CN1420721A - 通过干燥处理制备于环境温度贮存的含有需稳定化的敏感性生物制品的保存用混合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过干燥保存敏感的生物制品、病毒、细菌和真核细胞的制剂和方法。具体而言，本发明涉及含有病毒或细胞和保护剂，包括甲基化的单糖的保存混合物，其中，该混合物适宜于使这些样品在脱水和随后在环境温度和更高温度下的贮存时保持稳定。

Description

通过干燥处理制备于环境温度贮存的含有需稳定化的 敏感性生物制品的保存用混合物

                           发明的背景

技术领域

本发明涉及通过干燥处理保存敏感性生物制品、病毒、细菌和真核细胞的制剂和方法。更具体而言，本发明涉及含有病毒或细胞和保护剂的保存用混合物，其中，该混合物适用于使这些样品在脱水和随后在环境温度和更高温度下的保存稳定化。

相关领域的描述

敏感性的生物分子、病毒、细菌、载体、真核细胞和小型多细胞标本具有广泛的用途，例如，包括人用和兽用药剂、免疫处理和疫苗、分子生物学、基因治疗以及食物工业等方面。一般而言，这些生物活性材料、病毒和细胞在含水环境中是活跃的；因而，这些样品的常规制剂都是水溶液形式。但是，许多生物活性材料(尤其是病毒和细胞)对降解敏感，尤其是在环境温度或更高的温度下在水溶液中可丧失活性和/或生存能力。因此，这种样品常常需要冷藏，否则在环境条件下保存期短。

本领域中已知的大量化学作用原理可破坏各种生物活性材料、病毒和细胞。在几乎所有的这些破坏性途径中，水是一种反应剂。此外，水还可起到增塑剂的作用，使蛋白质伸展和凝聚。由于水在几乎所有的降解途径中是参与者，所以，减少生物活性材料、病毒和细胞中的水溶液或悬浮液水分、使其成为干燥粉末，就可成为提高这些样品的稳定性的一种可选择的制备方法。可使用各种技术使病毒和细胞干燥，这些技术包括冻干、发泡干燥(foam-drying)、喷雾干燥和晾晒干燥。对生物分子、病毒和细胞的水溶液进行干燥处理，并以干燥粉末的形式贮存备用。

除了脱水处理外，玻璃化处理是另一种保存(稳定化)敏感性生物分子、病含毒和细胞的有效方法。在环境温度中的干燥状态下、以及在低温条件下(冷冻)在含水环境中都可实现玻璃化过程。有于许多理由表明，包括保存方便和节约、运输、发运方法选择的灵活性、紧急条件下的可应用性和第三世界国家的可接受性等方面，在干燥状态中的环境温度下的稳定性是极为理想的。因此，生物分子、病毒和细胞在干燥状态下进行玻璃处理是特别有用的。但是，未受保护的生物分子、病毒和细胞的干燥处理也象对这些样品进行冷冻处理一样，很容易对它们造成损伤。因此，需要发展一种保存用混合物，在该混合物中，生物分子、病毒和细胞可被脱水，并以最小的活性或生存能力的丧失而进入玻璃化状态。

例如在WO 99 27071 A、DE 17 92 196 A、WO 91 18091、GB 799 644和美国专利号5,290,765中公开了在干燥状态下保存敏感性生物制品的相关背景技术。

                            发明概要

本发明涉及一种保存用混合物，它含有对干燥和在环境温度或更高温度下贮存期间的活性或生存能力丧失敏感的生物制品、单糖的非还原性衍生物和选自非还原性二糖、非还原性寡糖、二糖的非还原性衍生物、寡糖的非还原性衍生物、蛋白质、高分子保护剂和谷氨酸钠(MSG)中的至少一种保护剂。

在一个最佳的方面，该保存用混合物中的生物制品可选自敏感性生物分子、病毒、细菌、其它的原核细胞、真核细胞。

该保存用混合物具有总的溶质质量。在一个模式中，单糖的经修饰的非还原性衍生物约占总溶质质量的5-80wt％。更佳的是，该单糖的经修饰的非还原性衍生物约占总溶质质量的20-60wt％。

本发明一个最佳模式的保存用混合物是甲基化单糖。具体而言，该甲基化单糖是甲基α-吡喃葡糖苷或甲基β-吡喃葡糖苷。

保存用混合物中所含有的非还原性二糖可能是蔗糖或海藻糖。保存用混合物中所含有的蛋白质可以选自明胶、白蛋白、乳清白蛋白或球蛋白和应激蛋白。在一种模式中，该蛋白质可以是在约50℃以上的温度、在pH约为9以上或小于约5的水性介质中具有稳定性的任何蛋白质。较佳的是，该蛋白质的浓度约大于3wt％，更佳的是约大于10wt％。用在本发明的一个模式中的高分子保护剂可以选自HES、PVP、环糊精和PEG。

在保存用混合物含有MSG、非还原性二糖和/或非还原性寡糖的情况中，这些补充保护剂可约占总溶质质量的5-80wt％，更佳约占总溶质质量的20-60wt％。对于保存用混合物中使用寡糖的情况，根据本发明的一个实施例，这些寡糖最佳不是棉子糖。

较佳将该保存用混合物制成在干燥处理和随后至少2周的保存中不结晶的制剂。最佳的配制包括：蔗糖∶甲基(α或β)葡萄糖约4∶1到1∶2；蔗糖∶MSG的约10∶1到1∶4。

本发明还涉及一种保存对干燥处理和在环境温度或更高温度下贮存期间丧失活性或生存能力敏感的生物制品的方法。该方法包括将该生物制品与保护剂混合，形成保存用混合物(如上述)，然后干燥该保存用混合物，所述保护剂含有单糖的经修饰的非还原性衍生物和选自非还原性二糖、非还原性寡糖、二糖的非还原性衍生物、寡糖的非还原性衍生物、蛋白质、高分子保护剂和谷氨酸钠(MSG)中的至少一种额外的化合物；其中，干燥处理和随后的在环境温度或较高保存温度下贮存期间，该生物制品的活性或生存能力至少有一部分被保留。这种方法很适合于病毒、细菌、其它原核细胞、和真核细胞的保存。

所公开的该方法可应用于多种干燥处理方法，包括冻干、晾干、喷雾干燥、流化床干燥、真空干燥、在干燥气体中干燥和发泡干燥。

在所公开的该方法的一个变化中，混合过程还至少包括两步：向病毒或细胞中加载单糖的非还原性衍生物，然后加入补充化合物中的至少一种，以形成保存用混合物。待生物制品在含有单糖的非还原性衍生物的溶液中平衡就可完成加料操作。

                        附图的简短说明

图1A显示在室温下贮存期间还原性和非还原性糖对ICDH活性的影响。

图1B显示在37℃下贮存期间还原性和非还原性糖对ICDH活性的影响。

图2显示在50℃下贮存期间还原性和非还原性糖对ICDH活性的影响。

图3显示在50℃下贮存期间非还原性糖和麦芽糖精(maltrin)对ICDH活性的影响。

图4显示甲基化葡萄糖的玻璃化转变温度。

图5显示甲基α-d-吡喃葡糖苷对马链球菌(streptococcus equi)的保存过程的影响。图6显示在于37℃贮存期间在全氟萘烷中脱水的荧光素酶稳定性的延长。

                      最佳实施例的详细描述A. 定义

本文中使用的术语“化学稳定性”和/或“保存”指经由化学途径如氧化、水解或酶作用引起的生物材料的降解不超出可接受的水平。换言之，该材料至少保留了一定水平的可满足所需的商业用途的生物活性或生存能力。在本发明的模式中，制剂在37℃贮存1周后再水化还原，如果它仍保留至少20％的生物活性或生存能力，那么就可以认为该制剂得到了保存。

术语“敏感性生物制品”包括肽、多肽、蛋白质、酶和辅酶、血清、维生素、抗体和抗体片段。这些术语中包括天然的或纯化的和重组产生的部分。此术语还包括脂蛋白和翻译后经修饰的形式，如糖基化蛋白质。任何这些物质的类似物、衍生物、激动剂、拮抗剂和药用盐都可包括在这些术语中。该术语还包括具有D-或L-构型的氨基酸的经修饰的、衍生的或非天然的肽。

在本发明的优选模式中，生物制品包括任何能够诱导免疫应答的抗原性物质。具体而言，抗原可以是在肿瘤的细胞外区域表达的蛋白质或其片段(如对癌症治疗时)、变应原、或者传染性因子的部分(如病毒或细菌)。术语“疫苗”指具体类型的免疫处理。其中，生物活性材料是一种传染性因子(或其任何部分)，给予哺乳动物这种疫苗时，可使该动物对由这类因子引起的传染性疾病产生抵抗力。疫苗可包括病毒、细菌和寄生物、病毒粒子和/或病毒或传染性疾病因子或病原体的任何部分，也包括可能是免疫原性的、因此可用在疫苗制剂中的蛋白质和/或核酸。

另一方面，本发明还包括在细胞转化过程中有用的得自病毒、细菌和酵母的载体。这些载体可以用于基因治疗以及分子生物学和遗传工程。在最佳方面，术语“敏感性生物制品”还包括任何病毒、原核和真核细胞以及某些小型多细胞标本。

“泡沫形成保存法”指使生物制品在环境温度和更高的温度下可延长保持活性或生存能力的时间的条件下，通过真空沸腾处理使敏感性生物制品干燥的一种可量度方法。“泡沫形成保法”所包括的具体的方法学上的局限性详述如下，包括两部分，(1)初级泡沫干燥处理和(2)稳定性干燥/玻璃化处理，这些公开在Bronshtein的美国专利号5,766,520中。

本发明中使用的术语“修饰的非还原性单糖”指糖的一般等级。修饰可以是任何已知的化学修饰，优选的是甲基化、乙基化和氯化的衍生物。甲基化衍生物包括α和β形式的单糖类。因而使用术语“甲基(α或β)葡萄糖”。在几个实施例中，使用了一种特定的修饰的非还原性单糖甲基α-d-吡喃葡糖苷，此化合物的缩写形式为MAG。B. 生物材料的保存

以提高温度的方法对生物标本的脱水可能是非常有破坏性的，尤其是例如当干燥处理温度高于适宜的蛋白质变性温度时。为了保护样品不受到与提高温度有关的破坏作用，可逐步进行脱水过程，或者同时增加脱水的温度和程度。初步脱水应在足够低的温度下进行，以不丧失生物制品的活性。本发明使用的保存方法是Bronshtein在美国专利号5,766,520中和未授权的美国专利申请第08/979,458、09/306,137、09/589,381、09/194,499和09/254,563号以及未授权的美国临时申请的60/149,795、60/166,928和60/161,204号中所公开的方法，本文将这些文献的公开内容整体纳入作为参考。

在本发明的优选模式中，根据以下标准选择干燥处理参数，可以使病毒或细胞在脱水期间最大程度地保留其生物活性或生存能力：(1)将保护性化学品加载到病毒或细胞中，使脱水的内部和外部分子、外壳、包膜、和其它生物结构的保护达到最优化；(2)使病毒或细胞在含有渗透性保护剂的加载溶液中保持平衡状态而实现加载要求；(3)最佳使加载了保护剂的病毒或细胞的玻璃化转变温度提高到理想的环境保存温度和/或输送温度之上；和(4)病毒或细胞与保护剂的混合制剂在干燥处理和随后的保存期间较佳至少有一部分维持在非晶化状态。

保护性制剂：在本领域已知有各种多元醇和聚合物都可以用作保护剂，只要它们可提高生物活性材料耐受干燥和贮存的能力并且不干扰其特定的生物活性。实际上，除了可使生物材料在脱水过程中保持稳定外，保护剂分子还可在保存期间提供其它优点(参见下文，即有助于产生力学上稳定的泡沫)。具体而言，本发明的保护剂可包括但不限于简单的糖类(如蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、木酮糖、核糖、甘露糖、果糖、棉子糖和海藻糖)、单糖的各种非还原性衍生物和其它碳水化合物的衍生物、糖醇如山梨糖醇、合成的聚合物(如聚乙二醇、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺和聚乙烯胺)、糖的共聚物〔如FICOLL和葡聚糖(Dextran)〕和它们的混合物。低分子量、高度可溶的蛋白质也可用作保护剂。

在本发明的一个最佳变动中，当受保护的材料是细胞、病毒、病毒粒子和/或病毒性和非病毒性载体时，该保护性组合物还可含有低分子量糖、二糖、寡糖和包括生物聚合物在内的聚合物的混合物。在脱水过程中，低分子量糖可渗透到细胞内，并保护胞内的结构。低分子量的可渗透性糖可从大量的在中性或更高pH下是非还原性的酮糖或者甲基化或乙基化的单糖中选择。非还原性酮糖包括六碳糖：果糖、山梨糖和阿洛酮糖；五碳糖：核酮糖和木酮糖；四碳糖：赤藓酮糖；和三碳糖：1，3-二羟基二甲(基)酮。甲基化单糖是α和β形式的吡喃葡糖苷、吡喃甘露糖苷和吡喃半乳糖苷。二糖如蔗糖已知是晾晒干燥过程中的有效保护剂，因为它可取代生物膜和大分子表面上的水合作用的水。此外，在真空中干燥处理时，也可有效地将蔗糖和/或其它填充物转化成由浓缩糖的薄层非晶形膜组成的稳定性泡沫。

将单糖与二糖和寡糖混合可有效地防止在脱水过程中寡糖形成结晶。此外，可使用聚合物来增加脱水的混合物的玻璃化转变温度(T_g)，这种温度可能会因为低分子量单糖的加入而下降。可使用任何可溶解在浓的糖溶液中的生物聚合物。例如，多糖〔如FICOLL和葡聚糖(Dextran)〕、合成的聚合物(如羟乙基淀粉、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺)，以及高度可溶的天然的和合成的生物聚合物(如蛋白质)将有助于稳定生物膜并增加T_g。

已知一些糖、糖醇和氨基酸如谷氨酸钠(MSG)都具有在干燥处理和随后的保存过程中保护生物制品不受破坏的能力。有几篇出版物可证明二糖如蔗糖或海藻糖对生物大分子和膜细胞具有强大的保护作用。一些研究者在冻干过程中使用含有单糖(如葡萄糖、果糖等)或低分子量糖醇(甘露糖醇、山梨糖醇等)的较为复杂的混合物来保护细胞。与二糖不同，低分子量糖和它们的衍生物能更好地渗入细胞内部以形成细胞内的保护作用。因此，单糖和低分子量糖醇已被广泛应用于保护剂配方中以保护细胞和病毒不受脱水作用的破坏。

含有还原性单糖的保存用溶液在干燥处理后的保存期间可破坏敏感的酶，并且破坏的速率随着保存温度的增加而快速增加(见下文实施例1)。因此，目前假定还原性单糖仅可用在于4℃以下保存的冻干标本的例子中。或者，当生物样品在室温或更高的温度下贮存时，可选择使用其中的保护剂的还原力最小的保护性制剂。在本发明的最佳模式中，糖类的还原性基团都已被甲基化，以增强其保护作用。根据本发明，也可使单糖的还原性基团乙基化等。

低分子量碳水化合物类添加剂可使保护性制剂中的细胞或病毒悬浮液的玻璃化转变温度(T_g)下降。例如，无水果糖的T_g接近7℃；1∶1的果糖∶蔗糖混合物在无水状态下时的T_g稍微低于40℃。葡萄糖的T_g要高得多。因此，使用葡萄糖衍生物可能更有效。例如，甲基化葡萄糖的T_g是29℃(图4)。

保存用溶液中的低分子量添加剂的增塑效果可能会由于使用在无水状态下可增加T_g的可溶性较高分子量添加剂而被部分抵消。根据本发明的一个优选的实施例，保护性制剂含有MSG、非还原性寡糖和可溶的蛋白质。在本专利申请的范围内，我们将-20℃到+50℃的温度定义为环境温度，以广泛地涵盖最大范围的实际用途。但是，较佳的是，本申请中公开的方法和制剂是针对在室温(20-25℃)或以上的温度下贮存和/或运送的生物分子、病毒和细胞的保存。

出乎意料的是，含有甲基化单糖的保护性制剂在保护病毒和细胞方面特别有效。例如，α-甲基葡萄糖(甲基α-d-吡喃葡糖苷)在保存经干燥处理的敏感性生物制品方面已被证明具有独特的保护特征。这可能是由于甲基比该分子中的其余部分更具有疏水性的缘故。因此，甲基化糖具有一些两性分子的行为，可优先被吸附到蛋白质、病毒包膜和其它细胞膜结构的疏水性区域。这种行为可部分解释甲基化葡萄糖的保护作用。此外，很可能能够加载葡萄糖的细胞，也有可能加载α-甲基葡萄糖，以便形成在胞内的保护作用。实际上，已广泛使用α-甲基葡萄糖来研究葡萄糖的跨膜转运。现有技术还未使用过甲基化单糖来保存干燥状态的生物样品。

可惜的是，α-甲基葡萄糖的水溶液在干燥处理过程会形成结晶。因此，α-甲基葡萄糖应与其它填充物〔即蔗糖、海藻糖、麦芽糖精、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蛋白质等〕一起使用，以尽量减少α-甲基葡萄糖形成结晶，并在干燥处理和随后的贮存期间提高非结晶状态的稳定性。例如，如实施例3所讨论和显示，蔗糖/α-甲基葡萄糖溶液在干燥处理期间形成结晶的可能性依赖于蔗糖/α-甲基葡萄糖的质量比。此外，在含有α-甲基葡萄糖的保护性制剂中加入分子量较高的添加剂，将会提高T_g在干燥状态下可达到的值。

初级发泡干燥处理：为了易于进行大规模的加工操作，泡沫形成保存法涉及通过真空沸腾处理形成力学上稳定的多孔结构。在-15℃到70℃温度范围进行干燥处理步骤。在一个优选的实施例中，初级干燥处理步骤中的样品温度小于或等于约5℃。泡沫形成保存法在玻璃化处理之前特别适用于大样品量的有效干燥处理，并且可作为制备适合商业用途的易于磨碎的干燥产品的一种辅助手段。发泡干燥处理的一个优点是该方法可进行规模化加工。例如，该方法可应用于几毫升(分析和最优化操作)到几百升(工业规模生产)含有敏感性生物活性材料的任何体积的溶液或悬浮液的保存。在Bronshtein的美国专利第5,766,520和6,306,345号中对于泡沫形成保存法有更详细的描述。

在本发明中所作的变动是，在真空中进行发泡干燥处理之前，可以先部分除去水分，使稀的生物样品浓缩。这一初级浓缩步骤可在将样品注入处理室之前或之后进行，取决于所选择的浓缩方法。在需要增加生物活性材料的浓度的情况中，预期可用在初级浓缩处理的方法包括冻干、从液态或部分冻干状态中蒸发、反向渗透、其它膜技术或本领域中已知的任何其它各种浓缩方法。

将样品放在真空中，使它们在大大低于100℃的温度下沸腾进行干燥处理。当对含有生物活性材料的溶液或悬浮液使用减压时，该溶液或悬浮液就会发生沸腾而产生泡沫，在形成泡沫的过程中，溶剂会被进一步排除，最终形成力学上稳定的开放孔或封闭孔的多孔状泡沫。该力学上稳定的多孔状结构或泡沫是由浓缩的填充物组成的薄的无晶形薄膜的形成。

进行沸腾步骤中的真空较佳是0-10Torr，最佳小于约4Torr。本文中沸腾处理指含有水蒸气而不是空气或其它气体的成核作用和气泡生长。实际上，在某些溶液中，通过在室温下使用低真空(约0.1-0.9大气压)驱除溶解的气体可能是有利的。这种“脱气处理”可能有助于防止溶液喷出干燥处理容器。

稳定性干燥/玻璃化处理：使初级干燥处理形成的力学上稳定的泡沫在提高温度的条件下进行次级干燥处理或称“稳定性”干燥处理。由于玻璃化转变温度(T_g)取决于样品中的水含量，并且T_g随着脱水程度的增加而增加，所以可根据所需的贮存温度采用不同的稳定性干燥处理方案，以产生与玻璃化(即形成固态无晶形玻璃)一致的T_g。但是，因为材料一旦进入玻璃状态，在事实上就不可能进行脱水处理，所以在可能是理想的环境贮存温度时，本发明玻璃化处理的关键，是在明显高于环境温度的温度下进行稳定性干燥处理。

最终的贮存温度较佳为0-70℃。更佳的是，通常的贮存温度选择是大于或等于0、4、20、40和50℃。在有些情况下，可能优选冷却贮存时，可在室温中进行稳定性干燥处理，随后冷却至贮存温度或以下。但是，在其它的例子中，当需要在室温中保持稳定时，就应使用高于室温的温度进行脱水处理，接着冷却至室温。

对于任何要保存的具体标本，该标本的性质和稳定性特性将决定它在初级干燥处理步骤中所能承受的最大温度。据酶保存的例子显示，在室温下进行初级干燥处理后，其稳定性干燥处理的温度可提高到50℃而酶的活性不会丧失。然后，可在更高的温度中继续进行的稳定性干燥过程中进行脱水处理。从而，通过连续的或逐步的增加脱水处理的温度，就可将不稳定的蛋白质保存在大大高于它们的变性温度的温度中而保持热稳定状态。

除了在高于所选择的贮存温度的温度下进行稳定性干燥处理外，关键的问题是这种干燥处理要进行足够长的时间，以确实将T_g提高到贮存温度之上。从10μl 15％蔗糖+15％棉子糖溶液液滴进行干燥处理获得的经验结果可以证明，为了将T_g提高至25℃以上，就要在70℃以上进行稳定性干燥处理12小时以上。在这些实验中的初级干燥处理是在室温下(20℃)进行12小时。结果表明，为了有效将T_g提高至室温以上，可能需要延长稳定性干燥处理的时间(在70℃要超过12小时，在50℃要超过60小时)。对于一些不是热不稳定性的生物材料，在较高温度下进行的初级干燥处理将使为增加T_g至所选择的贮存温度之上而需要的在更高的温度下进行的稳定性干燥处理的时间减少。

在本发明的一个实施例中，使从稳定性干燥处理所获得的泡沫冷却至研磨温度，经研磨后，将所获得的粉末在真空中或在大气压下进行次级干燥处理。随后的干燥处理温度范围为0-100℃。这种干燥处理可继续进行，直到玻璃化转变温度提高到约0-70℃范围中所选择的贮存温度之上。

为了确保T_g事实上大于贮存温度，已知至少有两种方法可进行热量分析以评估T_g。示差扫描量热法(DSC)是最常用的技术。但是，本发明者已发现，用DSC测量含有聚合物的样品中的T_g方面可能并不可靠。另一种方法是热刺激偏振法(TSP)，特别适用于对聚合物的分析。TSP法是优选的，因为它对所有的样品都是可靠的，不过它需要的样品量较大。

下面的一些实施例阐明了本发明的各种特殊方面，涉及含有病毒或细胞与保护剂的保存用混合物，其中，这类混合物适用于使这些样品在脱水处理和随后的在环境温度或更高的温度下的贮存过程中保持稳定化。

实施例1——研究在室温和37℃贮存期间还原性和非还原性糖和PVP对异柠檬酸脱氢酶(ICDH)的影响。此实验的设计是为了测试添加剂如糖的还原能力。这种还原作用是以产生美拉德反应或酶褐变反应的能力来鉴定。对于单糖或简单的糖，C键上的糖羟基或OH易于与含有NH或NH₂的氨基酸残基如赖氨酸、天冬酰胺发生化学反应。

ICDH酶由供应厂商配制成50％的甘油制剂。使用下述保存用溶液：(1)30％蔗糖+10％PVP溶液；(2)20％葡萄糖+20％PVP溶液；(3)20％果糖+20％PVP溶液；和(4)20％甲基α-d-吡喃葡糖苷+10％PVP溶液。

在15-17℃使ICDH(200μl)在冷的0.1M Tris HCl中透析5小时。缓缓搅拌该缓冲液，使小分子均匀地分散在溶液中。透析后，将ICDH(总体积为180μl)转移到1.7ml微离心管中，在该管中加入250μl、0.1M的Tris HCl缓冲液(pH7.8)。将该管放在冰上。

分别将上述4种不同的保存用溶液之一加到ICDH中后，将所得的ICDH溶液(100μl等分试样)保存在1.7ml微离心管中。这些保存用混合物经搅匀，将其等分至40个试管中，每管10μl。在零时间点检测四种不同的保存用混合物中每一种的一份样品。剩余的样品以室温在真空中干燥处理过夜。经干燥处理后，检测各保存用混合物的另一份样品。将余下的样品分成两组，一组在室温下贮存，另一组在37℃贮存。每隔两周检测在各贮存温度下的每种保存用混合物的一份样品的活性。

用0.1M、pH7.8的Tris HCl稀释所有要检测的样品至10倍，通过搅匀使它们混合。将各稀释样品(10μl)与3ml 0.1M、pH7.8的Tris HCl、10μl 10mM的MnSO₄、10μl 50mM异柠檬酸盐和10μl、10mM NADP⁺溶液混合一起培养。在340nm波长测量随着时间变化的吸光度。以4厘米/分钟的记录纸速测定在20mV的吸光度变化评估其相对活性。结果显示在图1A和1B中。

实施例2——研究在50℃贮存过程中还原过程和非还原性糖以及PVP对异柠檬酸脱氢酶(ICDH)的影响。设计此实验是测试添加剂如糖的还原能力。这种还原过程的特性以产生美拉德反应或酶褐变反应的能力来鉴定。对于一些单糖或简单的糖，C键上的糖羟基或OH易于与含有NH或NH₂的氨基酸残基如赖氨酸、天冬酰胺发生化学反应。

ICDH酶由供应厂商配制成50％的甘油制剂。使用下述保存用溶液：(1)30％蔗糖+10％PVP的溶液；(2)20％葡萄糖+20％PVP的溶液；(3)20％果糖+20％PVP的溶液；和(4)20％甲基α-d-吡喃葡糖苷+10％PVP的溶液。

在15-17℃将ICDH(200μl)在冷的0.1M Tris HCl中透析5小时。轻微搅拌该缓冲液，使小分子均匀地分散在整个溶液中。透析后，将ICDH(总体积为180μl)转移到1.7ml微离心管中，在该管中加入250μl、0.1M的Tris HCl缓冲液(pH7.8)。将该管放在冰上。

分别将上述4种不同的保存用溶液之一加到ICDH中后，将所得的ICDH溶液(100μl等分试样)分别保存在各1.7ml微离心管中。这些保存用混合物经搅匀旋涡处理后，将其等分至40个试管中，每管10μl。在零时间点检测四种不同的保存用混合物中每一种的一份样品。剩余的样品在室温下真空中干燥处理过夜。干燥处理后，检测各保存用混合物的另一样品。在50℃保存余下的样品。每隔两周检测每种保存用混合物的一份样品的活性。

用0.1M、pH7.8的Tris HCl稀释所有要检测的样品至10倍，通过旋涡处理使它们混合。将各份稀释样品(10μl)与3ml 0.1M、pH7.8的Tris HCl、10μl 10mM的MnSO₄、10μl 50mM异柠檬酸盐和10μl、10mM NADP⁺溶液混合一起培养。在340nm波长测量随着时间变化的吸光度。以4厘米/分钟的记录纸速测定在20mV的吸光度的变化以评估其相对活性。结果显示在图2中。

实施例3——研究在50℃贮存过程中还原作用和非还原性糖以及麦芽糖精对异柠檬酸脱氢酶(ICDH)的影响。设计此实验是测试添加剂如糖的还原能力。这种还原特性是以产生美拉德反应或酶褐变反应的能力来鉴定。对于一些单糖或简单的糖，C键上的糖羟基或OH易于与含有NH或NH₂的氨基酸残基如赖氨酸、天冬酰胺发生化学反应。

ICDH酶由供应厂商配制成50％的甘油制剂。使用下述保存用溶液：(1)30％蔗糖+10％麦芽糖精的溶液；(2)20％葡萄糖+20％麦芽糖精的溶液；(3)20％果糖+20％麦芽糖精的溶液；和(4)20％甲基α-d-吡喃葡糖苷+10％麦芽糖精的溶液。

在15-17℃使ICDH(200μl)在冷的0.1M Tris HCl中透析5小时。轻微搅拌该缓冲液，使小分子均匀地分散在整个溶液中。透析后，将ICDH(总体积为180μl)转移到1.7ml微离心管中，在该管中加入250μl、0.1M的Tris HCl缓冲液(pH7.8)。将该管放在冰上。

在分别将上述4种不同的保存用溶液之一加到ICDH中后，将所得的ICDH溶液(100μl等分试样)分别保存在各1.7ml微离心管中。这些保存用混合物经旋涡处理，然后将其等分至40个试管中，为每份10μl。在零时间点检测四种不同的保存用混合物中每一种的一份样品。使剩余的样品在室温下的真空中干燥处理过夜。干燥后，检测各保存用混合物的另一份样品。在50℃保存余下的样品。每隔两周检测每种保存用混合物的一份样品的活性。

用0.1M、pH7.8的Tris HCl稀释所有要检测的样品至10倍，通过旋涡处理使它们混合。将各份稀释样品(10μl)与3ml 0.1M、pH7.8的Tris HCl、10μl 10mM的MnSO₄、10μl 50mM异柠檬酸盐和10μl、10mM NADP⁺溶液混合一起培养。在340nm波长测量随着时间变化的吸光度。以4厘米/分钟的记录纸速测定在20mV的吸光度的变化以评估其相对活性。结果显示在图3中。

实施例4——为了测量甲基α-d-吡喃葡糖苷的玻璃化转变温度，将各种晶体密封在铝皿中，用于DSC研究。样品首先加热熔化，然后使其迅速冷却到-100℃。样品在冷却过程中形成玻璃化。在温热期间(10℃/分钟)要测量玻璃化转变温度。如图4中所示为从玻璃态到液态转变相关的比热变化T_g＝29℃。

实施例5——为了能够评估各制剂在脱水处理和随后的贮存过程中保持非晶形(玻璃)状态的稳定性的能力，进行下述各项实验。产品在结晶过程中可能发生损伤或者在玻璃态基质内裂解。结晶作用是在过饱和或过冷的溶液中发生的两个步骤的过程。第一步是形成拟结晶相的稳定核的晶核化过程。晶核的形成在实验上依赖于材料中的杂质。这些晶核的稳定化依赖于各种溶质或互溶质的温度和浓度。第二步是通过晶体生长过程在晶核上形成结晶增长。这一步也依赖于各种材料中不同成分的温度和浓度。当样品被干燥到接近完全脱水状态时(如果溶质晶体过程是纯净的)晶核形成最佳，如果粘度由于生长的固有动力学而降低时，则将会有利于晶体生长。

如下表中所示，在各成分间的质量比不同的各种化合物的溶解度范围内，以总溶质占30-50％w/w的比例制备各种溶液。使用0.02μm Acrodisc过滤装置过滤所有各份溶液。

如下述，将溶液滴在显微镜平板上，然后分别对其进行快速完全的干燥处理或缓慢而未完成的脱水过程。使用20μl移液管分别将10滴(每滴10μl)液滴加到经酒精清洁的各显微镜玻片上，每份样品40滴。准备一组铺有DRIERITE(干燥剂)层的盒子。将样品玻片放到DRIERITE盒中，然后使用石蜡膜密封。测量晶体随着时间形成的数量并做记录。2周后，将样品转移到52％相对湿度(RH)环境〔经Mg(NO₃)₂饱和处理〕中。再次随着时间测量晶体数量，并做记录。结果列在表1-6中(下文)。

                            表1

                  50％蔗糖∶MSG液滴结晶过程

	0％相对湿度贮存*		52％相对湿度贮存**
					蔗糖∶MSG比	第1周	第2周	第1周	第2周
40∶1	0.00	0.00	7.50	15.00
					30∶1	0.00	0.00	2.50	2.50
20∶1	0.00	0.00	0.00	0.00
					10∶1	0.00	0.00	0.00	0.00
8∶1	0.00	0.00	0.00	0.00
					6∶1	0.00	0.00	0.00	0.00
4∶1	0.00	0.00	0.00	0.00
					2.5∶1	0.00	0.00	0.00	0.00
1∶40	7.50	N/A	12.50	15.00
					1∶30	60.00	N/A	77.50	77.50
1∶20	72.50	N/A	75.00	75.00
					1∶10	72.50	N/A	75.00	75.00
1∶8	75.00	N/A	80.00	80.00
					1∶06	95.00	N/A	95.00	95.00
1∶04	42.50	N/A	42.50	42.50
					1∶2.5	5.00	N/A	5.00	5.00
1∶01	0.00	N/A	0.00	0.00
					50％MSG	70.00	N/A	70.00	70.00

^*DRIERITE

^**Mg(NO₃)₂

                表2

      50％蔗糖∶MSG液滴结晶过程

          (仅用Drierite)

蔗糖∶MSG比	第1周	第2周
			50％蔗糖	0.00	0.00
40∶1	0.00	0.00
			30∶1	0.00	0.00
20∶1	0.00	0.00
			10∶1	0.00	0.00
8∶1	0.00	0.00
			6∶1	0.00	0.00
4∶1	0.00	0.00
			2.5∶1	0.00	0.00
1∶1	0.00	0.00
			1∶2	0.00	0.00
1∶4	2.50	2.50
			1∶6	0.00	0.00
1∶8	15.00	15.00
			1∶10	65.00	65.00
1∶20	92.50	92.50
			1∶30	97.50	97.50
1∶40	2.50	2.50
			50％MSG	100.00	N/A

                           表3

                50％蔗糖∶肌醇液滴结晶过程

	0％相对湿度贮存*		52％相对湿度贮存**
					肌醇∶MSG比	第1周	第2周	第1周	第2周
4∶1	90	100	N/A	N/A
					6∶1	100	N/A	N/A	N/A
8∶1	0	100	N/A	N/A
					10∶1	0	70	100	N/A
12∶1	0	67.5	100	N/A
					16∶1	0	0	100	N/A
20∶1	0	0	100	N/A
					50％蔗糖	0	0	12.5	22.5

^*DRIERITE

^**Mg(NO₃)₂

                             表4

         50％蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷(MAG)液滴结晶过程

	0％相对湿度贮存*		52％相对湿度贮存**
					蔗糖∶MAG比	第1周	第2周	第1周	第2周
40∶1	0.00	0.00	2.50	N/A
					30∶1	0.00	2.50	2.50	N/A
20∶1	0.00	0.00	5.00	N/A
					10∶1	0.00	0.00	0.00	N/A
8∶1	0.00	0.00	2.50	N/A
					6∶1	0.00	0.00	0.00	N/A
4∶1	0.00	0.00	0.00	N/A
					2∶1	0.00	0.00	0.00	N/A
1∶1	0.00	0.00	2.50	N/A
					1∶2	0.00	0.00	7.50	N/A
1∶4	0.00	2.50	5.00	N/A
					1∶6	45.00	55.00	65.00	N/A
1∶8	22.50	47.50	67.50	N/A
					1∶10	30.00	52.50	52.50	N/A
1∶20	67.50	100.00	N/A	N/A
					1∶30	67.50	100.00	N/A	N/A
1∶40	100.00	N/A	N/A	N/A
					50％MSG	100.00	N/A	N/A	N/A

^*DRIERITE

^**Mg(NO₃)₂

                            表5

        50％MSG∶甲基α-d-吡喃葡糖苷(MAG)液滴结晶过程

	0％相对湿度贮存*		52％相对湿度贮存**
				MSG∶MAG比	第1周	第2周	第1周
50％MSG	N/A	N/A	N/A
				40∶1	N/A	N/A	N/A
30∶1	N/A	N/A	N/A
				20∶1	45.00	45.00	45.00
10∶1	97.50	97.50	97.5
				8∶1	100.00	N/A	N/A
6∶1	2.50	2.50	7.5
				4∶1	2.50	2.50	2.5
2∶1	0.00	0.00	0
				1∶1	0.00	0.00	35
1∶2	2.50	7.50	17.5
				1∶4	2.50	5.00	5
1∶6	20.00	22.50	37.5
				1∶8	5.00	7.50	12.5
1∶10	87.50	87.50	95
				1∶20	37.50	45.00	55
1∶30	87.50	90.00	95
				1∶40	70.00	92.50	92.5
50％MSG	100.00	N/A	N/A

^*DRIERITE

^**Mg(NO₃)₂

当使用50％MSG和甲基α-d-吡喃葡糖苷时，应注意的是，分别为40∶1和30∶1比率的溶液在室温下贮存过夜后形成结晶(表5)。

根据表6(下文)所示的结果可以看出，50％的1∶10、1∶20、1∶30和1∶40的MSG∶海藻糖溶液在室温下过夜而形成结晶。因而，这些制剂没有用于液滴分析。

          表6

  50％MSG∶海藻糖也结晶

    (仅用Drierite)

MSG∶MAG比	第1周
		50％MSG	100
40∶1	100
		30∶1	0
20∶1	2.5
		10∶1	0
8∶1	5
		6∶1	0
4∶1	0
		2∶1	0
1∶1	0
		1∶2	0
1∶4	100
		1∶6	0
1∶8	100
		1∶10	N/A
1∶20	N/A
		1∶30	N/A
1∶40	N/A
		50％MAG	100

实施例6——分别培育并收集牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、年传染性鼻气管炎(IBR)病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVD)和副流感病毒3(PI₃)。收集后，用稳定剂混合所得病毒，然后将其分散成大约40ml的等分试样，在-80℃冰库中冷冻直至使用。

在0.01M磷酸盐缓冲液中配制下述70％w/w的各种保存用溶液，并用Corning0.22μm PES(聚醚砜)过滤系统进行无菌过滤：(1)2∶1的蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷；(2)6∶1蔗糖∶肌醇；(3)2∶1蔗糖∶异麦芽糖(isomalt)；(4)5∶2的蔗糖∶山梨糖醇；(5)海藻糖；(6)5∶2的蔗糖∶MSG。

所有各产品的制备都在18℃的房间中进行。从-80℃的冰库中取出病毒，将其放到冷的自来水中解冻(大约1小时)。使用无菌技术，在无菌的50ml聚丙烯锥管中按确定的比例制备四种病毒的混合物。将2份无菌保存用溶液加到1份病毒混合物中。经旋涡处理获得均质混合物。将2.4g病毒/保存用溶液混合物加载到无菌的30ml硼硅酸盐玻璃血清瓶(Wheaton型)中。然后将无菌的13mm长的终止冻干塞子分别放到各瓶口的第一级上，使塞子上的槽口开放，以便在保存期间由泡沫形成而使水分蒸发。然后将瓶子放到金属的干燥处理盘中。将这些盘子装载到经过修改的预冷的(5℃)冷冻干燥器中，以进行泡沫形成保存法。将热电偶放到在其中一个瓶子中，以监测干燥处理期间样品的温度。然后进行干燥处理。结束泡沫形成保存法后，在真空下塞好瓶子，然后从干燥器中取出。用铝锯片卷边密封瓶子，在4℃保存。采用下述各种方法测试保存的样品以及冷冻的对照样品。

将Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞维持在含有5％供体马血清(JRH Biologicals)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中。该血清是抗体，并且不含有BVD、IBR、PI₃和BRSV。从NVSL获得下述病毒中和的血清，并将其应用于每一份疫苗的病毒滴定：BVDV抗血清NVSL批号4X；PI3抗血清NVSL批号86.2；IBRV抗血清NVSL批号10X；和BRSV抗血清NVSL批号88.5X。

通过使用经病毒特异性抗血清中和其它三部分的4-联疫苗对BRSV、IBR、BVD和PI₃各样品每一份进行病毒滴定。用胰蛋白酶-EDTA(批号#7B2028，JRHBioscience)取出培育在490cm²摇瓶中的MDBK细胞的培养物，以1.5×10⁵细胞/毫升的密度将其悬浮在DMEM+5％马血清中。在96孔平板中每孔接种200μl的细胞悬浮液。该微滴定板培育过夜，一般在第二天当细胞汇后成单层约铺满80％时进行病毒滴定。

每瓶保存的病毒(4-联疫苗)用15.5ml DMEM再水合还原成溶液。将此溶液作为10^-0稀释液。将4瓶分别再水合的疫苗混合，用于病毒滴定。对照病毒是冷冻的病毒。取得0.1ml的再水合疫苗样品，将其加到无菌的含有其它三种病毒各自的抗血清的1ml小瓶中，每种抗血清有0.3ml。例如，如果滴定BVD，则将0.1ml的疫苗加到含有0.3ml抗IBR血清、0.3ml抗BRSV血清和0.3ml抗PI₃血清的小瓶中。此阶段的总体积是1.0ml，病毒稀释度为10^-1。室温下培育该混合物40分钟。

将22μl中和的(10^-1)样品加到96孔平板第一排的孔(200μl)中，制备稀释成10倍的病毒液。混合各孔的溶液(这是10^-2稀释度)，然后取22μl转移到第二排，依次类推，直至最后一排。在第1到第10列进行病毒滴定。第11和12列留作未感染的细胞对照组。在37℃、在5％的CO₂境中培育该平板4天。据致细胞致病作用(CPE)变化读数测定病毒的感染情况。最后，使用Reed-Muench法计算病毒效价。记录从各对照病毒和保存的各种疫苗获得的4种病毒的效价，比较保存期间病毒的损失情况。结果列在表7中，两份数据表示重复实验的结果。

                                                表7

                   甲基α-d-吡喃葡糖苷和糖醇对保存BRSV、IBR、BVD和PI₃病毒的保护效果

	保存后的初始存活情况(％)
					保存用溶液	BRSV	IBR	BVD	PI3
2∶1的蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷	57.5，64.6	52.5，37.2	66.1，58.9	125.9，89.1
					6∶1的蔗糖∶肌醇	38.0，29.6	13.5，10.7	97.7，24.0	67.6，24.0
2∶1的蔗糖∶异麦芽糖	36.3，33.9	16.6，13.5	83.2，9.8	69.2，26.9
					5∶2的蔗糖∶山梨糖醇	35.5	17.8	2.5	28.8
海藻糖	33.9	20.0	16.2	102.3
					5∶2的蔗糖∶MSG	21.0，29.5	38.0，35.5	87.1，49.0	91.2，35.5

实施例7——分别培育并收集新城疫病毒和支气管炎病毒。收集后，用稳定剂混合所得病毒，然后将其分配成大约200ml的等分试样，然后在-80℃冷库中冷冻直至使用。

在0.01M磷酸盐缓冲液中配制下述70％w/w的各种保存用溶液，并用Corning0.22μm PES(聚醚砜)滤器系统无菌过滤：(1)2∶1的蔗糖：甲基α-d-吡喃葡糖苷；(2)4∶1蔗糖∶MSG；(3)4∶1蔗糖∶麦芽糖醇；(4)13∶1的蔗糖∶甘露糖醇。

所有的产品制备工作都在18℃的房间中进行。从-80℃的冷库中取出病毒，将其放到冷的自来水中解冻(大约2小时)。使用无菌技术，在无菌的50ml聚丙烯锥形管中制备1∶1的两种病毒的混合物。将2份无菌保存用溶液加到1份病毒混合物中。经旋涡处理获得均质的混合物。每份病毒/保存用溶液混合物取3.0g加载到无菌的30ml硼硅酸盐玻璃血清瓶(Wheaton型)中。然后将无菌的13mm长的终止冻干塞子的第一级塞入到各瓶子口中，使瓶塞上的槽口开放，以使保存期间泡沫形成时的水分蒸发。然后将瓶子放到金属干燥处理盘中。将这些盘子叠放到经修改成可执行本发明的泡沫形成保存法的预冷的(5℃)冷冻干燥器中。将热电偶放到其中的一个瓶子中，以监测干燥处理期间样品的温度。保存结束后，在真空下塞好瓶子，然后从干燥器中取出。用铝片卷边封盖密封瓶子，在室温或4℃下保存根据进行干燥处理的T_d值而定(即如果T_d＝30℃，样品在室温下保存；如果T_d＝20℃，则冷藏保存样品)。

如上述实施例6所述检测病毒效价。单项实验的结果列在表8中。

                               表8

甲基α-d-吡喃葡糖苷和糖醇对保存新城疫病毒和支气管炎病毒的保护效果

	保存后的最初存活情况(％)
			保存用溶液	新城疫病毒	支气管炎病毒
2∶1的蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷	100	20.4
			4∶1的蔗糖∶麦芽糖醇	56.2	2.4
13∶1的蔗糖∶甘露糖醇	55.0	4.8
			4∶1蔗糖∶MSG	23.4	0.4

实施例8——对于马链球菌的保存，要用0.01M磷酸盐缓冲液配制下述70％w/w的各种保存用溶液，并用Corning 0.22μm PES(聚醚砜)过滤器无菌过滤：(1)4∶1的蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷；(2)1∶1蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷；(3)5∶2蔗糖∶谷氨酸盐。

从-80℃冷库中取出一瓶冷的种子原液(批号WS012696)，然后在冷水中解冻。将全部内容物(1.0ml)转移到150ml“马链球菌生长培养基”(批号0757)中。根据制剂的重量，在每升该培养基中加入20g 50％的右旋糖。将瓶塞松开，放在37℃下的100rpm的摇床上培育大约20-24小时。使该培养物生长至其600nm波长的光密度(OD)达到0.8-1.5(～12小时)。用接种环挑一环培养物接种到TSA II+5％血琼脂(批号K1RUWW)上作纯菌划线培养。在37℃培育24-48小时后，检测平板，没有检测到污染情况。

培育大约23.5小时后，将10ml预培养物转移到含有250ml生长培养基的500ml烧瓶中。在先前所述的条件下培育该预培养物约4小时。再作纯菌划线接种到TSAII+5％血琼脂上。在37℃培育24-48小时后，检测该平板，并未发现有污染情况。在600nm波长测量该预培养物的吸光度是1.888。

大约5小时后，将第二份预培养物50ml接种到含有100ml马链球菌的肉汤+右旋糖的发酵罐中。发酵的条件是：以为1升/分钟的条件通入加压氧气、搅拌速率为100rpm，在37℃温度下用2.5N HCl和2.5N NaOH调节pH值。

一旦培养物达到稳定状态，即以1∶1的重量比例混合该细胞培养物和保存用溶液。经旋涡处理得到均质的混合物。每份病毒/保存用溶液混合物取1.0g，将其加载到无菌的10ml硼硅酸盐玻璃血清瓶(Wheaton型)中。然后用无菌的13mm长的终止冻干塞子分别将其第一级塞入各瓶子口中，使瓶塞上槽口开放，以使保存期间的水分蒸发。然后将瓶子放到金属干燥处理盘中。将这些盘子放到经修改以执行泡沫干燥方法的预冷的(5℃)冷冻干燥器中。将热电偶放入其中的一个瓶子中，以监测干燥处理期间样品的温度。保存结束后，在真空下塞好瓶子，然后从干燥器中取出。用铝质卷边封盖密封瓶子，在室温保存。

用PBS将各对照样品的等分试样(1g)(细胞培养物+保存用溶液)稀释10倍。用10ml PBS再水合用血琼脂分别制备3个10^-5-10^-6的涂布平板。各份保存的细胞的样品瓶。进一步将各份对照的和保存的样品稀释到10^-4和10^-5。用分别制备3个涂布10^-5和10^-6用血琼脂分别制备3个10^-5-10^-6的涂布平板上。在37℃培育这些平板48小时。分别计算各平板上形成的菌落数。使用产生30-300个菌落的平板计算每毫升中菌落形的单位(CFU/ml)。然后将保存样品的CFU/ml除以对照样品(细胞培养物)的CFU/ml，以计算保存后的存活％。结果列在图5中。

实施例9——分别培育并收集牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎(IBR)病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVD)和副流感病毒3(PI₃)。收集后，用稳定剂混合所得病毒，然后将其分配成若干大约40ml的等分试样，然后在-80℃冷库中冷冻直至使用。

用0.01M磷酸盐缓冲液配制下述70％w/w的各种保存用溶液，并用Corning(康宁)0.22μm PES(聚醚砜)过滤器系列(Filter Systems)无菌过滤：(1)2∶1的蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷；(2)4∶1蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷；(6)5∶2的蔗糖∶棉子糖。

所有的产品制备工作都在18℃的房间中进行。从-80℃的冷库中取出病毒，将其放到冷的自来水中解冻(大约1小时)。使用无菌技术，在无菌的一组50ml聚丙烯锥形管中，按预定比例制备四种病毒的混合物。将2份无菌保存用溶液加到1份病毒混合物中。经旋涡处理获得均质的混合物。将各份病毒/保存用溶液混合物分别取2.4g加载到一组无菌的30ml硼硅酸盐玻璃血清瓶(Wheaton型)中。然后将无菌的13mm长的终止冻干塞子的第一级放入各瓶子口中，使瓶塞上的槽口开放，以使保存期间泡沫形成时的水分能够蒸发。然后将瓶子放到金属干燥处理盘中。将这些盘子放到经修改可进行泡沫形成保存法的预冷的(5℃)冷冻干燥器中。将热电偶放入一个瓶子其中的中，以监测干燥处理期间样品的温度。然后进行干燥处理。泡沫形成保存法结束后，在真空下塞好瓶子，然后从干燥器中取出。用铝质卷边封盖密封瓶子，然后在4℃保存。采用下述条件方法评估各份保存的样品以及冷冻的对照样品。

将Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞维持在含有5％供体马血清(JRH Biologicals)的Dulbecco改进的Eagle培养基中。该血清是抗体，并且不含有BVD、IBR、PI₃和BRSV。从NVSL获得下述条件病毒中和的血清，并将其应用于每人疫苗的病毒滴定中：BVDV抗血清NVSL批号4X；PI3抗血清NVSL批号86.2；IBRV抗血清NVSL批号10X；和BRSV抗血清NVSL批号88.5X。

通过使用经病毒特异性抗血清中和其它三部分的4-联疫苗来对BRSV、IBR、BVD和PI3的各部分样品进行病毒滴定。用胰蛋白酶-EDTA(批号#7B2028，JRHBioscience)取出培育在490cm²摇瓶中的MDBK细胞的培养物，以1.5×10⁵细胞/毫升的密度将其悬浮在DMEM+5％马血清中。在一组96孔平板中每孔接种200μl的细胞悬浮液。过夜培育各该微滴定板，第二天当细胞汇合成单层约铺满80％时进行病毒滴定。

使用15.5ml DMEM再水合每瓶保存的病毒(4-联疫苗)。将此溶液作为10^-0稀释液。将4瓶分别再水合的疫苗混合，用于病毒滴定。对照病毒是各份冷冻的病毒。取得0.1ml的再水合的疫苗样品，将其加到无菌的含有其它三种病毒各自的抗血清的1ml小瓶中，每种抗血清有0.3ml。例如，如果滴定BVD，则将0.1ml的疫苗加到含有0.3ml抗IBR血清、0.3ml抗BRSV血清和0.3ml抗PI₃血清的小瓶中。此阶段的总体积是1.0ml，病毒稀释度为10^-1。室温下培育该混合物40分钟。

分别将22μl中和的(10^-1)样品加到一组96孔平板第一排的孔(200μl)中，制备稀释了10倍的病毒液。混合各孔的溶液(这是10^-2稀释度)，然后取22μl转移到第二排，依次类推，直至最后一排。对第1到第10列进行病毒滴定。第11和12列卤作未感染的细胞对照组。在37℃、在5％的CO₂环境中培育各份平板4天。以细胞致病作用(CPE)读数测定病毒的感染情况。最后，使用Reed-Muench法计算病毒效价。记录从对照病毒和保存的疫苗获得的4种病毒的效价，比较保存期间病毒的损失情况。结果列在表9中。

                                   表9

	保存后的存活情况(％)
					保存用溶液	BRSV	IBR	BVD	PI3
2∶1蔗糖∶MAG	115.0	12.6	97.7	105.0
					4∶1的蔗糖∶MAG	63.1	7.4	37.2	85.1
5∶2的蔗糖∶棉子糖	44.7	4.6	77.6	34.7

实施例10——制备悬浮在全氟萘烷中的荧光素酶(Sigma#L-9560)的保存用制剂并测试其稳定性。用含有1mg/ml BSA的1ml 0.1M、pH7.4的Tris缓冲液溶解冻干的荧光素酶(1mg)。在4℃，在含有1mg/ml BSA的500ml 0.1M、pH7.4的Tris缓冲液中透析所得的1mg/ml荧光素酶溶液3.5小时。将经透析的荧光素酶转移到微离心管中，使用下述方程测算该荧光素酶的浓度：

荧光素酶浓度＝初始的荧光素酶(μg)/透析后的荧光素酶的最终体积(ml)

将500μl、1μ/μl经透析的荧光素酶和99.5g、50％的10∶1的蔗糖∶MSG保存用溶液混合制备保存用混合物。然后将这些保存用混合物称重分别，加到9个无菌的100ml血清瓶中，每瓶10±0.05g。将剩余的经透析的荧光素酶等分装到20个微离心管中，每管20μg，在-80℃保存，以进一步用作标准的荧光素酶。在20℃干燥处理该保存用混合物4.5小时，然后在45℃干燥处理60小时、60℃干燥处理8小时、65℃干燥处理16.5小时。然后各份样品瓶在真空中加上塞。将这些瓶子转移到干燥的房间中(环境相对湿度～14％)。再将各瓶子开启，将其中的泡沫刮到无菌的研磨瓶中，将泡沫磨碎，再将所得的粉末称重加到无菌小瓶中，每瓶1.07-1.11g。然后在各瓶中加入2ml全氟萘烷(Aldrich#p-990-0)，并在干燥环境空气中塞上瓶塞，然后转移到37℃的恒温箱中。

将荧光素酶检测试剂和含有1mg/ml BSA的PBS放在室温(RT)下使之平衡至少30分钟。将9.42ml含有1mg/ml的BSA的PBS加到研磨好的样品(1μg/ml)中，然后搅拌混和。使用此溶液1μg/ml按10倍系数制备系列稀释液，得到最终浓度为1×10^-5μg/ml。混合100μl室温(RT)荧光素酶检测试剂和20μl稀释的荧光素酶，制备反应混合物。将该反应混合物放到光度计中，每10秒钟测量所产生的光，共测1分钟。以每秒钟的相对光单位(RLU/s)对相对酶浓度(μg/ml)作曲线图。

每次测量在全氟萘烷中的研磨的荧光素酶样品的同时，要测量标准的荧光素酶样品作为对照。首先用10ml荧光素酶检测缓冲液溶解1瓶荧光素酶检测物质，使其在室温下平衡至少30分钟，进行标准荧光素酶检测。制备混合100μl室温(RT)荧光素酶检测试剂和20μl稀释的荧光素酶，制备反应混合物。将该反应混合物放到光度计中，每10秒钟测量所产生的光，共测1分钟。以每秒钟的相对光单位(RLU/s)对相对酶浓度(μg/ml)作曲线图。然后比较过氟十氢萘中的研磨的荧光素酶与标准荧光素酶的活性。结果显示在图6中。

实施例11——使用对嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)特定的标准方法在两升容量的发酵罐中培育该菌菌株。该发酵罐细胞的群落计数为8.10.73×10⁸。离心收集细胞，得到200ml群落数为7.830.75×10⁹的细胞富集体。将该细胞富集体稀释在由800ml的40％蔗糖、10％甲基α-d-吡喃葡糖苷在50％缓冲液(w/w)中的溶液组成的保存用溶液中。将所得的混合物300ml注入聚乙烯Petri培养皿袋中。余下部分保存起来，另有他用。用位于由铝架支持的4.5×19英寸圆柱形玻璃小室内的夹具夹住空的聚乙烯袋。此玻璃室用作进行泡沫形成保存法过程的大批量干燥处理用小室。借助于聚硅酮管的长度，将测试溶液充填到该聚乙烯袋中。也可沿着整个管的长度给该玻璃室外部安装一层玻璃的水夹套。该夹套与再循环的可控温度的水浴器相连接。该水夹套可在操作过程提供热源。该玻璃室在流出端连接到冻干机的冷凝器上。在通过形成泡沫而实现保存的方法结束时，加入干燥氮气解除真空状态。取出该袋子进行检测。可清楚看到其中已产生了干燥的、力学上稳定的易碎的泡沫。用手轻轻揉压该材料，就可将其压碎成具有沙子质感的碎粒。割开该袋子，将其中的内容物转移到干净的容器中。分3次抽取该容器中的样品。然后将干燥氮气吹入该容器中，将其密封。培育该样品，并将所得的细胞群落与采用相同的方法在10ml小瓶中经泡沫干燥的1ml的干燥嗜酸乳杆菌的对照培养物进行比较。证明受测试细菌菌株的存活情况的结果列在表10中。

                                              表10

样品来源	平均平板计数	平板计数的标准偏差	检测量(g)	稀释体积(ml)	活性(胞/g)	每份样品的平均值	生存能力∶与对照瓶相比％
								A袋	1.21E+09	0.91E+07	0.2415	2.4	1.21E+09	1.12E+09	92.50
A袋	1.09E+09	1.05E+08	0.3366	3.4	1.09E+09		83.10
								A袋	1.07E+09	1.07E+08	0.1848	1.8	1.07E+09		81.32

对于本领域的熟练技术人员来说，根据本文所述的本发明的一系列技术对本发明各项实施方式按上述模式进行的修改是显而易见的。上述各实施例并不具有约束性，而仅仅是作为本发明的范例，其范围须由下述的权利要求予以限定。

Claims (54)

1.一种保存用混合物，它含有：

在干燥和在环境温度或更高温度下贮存过程中对生存能力的丧失敏感的病毒、细菌或其它细胞；

非还原性的甲基化单糖；和

从非还原性二糖、非还原性寡糖、二糖的非还原性衍生物、寡糖的非还原性衍生物、蛋白质、高分子保护剂和谷氨酸钠(MSG)中选出的至少一种补充保护剂。

2.如权利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，该保存用混合物具有总的溶质质量，并且所述非还原性甲基化单糖约占该总溶质质量的5-80wt％。

3.如权利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述非还原性甲基化单糖约占该总溶质质量的20-60wt％。

4.如权利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述非还原性甲基化单糖是甲基(α或β)-d-葡萄糖。

5.如权利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述非还原性二糖是蔗糖或海藻糖。

6.如权利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述蛋白质选自明胶、白蛋白、乳清白蛋白或球蛋白和应激蛋白。

7.如权利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述高分子保护剂是HES、PVP、环糊精和PEG。

8.如权利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述蛋白质可以是在温度约大于50℃、pH约高于9或约小于5的水性介质中稳定的任何蛋白质。

9.如权利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述蛋白质的浓度约大于3wt％。

10.如权利要求9所述的保存用混合物，其特征在于，所述蛋白质的浓度约大于10wt％。

11.如权利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，该混合物具有总的溶质质量，并且混合物中的MSG约占该总溶质质量的5-80wt％。

12.如权利要求11所述的保存用混合物，其特征在于，所述MSG约占该总溶质质量的20-60wt％。

13.如权利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，该混合物具有总的溶质质量，并且所述非还原性二糖约占该总溶质质量的5-80wt％。

14.如权利要求13所述的保存用混合物，其特征在于，所述非还原性二糖约占该总溶质质量的20-60wt％。

15.如权利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，该混合物具有总的溶质质量，并且所述非还原性寡糖约占该总溶质质量的5-80wt％。

16.如权利要求15所述的保存用混合物，其特征在于，所述非还原性寡糖约占该总溶质质量的20-60wt％。

17.如权利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述寡糖不是棉子糖。

18.如权利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，配制的该混合物在干燥和随后的至少两周的贮存期间不结晶。

19.一种保存在干燥和在环境温度或更高的温度下贮存过程中对生存能力的丧失具有敏感性的病毒、细菌或其它细胞的方法，它包括：

将病毒、细菌或其它细胞与保护剂混合，形成保存用混合物，所述保护剂含有非还原性甲基化的单糖和从非还原性二糖、非还原性寡糖、二糖的非还原性衍生物、寡糖的非还原性衍生物、蛋白质、高分子保护剂和谷氨酸钠(MSG)中选出的至少一种补充化合物；

然后干燥该保存用混合物，其中，在干燥处理和随后的在环境温度或较高贮存温度下保存过程中，所述病毒、细菌或其它细胞至少保留了一部分生存能力。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述病毒、细菌或其它细胞还含有疫苗或载体。

21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述甲基化单糖是甲基(α或β)-d-葡萄糖。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述干燥方法包括冻干、晾干、喷雾干燥、流化床干燥、真空干燥、在干燥气体中干燥和发泡干燥。

23.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述保存用混合物具有总的溶质质量，所述非还原性单糖约占该总溶质质量的5-80wt％。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述非还原性甲基化单糖约占该总溶质质量的20-60wt％。

25.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述非还原性二糖是蔗糖或海藻糖。

26.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述蛋白质选自明胶、白蛋白、乳清白蛋白或球蛋白和应激蛋白。

27.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述高分子保护剂是HES、PVP、环糊精和PEG。

28.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述蛋白质可以是在温度约大于50℃、pH约大于9或约小于5的水性介质中保持稳定的任何蛋白质。

29.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述蛋白质的浓度约大于3wt％。

30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述蛋白质的浓度约大于10wt％。

31.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述保存用混合物具有总的溶质质量，所述MSG约占该总溶质质量的5-80wt％。

32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述MSG约占该总的溶质质量的20-60wt％。

33.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述保存用混合物具有总的溶质质量，所述非还原性二糖约占该总溶质质量的5-80wt％。

34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述非还原性二糖约占该总的溶质质量的20-60％。

35.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述保存用混合物具有总的溶质质量，所述非还原性寡糖约占该总溶质质量的5-80wt％。

36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述非还原性寡糖约占该总的溶质质量的20-60wt％。

37.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述寡糖不是棉子糖。

38.如权利要求19所述的方法，其特征在于，配制的所述保存用混合物在干燥和随后的至少两周的贮存期间不结晶。

39.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述至少一种补充化合物是蔗糖，并且蔗糖与甲基(α或β)-d-葡萄糖的比例约为4∶1到1∶2。

40.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述至少一种补充化合物包括蔗糖和MSG，并且蔗糖与MSG的比例约为10∶1到1∶4。

41.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述混合处理还包括至少两个步骤，包括将病毒、细菌或其它细胞加载到非还原性甲基化单糖中，然后加入至少一种补充化合物，形成保存用混合物。

42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，使病毒、细菌或其它细胞在含有非还原性甲基化单糖的溶液中保持平衡而实现所述加载操作。

43.(新)如权利要求19所述的方法，其特征在于，该方法还包括第二次干燥处理步骤。

44.(新)如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述第二次干燥处理是在0-100℃的温度范围内进行。

45.(新)如权利要求44所述的方法，其特征在于，持续进行所述第二次干燥处理，直到玻璃化转变温度升高到所选定的0-70℃温度范围内的贮存温度之上。

46.(新)如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述干燥步骤包括在真空中沸腾，形成稳定的泡沫。

47.(新)如权利要求46所述的方法，其特征在于，该方法还包括将所述稳定泡沫研磨成粉末的步骤。

48.(新)如权利要求47所述的方法，其特征在于，该方法还包括第二次干燥处理所述粉末的步骤。

49.(新)一种对在干燥和在环境温度或更高的温度下贮存期间的生存能力的丧失敏感的病毒、细菌或其它细胞的保存方法，它包括：

将病毒、细菌或其它细胞与保护剂混合，形成保存用混合物，所述保护剂含有非还原性单糖和从非还原性二糖、非还原性寡糖、二糖的非还原性衍生物、寡糖的非还原性衍生物、蛋白质、高分子保护剂和谷氨酸钠(MSG)中选出的至少一种补充化合物；

该保存用混合物在真空中沸腾形成稳定的泡沫从而干燥，其中，在干燥处理和随后的在环境温度或较高温度下贮存期间，所述病毒、细菌或其它细胞至少保留了一部分生存能力。

50.(新)如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述非还原性单糖是甲基化单糖。

51.(新)如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述甲基化单糖是甲基(α或β)-d-葡萄糖。

52.(新)如权利要求49所述的方法，其特征在于，该方法还包括在进行沸腾处理之前，对部分冷冻状态进行蒸发，从而浓缩所述病毒、细菌或其它细胞的步骤。

53.(新)如权利要求49所述的方法，其特征在于，该方法还包括在进行沸腾处理之前，采用反渗透法浓缩所述病毒、细菌或其它细胞的步骤。

54.(新)如权利要求49所述的方法，其特征在于，该方法还包括在0-100℃温度范围内对所述稳定性泡沫进行第二次干燥处理的步骤。

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