温度下进行干燥也将需要一段无法接受的长时间以足够快地从部分塞住的疫苗小瓶中除去水分，而且将不可避免地导致变性和效力的丧失。
Nishimura.K等，疫苗(VACCINE)3，第5期(1985)显示，脱乙酰壳多糖团聚体对粘膜上皮具有高亲和性。这提示，这可能增强抗原向这些细胞中的主动运输，由此刺激IgA和IgG系统免疫应答。
本发明主要涉及在导致除去水分并同时允许维持生物活性材料的生物学完整性的条件下采用脱乙酰壳多糖和海藻糖保存生物活性材料的方法。
因此，本发明提供保存生物活性材料的方法，包括将该生物活性材料的水悬浮液与脱乙酰壳多糖或其无毒性盐的无菌水溶液相混合以形成该生物活性材料和脱乙酰壳多糖或其无毒性盐的团聚体(coacervate)；向该团聚体中加入海藻糖的无菌水溶液；在低于大气压的压力下，于初始不高于37℃并被控制在不降低至0℃或以下温度的温度下，将团聚体和海藻糖的无菌水混合物进行干燥，以形成包含亚稳定玻璃样海藻糖的玻璃样多孔基质，在该基质中含有脱乙酰壳多糖或其无毒性盐和干燥的生物活性材料。
根据一个优选实施方案，保存生物活性材料的方法包括步骤：
(i)将该生物活性材料的水悬浮液和脱乙酰壳多糖或其无毒性盐的
无菌水溶液相混合，以形成该生物活性材料和脱乙酰壳多糖或
其无毒性盐的团聚体；
(ii)将步骤(i)中产生的团聚体和海藻糖的无菌水溶液混合；
(iii)在低于大气压的压力下，在温度最初不超过37℃，并且被控
制不降低至0℃或更低，最终不超过40℃的条件下，对该混合
物进行第一次干燥，时间为30-60分钟，以形成包含玻璃样
海藻糖的、残留水分含量不超过10％的玻璃样多孔基质，在
该基质中含有脱乙酰壳多糖或其无毒性盐和干燥的生物活性材
料；和
(iv)在不超过0.1mbar的压力下，在温度最终处于40-45℃范围
内的条件下，对步骤(iii)的玻璃样多孔基质进行第二次干燥，
时间为10-30个小时，以形成其中含有脱乙酰壳多糖或其无
毒性盐和干燥生物活性材料的、残留水分含量不超过2％的海
藻糖基质。
通过采用本发明的方法，可以制备与现有方法相比具有增强的生物学特性和突出的商业优点的活疫苗。采用本发明方法制备的疫苗比采用常规冻干方法制备的疫苗其干燥速度要快得多。例如，可以采用本发明方法在不到1小时内使海藻糖/脱乙酰壳多糖/生物活性材料混合物的含水量达到约10％。并可以在不足30个小时，例如约20小时的时间内，实现进一步脱水，使残留水分含量达到约1-2％，而常规冻干方法需要50个小时。而且，根据本发明可使由于溶质浓缩造成的损伤最小化，尤其是避免了损伤性冰晶形成。保存在该海藻糖玻璃样基质中的生物活性材料的热稳定性比按现有方法保存的材料的热稳定性高，由此，对常规冻干疫苗是一个严重限制的“冷链”，其必要性被最小化。本发明的产品可以更长时期地暴露于高环境温度例如高达约45℃下，而生物学活性基本上没有损失。除了本发明的这些和其它优点外，本发明方法制备的产品当重新水化时还表现出即刻“速溶性”。
本发明的方法适于长期保存生物活性材料例如微生物、蛋白质、活生物分子和核酸。尤其是，可以采用本发明方法保存可以重新水化形成疫苗的高不稳定性减毒活病毒成分和支原体成分。可以根据本发明方法保存的这些生物活性材料的实例包括：
科：副粘病毒科(Paramyxoviridiae)
亚科：Paramyxovirinae
属：副流感病毒组麻疹(Measles)、牛瘟(Rinderpest)、犬瘟热(caninedistemper)、小反刍动物瘟疫(Peste des Petits Ruminants)(PPR)
副粘病毒属(Paramyxovirus)：腮腺炎病毒(流行性腮腺炎)
属：风疹病毒(Rubivirus)，病毒性风疹(Rubella)(德国麻疹(GermanMeasles))
属：黄病毒(Flavivirus)，黄热病毒(Yellow fever virus)(黄热病)
属：弹状病毒(Rhabdoviruses)，Lyssaviridiae(狂犬病病毒(Rabiesvirus))
细小核糖核酸病毒(Picorna viruses)(脊髓灰质炎病毒(Poliovirus))
新城疫病毒(Newcastle Disease virus)
支原体：Mycoplasma myeoides(牛接触感染性胸膜肺炎)
流产布鲁氏菌(Brucella abortus)：第19株疫苗
根据本发明的方法，将待保存的生物活性材料在适当的水性介质中配制成悬液。情况可能是，病毒或细菌菌株将需要于适当的培养基中培养在例如非洲绿猴肾细胞系上，然后在悬浮前收获以便提供有用浓度的材料。典型地，例如通过加入碱，将生物活性材料水悬液的pH调节至7.0-7.8范围内，尤其是约7.4。
然后将该生物活性材料的悬浮液与脱乙酰壳多糖或其无毒性盐的无菌水溶液混合。脱乙酰壳多糖是通过壳多糖的脱乙酰化，即从(聚N-乙酰葡糖胺)到(聚1，4-β-D-吡喃葡糖胺(glucopyranosamine))制备的一类阳离子多糖的通用名。壳多糖是一种天然生物聚合物，大量存在于甲壳动物的外骨骼中。处在高度抗性“桶状”状态的缓步动物的外皮由壳多糖组成。脱乙酰壳多糖是一种线性阳离子聚电解质，无毒性、具有生物可降解性和生物可相容性，并是一种可溶解在稀释的有机酸中的白色或灰白色无定形半透明固体。脱乙酰壳多糖在本发明中的应用是基于如下发现，即它在保存的生物活性材料周围起到一个保护性生物聚合物壳的作用。因此，脱乙酰壳多糖和本文所述受控的干燥方法的联合使用提高了该干燥材料的热耐受性。典型地，在用于和生物活性材料的悬浮液混合的无菌水溶液中脱乙酰壳多糖的浓度将在0.001％-0.02％w/v的范围内。采用含有0.01％w/v脱乙酰壳多糖的溶液已经获得了极好的结果。优选采用比脱乙酰壳多糖具有更大的可溶性的非毒性酸加成盐形式的脱乙酰壳多糖，例如盐酸脱乙酰壳多糖。
典型地将该脱乙酰壳多糖溶液和生物活性材料悬浮液按约1∶1的体积比，在pH7.4，0℃-37℃的温度，优选低于20℃、最优选约4℃的温度下混合。优选对该脱乙酰壳多糖和生物活性材料进行剧烈搅拌，例如在2-6℃，优选约4℃的温度下涡旋搅拌不超过60秒，以产生均一混合物。典型地，在保持该温度的同时将该混合物放置一段时间以允许形成团聚体，即其中生物活性材料被脱乙酰壳多糖包被的该壳多糖和生物活性材料的吸收(absorption)复合物。典型地，然后通过离心将因此形成的团聚体收集起来。该脱乙酰壳多糖团聚体沉淀物可以用于浓缩低滴度的疫苗库和/或降低进行干燥的加工体积。优选地，该离心步骤在该脱乙酰壳多糖溶液和生物活性材料悬浮液混合后不超过1小时的时间内进行。如果将该混合物储存更长时间，则团聚体沉淀的颗粒不再轻而均一，而是倾向于凝结在一起。优选该离心在典型地维持在约4℃的冷冻离心机中，以约10,000rpm的典型速度进行几分钟。收集后，优选在与海藻糖无菌溶液混合前将该团聚体重新悬浮在适合的介质例如Hanks平衡盐溶液(HBSS)或Hanks乳白蛋白酵母提取物(Hanks LYE)中。一般，将该团聚体重悬在体积等于离心前液体体积的适合介质中，以便该团聚体悬浮液中的生物活性材料的浓度与其在离心前的液体中的浓度一样。然而，如果需要，可以通过将该团聚体重新悬浮在体积数小于离心前液体体积的适合介质中，以浓缩该生物活性材料。通过以此方式浓缩生物活性材料，有效降低了真空干燥阶段中需要除去的水体积，由此减少了蒸发干燥过程中所需的能量并缩短了根据本发明方法干燥该材料所需要的时间。在该生物活性材料是病毒的情况下，通常以此方法浓缩该病毒，即增加该病毒的滴度，可能是有利的。
海藻糖是最稳定的化学上不反应的二糖之一。其具有小于1Kcal/Mol的极低键能，使得该二聚物结构非常稳定。除非剧烈加热否则海藻糖不会发生焦糖化，而且它也不会与蛋白质或肽发生美拉反应。该天然二水化物结构含有两个水分子，使得可以在该二糖键周围造成不寻常的柔性，这样就可以允许与三级结构的生物分子产生更为紧密的联系。海藻糖并非是吸湿性的，但在水化时表现出“速溶性”，此性质对于干燥的疫苗是尤其有用的。
用于本发明方法的海藻糖无菌水溶液典型地将具有0.20％-10％w/v的海藻糖浓度，但也可以使用具有更高海藻糖浓度(例如50％w/v)的溶液以提供进行干燥的混合物中所需的最终海藻糖浓度。优选地，海藻糖浓度为2-10％、更优选2.5-8％w/v。在该海藻糖浓度范围内，所用的实际浓度一般将取决于该生物活性材料的单位大小。小病毒颗粒比大细胞需要较少的海藻糖。
一旦准备好后，对该海藻糖无菌水溶液和重新悬浮的团聚体的混合物进行真空干燥。优选地，采用常规冻干装置(例如EDWARDS、CHRIST、USIFROID或SAVANT制造的冻干装置)进行该干燥操作，以便为该方法中的关键阶段提供可控环境。然而，要强调的是，尽管采用这样的装置，但并不采用冻干条件而且也不对材料进行冻干。该干燥装置的初始温度设置在确保该海藻糖/团聚体混合物不高于37℃、优选37℃的温度上，以便防止在本方法的该阶段出现任何的生物活性丧失。随着该混合物中水的蒸发，该混合物的温度将下降。然而，实施该干燥，以保证不会发生在常规冻干操作中通常经历到的冰冻或冰的升华，即在该干燥操作的此阶段产品的温度被控制不降至0℃或更低，而且典型地被控制不降低至4℃以下。将所用压力减少至大气压力以下，优选800-300mbar。
该干燥阶段的持续时间典型地在30-60分钟之间，在此时间内该海藻糖/团聚体混合物的温度最初随水的蒸发而降低，然后回升。当温度达到约25℃(在所用的减压下)时，该海藻糖形成玻璃样基质。该玻璃样基质的含水量为约10％。优选地，应对该干燥程序结束时该材料的温度进行控制以便其不超过40℃，因为如果允许该温度上升至此温度之上，则生物活性材料将遭受损害。
优选本发明方法利用包括两个干燥阶段的干燥程序：第一个干燥阶段(如上所述)，材料的残留水分含量降低至不超过10％；第二个干燥阶段，该材料的残留水分含量进一步降低至不超过2％。如果采用的话，第二个干燥阶段按以上所述在第一个干燥阶段之后进行，并优选不将该材料从用于该第一个干燥阶段的干燥装置中取出。在第二个干燥阶段，在不超过0.1mbar的减压下，对从第一个干燥阶段结束时获得的玻璃样基质进行进一步脱水。目前可利用的专门装置具有在极低压力，例如低于0.001mbar的压力下操作的能力。然而，根据本发明在此第二个干燥阶段中采用0.001-0.1mbar，典型地0.01-0.1mbar范围内的减压，已获得了非常好的结果。第二个干燥阶段持续的总时间在10-30个小时，优选20-30个小时。
正如以上提及的，第一个干燥阶段结束时该玻璃样基质的温度不应超过40℃。在第二个干燥阶段中，该基质的温度可以稍稍上升，当该干燥程序结束时，达到40℃-45℃的最终温度。在第二个干燥阶段结束时，该海藻糖基质将具有2％或更少，优选1％或更少的残留水分含量，以便保证该产品中有极高程度的热稳定性。在这样的残留水分含量时，该干燥操作的最终温度应不高于45℃，因为高于45℃时该基质中的干燥生物活性材料可能遭到某种程度的破坏。优选地，在第二个干燥阶段结束时，产品的温度将不超过44℃。
通过实验已经发现，在第二个干燥阶段中控制基质温度，以使基质在约37℃维持15-17个小时，然后在第二次干燥的剩余时间内逐渐升高温度(例如每小时0.5-1℃)至40℃-45℃的最终温度，是有利的。
根据该方法制备的玻璃样海藻糖基质可以在不需要冷藏的情况下长期储存，例如几周，而基本上没有生命活性的丧失，并可以在适合的水性介质中，典型的是无菌蒸馏水中，非常快速地重新水化，在极短时间内产生供使用的疫苗。
不经过涉及冰升华的冻干步骤，将冻干仪用于干燥生物活性材料(例如牛瘟病毒和小反刍动物瘟疫病毒及支原体)的该疫苗制备和操作程序，利用了二糖海藻糖在干燥过程中保护三级结构大分子这一独特性质。
与常规冻干方法相比，本发明的方法具有以下优点：
-本发明方法采用相对短的筒单程序，为生物活性材料提供了高
水平的保护。通过可以每循环采用25个小时的优选的两阶段
干燥程序，甚至提供了更高的保护水平。
-由此，与典型的冻干程序相比，降低了制备周期和能量消耗。
-仅要求有基本干燥设备即可，尽管也可以采用精细复杂的微处
理器控制的冻干仪，但这并不是严格必需的。
-该方法耐受电力中断，而冻干则不同，甚至短暂的停电也会引
起产品的融化，导致不可接受的病毒损失。
在过去由于上皮向性(epitheliotropism)的丧失，难于实现某些减毒病毒株的口服接种。口服和鼻内接种对于许多应用而言将是有用和适合的，因为它们可以模拟飞沫传染的天然途径，产生级联保护性粘膜免疫，包括IgA和体液IgG2a T辅助细胞1型应答。实施这些接种途径是容易的，而且一旦制备了适合的疫苗，这些途径将是适用的。脱乙酰壳多糖增加了通过粘膜上皮的跨细胞运输和侧细胞运输(paracellulartransport)，并被认为增强或恢复通常与减毒疫苗株(例如减毒RBOK牛瘟病毒和CBPP S1/44支原体)相关的减小的上皮向性。这在保护机制仍不清楚的CBPP和其它支原体感染中可能尤其重要，尤其是在皮下接种后的接种后免疫中。模拟感染的天然途径接种减毒活病毒株的方法诱导更为广泛的浆液粘液性的和细胞介导的免疫。根据再一方面，本发明提供制备用于口服或鼻内给药的疫苗的方法，其包括根据上述方法制备含有干燥病毒的玻璃样海藻糖基质，然后用适合的水性组合物重新水化该玻璃样基质。根据本发明此方面的优选实施方案，口服或鼻内接种的疫苗是MMR疫苗。由于目前儿科MMR疫苗是通过常规冻干技术制备的，并皮下注射给患者，所以口服或鼻内疫苗将有极大的好处。
实施例1制备二价减毒活兽医疫苗的方法
在含有0.1％海藻糖而非葡萄糖的Hanks LYE(乳白蛋白水解物和酵母提取物)培养基中于非洲绿猴肾细胞系细胞上培养牛瘟病毒RBOK株。将牛接触感染性胸膜肺炎(CBPP)Mycoplasma mycoides subs.mycoidesS1/44(SC)T1-SR培养在Gourlay培养基中。然后收获该病毒库和CBPP库。用0.1M NaOH将该病毒和CBPP库的pH调节至pH7.4。
按如下制备脱乙酰壳多糖的2％w/v贮存液：
盐酸脱乙酰壳多糖(由Pronova Seacure提供) 20g
蒸馏水 1000ml
121℃高压灭菌30分钟。
在Hanks平衡盐溶液(HBSS)中制备50％w/v的海藻糖二水合物贮存液，通过加入0.1M NaOH将pH调节至7.4。该溶液通过121℃高压灭菌20分钟消毒。
通过将1ml 2％w/v脱乙酰壳多糖贮存液加入至99ml无菌蒸馏水中，制备适当体积的工作强度0.02％w/v的脱乙酰壳多糖。
4℃将1体积的0.02％w/v脱乙酰壳多糖溶液加至1体积病毒液体中，用0.1M NaOH调节pH至7.4。单独对该CBPP培养物库重复该步骤，通过快速涡旋搅拌每个样品30秒以获得团聚体复合物，随后将之储存在4℃ 1小时。在冷冻离心机中10,000rpm离心，收集各获得的沉淀物，丢弃上清并将该团聚体重新悬浮在1体积的Hanks平衡盐溶液(HBSS)中。在该团聚体悬液中加入溶解在Hanks平衡盐溶液(HBSS)中的1体积无菌50％w/v海藻糖溶液，产生5％w/v的海藻糖终浓度(通过质量控制标准操作程序检查这些生物的效力)。
将1.0ml的疫苗试样装入用干燥的丁基橡胶塞部分塞住的5ml疫苗小瓶中，以干燥该疫苗。将常规冻干仪(EDWARDS MODULYO)的架子加热至37℃，并使冷凝器达到零下40℃。将该疫苗小瓶放置在该干燥仪中，并将该干燥室中的压力调节至800mbar，进行30分钟干燥直到75％的水分已蒸发，小心不让产品温度降低至0℃以下。然后将压力降低至500mbar，并继续干燥直到达到海藻糖的玻璃过度温度即约25℃，形成玻璃样多孔基质，然后使产品温度上升至接近架子温度的初始温度。在此阶段，残留水分含量(RM)为约10％。在0.01mbar下45℃进一步干燥17个小时，该残留水分含量降低至1-2％RM，保证了该产品中高的热稳定性。
使压力维持在0.01mbar并在真空下或在干燥氮气下于大气压下密封这些小瓶。结果
通过测量该牛瘟病毒和CBPP支原体在其各自的起始液体中和之后在根据上述实施例从该脱水的产品制备获得的疫苗中的滴度，证明了本发明的有效性。牛瘟病毒
1.干燥前起始液体的病毒滴度为5.40 Log 10 TCID 50/ml。
2.本实施例产品(用2.5％海藻糖干燥的)中的病毒滴度为5.45 Log 10
TCID 50/ml。
其中TCID 50/ml＝每ml 50的组织培养物感染剂量。CBPP支原体
1.干燥前活支原体起始液体的滴度是9.90 Log 10 orgs/ml。
2.本实施例产品(用5％海藻糖干燥后)的滴度是8.05 Log 10
orgs/ml。
实施例2材料和方法PPR疫苗培养物的制备
首先采用非洲绿猴肾细胞系细胞，在补加了10％胰蛋白
磷酸盐培养液(TPB，Difco)和10％胎牛血清(Fcs)的Glasgow修饰Eagles培养基(GMEM)中，按如下所述培养小反刍动物瘟疫病毒(PPRV 75/1)株：
将非洲绿猴肾细胞系细胞接种在5个150cm2的塑料瓶中，细胞浓度为287,000个细胞/ml，每个瓶60ml。两个瓶接种0.5ml PPR病毒悬液，感染复数为0.03个病毒颗粒/细胞。一个瓶未接种作为对照。
将这些瓶在5％CO2中37℃进行孵育，每天检查细胞的致细胞病变效应(cpe)的发展。在第4天将GMEM培养基替换为含有2％FCS和0.1％海藻糖二水化物的Hanks乳白蛋白酵母提取物(Hanks LYE)。在第6天，该cpe为大约80％，将病毒收获物汇合在一起，-20℃冻存。对照瓶在培养箱中保留10天，并证明其无污染或细胞降解，而且没有明显的外来物质的迹象。脱乙酰壳多糖溶液
在蒸馏水中制备2％w/v脱乙酰壳多糖贮存水溶液(seacure CI 310)，并在121℃高压灭菌30分钟以消毒。采用无菌蒸馏水稀释该贮存液，产生含有0.02％w/v脱乙酰壳多糖的溶液。方法
用0.1M NaOH将该病毒液体的pH调节至7.4。向一份调节过pH的病毒液体中加入一伤该0.02％w/v的稀释脱乙酰壳多糖溶液，涡旋搅拌该混合物30秒。4℃静置该搅拌混合物1小时以使得可以完全形成团聚体复合物。
在此1小时的静置期结束时，立即在冷冻离心机中10,000rpm离心该混合物20分钟。丢弃产生的上清液，收集该沉淀复合物并重悬在pH7.4含有2％FBS的Hanks LYH培养基中。该重悬培养基的总体积等于进行离心的液体的总体积。
将一份该重悬复合物与一份无菌5％w/v海藻糖二水化物水溶液混合，因此在该混合物中产生海藻糖浓度为2.5％w/v的液体海藻糖。
将1ml体积分装在各个5ml疫苗小瓶中，用干燥的开孔丁基橡胶塞部分密封。该操作在室温于层流防生物危害室中进行，并注意严格的无菌预防措施。第一次干燥
该脱水过程采用Edwards Supermodulyo冻干仪进行，该装置对室内压力、冷凝器压力、架子和产品的温度具有精确的控制。将含有产品的小瓶放置在室内架子上之前，提前准备该冻干仪。将该架子的温度升高至40℃并使冷凝器的温度达到-40℃的操作极限。然后将小瓶放置在架子上，并使内容物达到35℃。关闭室门，完全打开大和小进气阀并打开真空泵，使气镇完全开放。小心关上大进气阀，将室内压力调节至800mbar。使冷凝器中的压力维持在500mbar，以便在该室和冷凝器之间产生压力梯度，这提供了促使水蒸气从产品的表面流向冷凝器的驱动力量。用塞子部分封上这些小瓶也有减小孔隙由此更进一步增加产品表面压力的有益作用。我们注意到，部分封闭的小瓶比含有温度记录热电偶的完全敞开的小瓶干燥得快。
产品的温度在头15分钟内主要通过仔细关闭大进气阀来控制，之后通过操作小进气阀来控制，以确保产品不会发生冷冻。通过蒸发冷却使温度维持在约1-2℃，这增加了蒸发速率，以致90％的水在1小时内蒸发，然后使产品温度开始上升以达到与架子温度相似的温度。随着脱水继续进行，40分钟后达到一个关键点，在此时产品温度突然快速上升至25℃，数秒之后产品温度突然降低，至15℃。这时伴随出现显著的产品起泡。第二次干燥
然后对该批样品进行第二次干燥，其间在接着的17个小时内温度上升至42.4℃的终产品温度，压力为0.06mbar，气镇完全关闭。这具有将材料中残留水分含量减少至约0.72％的作用。
Claims (26)
1.保存生物活性材料的方法，包括将该生物活性材料的水悬浮液与脱乙酰壳多糖或其无毒性盐的无菌水溶液相混合，以形成该生物活性材料和脱乙酰壳多糖或其无毒性盐的团聚体；在该团聚体中加入海藻糖无菌水溶液；在低于大气压的压力下，在温度最初不超过37℃，并且被随后控制不降低至0℃或更低的条件下，对该团聚体和海藻糖的无菌混合物进行干燥，以形成包含亚稳定玻璃样海藻糖的玻璃样多孔基质，在该基质中含有干燥的生物活性材料和脱乙酰壳多糖或其无毒性盐。
2.根据权利要求1的方法，其中该生物活性材料选自病毒、细菌、三级结构生物活性蛋白质和核酸。
3.根据权利要求2的方法，其中该生物活性材料是至少一种选自牛瘟病毒、小反刍动物瘟疫病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、黄热病毒、脊髓灰质炎病毒和新城疫病毒的病毒。
4.根据权利要求2的方法，其中该生物活性材料是牛接触感染性胸膜肺炎(CBPP)支原体。
5.根据权利要求1-4之任一项的方法，其中脱乙酰壳多糖或其无毒性盐的无菌水溶液具有0.01％w/v的脱乙酰壳多糖浓度。
6.根据权利要求5的方法，其中脱乙酰壳多糖无菌水溶液和生物活性材料的水悬浮液按1∶1的体积比在pH7.4混合。
7.根据权利要求1-6之任一项的方法，其中对生物活性材料和脱乙酰壳多糖的团聚体进行涡旋混合。
8.根据权利要求1-7之任一项的方法，其中将该生物活性材料和脱乙酰壳多糖的团聚物与具有0.20-20％w/v海藻糖浓度的海藻糖无菌水溶液混合。
9.根据权利要求8的方法，其中该海藻糖无菌水溶液具有2.5-8％w/v的海藻糖浓度。
10.根据权利要求9的方法，其中该海藻糖无菌水溶液具有约5％w/v的海藻糖浓度。
11.根据权利要求1-10之任一项的方法，其中在低于大气压的压力下，在温度最初不超过37℃，并且被控制不降低至0℃或更低，最终不超过40℃的条件下，对该团聚体和海藻糖的混合物进行30-60分钟的干燥，以形成包含玻璃样海藻糖的、残留水分含量不超过10％的玻璃样多孔基质，在该基质中含有干燥的生物活性材料和脱乙酰壳多糖或其无毒性盐。
12.根据权利要求1-11之任一项的方法，其中该干燥阶段在不超过800mbar的压力下进行。
13.根据权利要求1-12之任一项的方法，其中在不超过0.1mbar的压力下，在温度最终处于40-45℃范围内的条件下，将所获的含有干燥生物活性材料和脱乙酰壳多糖或其无毒性盐的海藻糖基质进行10-30个小时的第二次干燥，以形成其中含有干燥生物活性材料和脱乙酰壳多糖或其无毒性盐的、残留水分含量不超过2％的海藻糖基质。
14.根据权利要求12的方法，其中第二次干燥进行20-30个小时。
15.根据权利要求13的方法，其中第二次干燥在约37℃的温度下进行15-17个小时，并且之后该温度在第二次干燥的剩余时间内逐渐上升，达到40-45℃的最终温度。
16.根据权利要求12-14之任一项的方法，其中在该第二次干燥的步骤结束时残留水分含量为1.0％或更低。
17.制备疫苗的方法，包括根据权利要求1-15的方法保存生物活性材料，并将由此获得的玻璃样产品重现水化在适当的水性介质中。
18.根据权利要求16的方法，其中该疫苗用于口服或鼻内使用。
19.根据权利要求17的方法，其中该疫苗是麻疹、腮腺炎、风疹(MMR)疫苗。
20.可重新水化的组合物，其含有亚稳定玻璃基质形式的海藻糖，在该基质中含有干燥的生物活性材料和脱乙酰壳多糖或其无毒性盐。
21.根据权利要求19的可重新水化组合物，其具有不超过2％的残留水分含量。
22.根据权利要求20的可重新水化组合物，其具有不超过1％的残留水分含量。
23.根据权利要求19-21之任一项的可重新水化组合物，当重新水化时用于制备疫苗。
24.根据权利要求19-22之任一项的可重新水化组合物，其中该生物活性材料选自病毒、细菌、三级结构生物活性蛋白质和核酸。
25.根据权利要求23的可重新水化组合物，其中该生物活性材料是至少一种选自牛瘟病毒、小反刍动物瘟疫病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、黄热病毒、脊髓灰质炎病毒和新城疫病毒的病毒。
26.根据权利要求23的可重新水化组合物，其中该生物活性材料是牛接触感染性胸膜肺炎(CBPP)支原体。
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