CZ20021835A3 - Ochranná směs a způsob ochrany viru, bakterie a jiné buňky citlivé na ztrátu ľivotaschopnosti během suąení a skladování - Google Patents
Ochranná směs a způsob ochrany viru, bakterie a jiné buňky citlivé na ztrátu ľivotaschopnosti během suąení a skladování Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20021835A3 CZ20021835A3 CZ20021835A CZ20021835A CZ20021835A3 CZ 20021835 A3 CZ20021835 A3 CZ 20021835A3 CZ 20021835 A CZ20021835 A CZ 20021835A CZ 20021835 A CZ20021835 A CZ 20021835A CZ 20021835 A3 CZ20021835 A3 CZ 20021835A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- reducing
- weight
- drying
- solute
- preservative
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 95
- 238000001035 drying Methods 0.000 title claims abstract description 94
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 89
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 88
- 238000003860 storage Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 22
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 title claims description 52
- 230000035899 viability Effects 0.000 title claims description 16
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 65
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 claims description 65
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 59
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 59
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 56
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 50
- 239000006260 foam Substances 0.000 claims description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 30
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 20
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 18
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 18
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 16
- 150000002840 non-reducing disaccharides Chemical class 0.000 claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 14
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 13
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 11
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 10
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims description 9
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 8
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 claims description 7
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000010411 cooking Methods 0.000 claims description 7
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 claims description 7
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 6
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 claims description 5
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 4
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims description 3
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 claims description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 2
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 claims description 2
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- UVZZAUIWJCQWEO-DFWYDOINSA-N (2s)-2-aminopentanedioic acid;sodium Chemical compound [Na].OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UVZZAUIWJCQWEO-DFWYDOINSA-N 0.000 claims 3
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 claims 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 47
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 abstract description 20
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 abstract description 20
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 abstract description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 62
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 29
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 24
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 19
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 18
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 16
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 16
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 16
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 14
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- 241000711895 Bovine orthopneumovirus Species 0.000 description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 13
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 12
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 12
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 12
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 9
- HOVAGTYPODGVJG-ZFYZTMLRSA-N methyl alpha-D-glucopyranoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HOVAGTYPODGVJG-ZFYZTMLRSA-N 0.000 description 9
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 9
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 8
- HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N methyl beta-galactoside Natural products COC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 6
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 150000002771 monosaccharide derivatives Chemical class 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 5
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 5
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 5
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 4
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 4
- ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N isocitric acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 235000021309 simple sugar Nutrition 0.000 description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000724565 Chorella virus Species 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000194048 Streptococcus equi Species 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 3
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 3
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 3
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 3
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 3
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 3
- SERLAGPUMNYUCK-DCUALPFSSA-N 1-O-alpha-D-glucopyranosyl-D-mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SERLAGPUMNYUCK-DCUALPFSSA-N 0.000 description 2
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 description 2
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- ZAQJHHRNXZUBTE-WUJLRWPWSA-N D-xylulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 208000007976 Ketosis Diseases 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 2
- PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N bvdv Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CN=CN1 PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- NNBZCPXTIHJBJL-UHFFFAOYSA-N decalin Chemical compound C1CCCC2CCCCC21 NNBZCPXTIHJBJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 2
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000000905 isomalt Substances 0.000 description 2
- 235000010439 isomalt Nutrition 0.000 description 2
- HPIGCVXMBGOWTF-UHFFFAOYSA-N isomaltol Natural products CC(=O)C=1OC=CC=1O HPIGCVXMBGOWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002584 ketoses Chemical class 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000845 maltitol Substances 0.000 description 2
- 235000010449 maltitol Nutrition 0.000 description 2
- VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N maltitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N 0.000 description 2
- 229940035436 maltitol Drugs 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229950011087 perflunafene Drugs 0.000 description 2
- UWEYRJFJVCLAGH-IJWZVTFUSA-N perfluorodecalin Chemical compound FC1(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)[C@@]2(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)[C@@]21F UWEYRJFJVCLAGH-IJWZVTFUSA-N 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000701083 Bovine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N D-ribulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N D-threo-2-Pentulose Natural products OCC(O)C(O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006927 Foeniculum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000004204 Foeniculum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 1
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 231100000645 Reed–Muench method Toxicity 0.000 description 1
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101000775071 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Peroxiredoxin AHP1 Proteins 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical class [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone Chemical compound OCC(=O)CO RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- UQPHVQVXLPRNCX-UHFFFAOYSA-N erythrulose Chemical compound OCC(O)C(=O)CO UQPHVQVXLPRNCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000006377 glucose transport Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002306 glutamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004890 malting Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- PXXNTAGJWPJAGM-UHFFFAOYSA-N vertaline Natural products C1C2C=3C=C(OC)C(OC)=CC=3OC(C=C3)=CC=C3CCC(=O)OC1CC1N2CCCC1 PXXNTAGJWPJAGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000273 veterinary drug Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Ochranná směs a způsob ochrany viru, bakterie a jiné buňky citlivé na ztrátu životaschopnosti během sušeni a skladování
Oblast tecímiky
Tento vynález se týká prostředků a způsobů pro ochranu citlivých biologických látek, virů, bakterií a eukaryotických buněk při sušení Zvláště pak se tento vynález týká ochrany směsí obsahujících viry nebo buňky a ochranných látek, v nichž jsou směsi přizpůsobeny ke stabilizaci těchto vzorků během dehydratace a následného skladování při teplotě okolí nebo vyšších teplotách.
Dosavadní stav tecímiky
Citlivé biomolekuly, viry, bakterie, vektory, eukaiyotické buňky a malé zkušební vzorky mají široký rozsah použití, což zahrnuje například jak oblast humánních a veterinárních léčiv, imunizaci a očkovací látky, molekulární biologii, genovou terapii, stejně tak i oblast potravinářského průmyslu.Typicky jsou tyto biologické materiály, viry a buňky aktivní ve vodných prostředích, tudíž běžné složení takových vzorků je ve vodných roztocích. Nicméně mnoho bioaktivních materiálů, zejména virů a buněk, je citlivých k degradaci a ztrátě aktivity a/nebo životaschopnosti právě ve vodných roztocích, zvláště v prostředí vyšších teplot. Proto takové vzorky často vyžadují zmrazení nebo pouze krátké skladování za podmínek okolí.
Bioaktivní materiály, viry a buňky mohou být poškozeny působením mnoha chemických mechanizmů známých v oboru. Voda je reaktantem téměř ve všech těchto destruktivních cestách. Navíc, voda působí též jako zvláčňovadlo, které umožňuje odhalení a agregaci proteinů. Jestliže je voda účastníkem téměř všech degradačních pochodů, snížení obsahu vody ve vodných roztocích nebo suspenzích bioaktivních materiálů, virů a buněk až do foímy suchého prášku zajišťuje možné vytvoření metodologie pro zlepšení stability takových vzorků. Viry a buňky mohou být sušeny za použití různých technik, zahrnujících lyofilizaci, pěnové sušení, sušení rozprašováním a sušení odpařováním v sušárně. Vodné roztoky biomolekul, virů a buněk jsou usušeny a skladovány ve formě suchých prášků až do požadované doby použití.
Kromě dehydratace představuje další významný příspěvek k ochraně (stabilizaci) citlivých biomolekul, virů a buněk vitrifíkaee (zeskelnění). Vitrifíkace může být dosaženo jak v suchém stavu při teplotě okolí, tak i ve vodném prostředí za kryogenních podmínek (mražením). Stabilita při teplotě okolí v suchém stavuje velmi žádoucí z mnoiia důvodů, k nimž patří výhody a ekonomické skladování, transport, flexibilita volby možností doručení, použitelnost v naléhavých situacích a dostupnost pro země třetího světa. Proto je vitrifikaee biomolekul, virů a buněk v suchém stavu zvláště žádána. Nicméně sušení nechráněných biomolekul, virů a buněk, jako je mražení takových vzorků, může být velmi škodlivé. Z toho důvodu zde vzniká potřeba vyvinout ochranné směsi, v nichž mohou být biomolekuly, viry a buňky dehydratovány s minimmální ztrátou své aktivity a životaschopnosti.
Důležité poznatky z oboru ochrany citlivých biologických materiálů v suchém stavu jsou uvedeny například v WO 9 927 071 A, DE 1 792 196 A, WO 9 118 091, GB 799 644 a US patentu ě. 5 290 765.
Podstata vynálezu
Tento vynález se týká ochranné směsi obsahující biologickou látku, která je citlivá z hlediska ztráty aktivity nebo životaschopnosti v průběhu sušení a skladování při teplotě okolí nebo při vyšších teplotách, neredukující derivát monosacharidu a alespoň jeden přídavný ochranný prostředek vybraný ze skupiny obsahující neredukující disacharidy, neredukující oligosacaridy, neredukující deriváty disacharidů, neredukující deriváty oligosacharidů, proteiny, polymerické ochranné látky a sodnou sůl kyseliny glulamové (monosodium salt of glutamic acid - MSG).
Nej vhodnější je, aby biologická látka v ochranné směsi byla vybrána ze skupiny obsahující citlivé biologické molekuly, viry, bakterie, jiné prokaryotické buňky a též eukaryotické buňky.
Ochranná směs má formu látky rozpuštěné v celém množství. Při jednom způsobu tvoří například modifikovaný neredukující derivát monosacharidu asi mezi 5 a 80 hmotnostními % z celkového množství rozpuštěné látky. Ještě lépe, je-li koncentrace modifikovaného neredukujícflio derivátu monosacharidu asi mezi 20 a 60 limotnostními % celkového množství rozpuštěné látky.
Podle jednoho preferovaného způsobu tohoto vynálezu je ochranná směs methylovaný monosacharid. Zvláště vhodné je, je-li methyíovaným monosacharidem methyl α-glukopyranosid nebo methyl β-glukopyranosid.
Tam, kde ochranná směs obsahuje neredukující disacharid, může tímto disacharidem být sacharóza nebo trehalóza. Protein obsažený v ochranné směsi může být vybrán ze skupiny obsahující želatinu, albumin, pšeničný albumin nebo globulin a stresový protein. Podle jednoho způsobu může být tímto proteinem jakýkoli protein, který je stabilní při vyšší teplotě než asi 50 °C a při pH vyšším než asi 9 nebo nižším než asi 5. Nejlépe, je-li koncentrace proteinu vyšší než asi 3 lunotnostní %, ještě lépe vyšší než asi 10 hmotnostních %.. Polymerická ochranná látka použitá podle jednoho způsobu tohoto vynálezu může být vybrána ze skupiny obsahující HES, PVP, cyklodextrin a PEG.
Tam, kde jsou v ochranné směsi obsaženy MSG, neredukující disacharidy a/nebo neredukující oligosacharidy mohou být obsaženy v koncentraci asi mezi 5 a 80 hmotnostními % celkového množství rozpuštěné látky, nejlépe asi mezi 20 a 60 hmotnostními % celkového množství rozpuštěné látky. V případě, že jsou v ochranné směsi použity oligosacharidy, nejlépe, podle jednoho z provedení tohoto vynálezu, aby nebyla použita rafínóza.
• ·
Nejlépe, aby ocliratwiá směs byla připravena tak, aby nekrysíalizovala během sušení a následného skladování, alespoň po dobu dvou týdnů.
Preferované přípravky obsahují: poměr sacharózy k methyl (a nebo β) glukózy je asi mezi 4:1 a asi 1:2 a poměr sacharózy k MSG je asi mezi 10:1 a asi 1:4.
Tento vynález se též týká způsobu ochrany biologických látek, které jsou citlivé ke ztrátě aktivity nebo životaschopnosti během sušení a skladování při teplotě okolí nebo při vyšších teplotách. Způsoby zahrnují míchání biologické látky s ochranným prostředkem obsahujícím modifikovaný neredukující derivát monosacharidu a alespoň jednu přídavnou sloučeninu vybranou ze skupiny sestávající z neredukujícíeh disacharidů, neredukujících oligosaeharidů,neredukujících derivátů disacharidů, neredukujících derivátů oligosacharidů, z proteinů, polymerickýeh ochranných látek a sodné soli kyseliny glutamové (MSG), přičemž dojde k vytvoření ochranné směsi (jak je podrobně uvedeno výše) a sušení ochranné směsi, kde je alespoň část aktivity nebo životaschopnosti biologické látky zachována během procesu sušení a během následného skladování při teplotě okolí nebo při vyšších skladovacích teplotách. Tento způsob je vhodný pro ochranu virů, bakterií nebo prokaryotických či eukaiyotických buněk.
Uvedený způsob je použitelný pro různé typy receptur sušení zahrnuj ící lyofilizaci, sušení v sušárně, sušení rozprašováním, sušení ve fluidním loži, sušení ve vakuu, sušení v suché atmosféře a pěnové sušení.
Dále zahrnuje míchání ve variantách uvedených způsobů alespoň dva kroky obsahující dávkování viru nebo buňky s neredukujícím derivátem monosacharidu a pak přídavku alespoň jedné přídavné sloučeniny za účelem vytvoření ochranné směsi. Dávkování může být dosaženo vyvážením biologické látky v roztoku obsahujícím neredukujíeí derivát monosacharidu.
• ·
A. Definice
Tennín chemická stabilita a/nebo ochrana, jak je zde použit, znamená, že degradace biologického materiálu chemickými cestami jako jsou například oxidace, hydrolýza nebo působení enzymů, nepřevyšuje přijatelnou úroveň. Jinými slovy, musí být zachována alespoň úroveň biologické aktivity nebo životaschopnosti postačující pro komerční využití materiálu. V preferovaných způsobech tohoto vynálezu je přípravek považován za ochráněný, pokud je zachováno alespoň 20 % jeho biologické aktivity nebo životaschopnosti po rehydrataci následující po skladování při 37 °C po dobu jednoho týdne.
Tennín citlivá biologická látka zahrnuje peptidy, polypeptidy, proteiny, enzymy a koenzymy, séra, vitamíny, protilátky a fragmenty protilátek. V těchto termínech jsou zahrnuty jak skupiny látek získaných a purifikovaných z přírodních zdrojů, tak i ty, které jsou připraveny rekombinantním způsobem. Tento tennín zahrnuje též lipoproteiny a polranslační modifikované fonny, například glykosylované proteiny. V tomto termínu jsou též zahrnuty analogy, deriváty, agonisté, antagonisté a farmaceuticky přijatelné sole z těchto výše uvedených látek. Tennín též obsahuje modifikované, derivatizované nebo nepřírodní cestou získané peptidy, které mají D- nebo L- konfiguraci aminokyselin.
V preferovaném způsobu podle tohoto vynálezu biologická látka zahrnuje jakoukoli antigenní substanci, která je schopna vzbudit imunitní odpověď. Přesněji, antigenem může být protein nebojeho fragment exprimovaný na extracelulámí doméně tumoru (např. pro léčení rakoviny), alergen nebo infekční agens jeho části (např virus nebo bakterie). Tennín vakcína se týká zvláštního typu imunizace, při němž je biologickým materiálem infekční agens (nebo kterákoli jeho část), které je podáváno savcům za účelem vytvoření odolnosti vůči infekční chorobě způsobené tímto agens. Vakcína může obsahovat viry, bakterie a parazity, virové částice a/nebo jakoukoli část viru nebo · · · • ·000 agens infekční choroby nebo patogenu, včetně proteinů a/nebo nukleových kyselin, které mohou být imunogenní a proto vhodné pro výrobu vakeín.
V dalším aspektu tento vynález obsahuje vektory získané z virů, bakterií a kvasinek vhodné pro transformaci buněk. Takové vektory rnouhou být využity stejně dobře pro genovou terapii, jakož i molekulární biologii a genetické inženýrství. Podle mnoha preferovaných hledisek termín citlivá biologická látka zahrnuje též jakékoli viry, prokaryotieké a eukatyoíické buňky, stejně tak i určité malé mnohobuněčné organismy.
Fráze ochrana pěnovým přípravkem se týká dobře měřitelného způsobu sušení citlivých biologických látek vařením ve vakuu za podmínek, při nichž zůstává zachována aktivita a životaschopnost biologické látky po prodloužené časové období při teplotě okolí nebo při vyšších teplotách. Specifická metodická omezení obsažená ve frázi ochrana pěnovým přípra vkem jsou podrobně popsána níže ve dvou částech: 1) Základní pěnové sušení a 2) Stabilita sušení/vitrifikace a jsou uvedena v US patentu č. 5 766 520, Bronshtein.
Termín modifikované neredukující monosacharidy je použit dle tohoto vynálezu za úěelem vyjádření obecné třídy sacharidů. Modifikací mohou být jakékoli známé chemické modifikace, přičemž jsou preferovány methylované, eťhylované a chlorované deriváty. Methylové deriváty zahrnují jak a tak i β formy monosaeharidů. Proto je též používán termín methyl (a nebo β) glukóza. V několika příkladech je použit jeden zvláštní modifikovaný neredukující monosacharid methyl α-d-glukopyranosid; tato sloučenina je uváděna pod zkratkou MAG.
B. Ochrana biologických materiálů
Dehydratace biologických vzorků při zvýšené teplotě může být velmi ničivá, zvláště například, je-li teplota použitá při sušení vyšší než použitelná denaturační teplota proteinu. Za účelem ochrany vzorků před poškozením způsobeným zvýšenou teplotou může být dehydratační proces uspořádán do ·* ···· • * · » · · ·· ♦ ·♦ · íl í ···♦· · · · ♦ • ft »· ···· ···· ftft kroků nebo při současném zvyšování teploty v závislosti na rozsahu dehydratace. Počáteční dehydratace by měla být vedena při teplotách, které jsou dostatečně nízké na to, aby byla umožněna dehydratace bez ztrát biologické aktivity. Ochranné způsoby použité podle tohoto vynálezu jsou uvedeny v US patentu č. 5 766 520, Bronshtein a v současně podaných dosud nevyřízených přihláškách US patentů č. 08/979 458 a 09/306 137, 09/589 381, 09/194 499 a v dosud nevyřízených prozatímních US přihláškách vynálezů č. 60/149 795, 60/166 928 a 60/161 204; krom toho, jsou objevy zde v celém svém rozsahu uvedené v odkazech.
V preferovaném způsobu podle tohoto vynálezu může být zachování biologické aktivity nebo životaschopnosti maximalizováno v průběhu dehydratace virů nebo buněk výběrem parametrů sušení založeném na následujících kritériích: 1) ochrana vnitřních a vnějších molekul, obalů, membrán a dalších biologických struktur je optimalizována dávkováním virů nebo buněk s ochrannou chemikálií, 2) dávkování může být dosaženo vyvážením virů nebo buněk v dávkovačích roztocích obsahujících prostupující ochranné látky, 3) Teplota zesklovatění (Tg- glass transition temperature) u virů nebo buněk dávkovaných s ochrannými látkami byla raději zvýšena nad požadovanou sladovací teplotu okolí a/nebo dodací teploty a 4) směs virů nebo buněk a ochranných přípravků raději zůstává během sušení a následného skladování v amor&ím stavu.
Ochranné přípravky
V oboru je známo mnoho druhů polyolů a polymerů, které mohou sloužit jako ochranné látky pokud zvyšují schopnost biologicky aktivních materiálů snášet sušení a skladování a neruší zvláštní biologickou aktivitu. Samozřejmě, že molekuly ochranné látky zajišťují během odíraný i jiné výhody kromě stabilizace biologických materiálů během sušen (viz infra, jako je pomoc při vytváření mechanicky stabilní pěny). Podrobněji, ochranné látky podle tohoto vynálezu mohou obsahovat jednoduché cukry jako je sacharóza, glukóza, « ·
9* ···· ♦·· ···· » · 9 ·· 999« mallóza, xylulóza, ribóza, mannóza, fruktóza, rafinóza a trehaíóza, neredukující deriváty monosaeharidů a jiné uhlovodíkové deriváty, alkoholické cukry jako je sorbitol, syntetické polymery jako je polyethylenglykol, hydroxyethylovaný škrob, polyvinylpyrrolidon, polyaktylatnid polyethy lenamin a cukerné kopolymery jako Ficoll a dextran a jejich kombinace, přičemž výčet těchto látek není nikterak limitován. Jako ochranné látky mohou též sloužit vysoce rozpustné proteiny s nízkou molekulární hmotností. V jedné z variant podle tohoto vynálezu, kde je prováděna ochrana buněk, virů, virových a nevirových vektorů, mohou být ochranným prostředkem následující složené směsi tiízkomolekulárního cukru, disacharidu, oligosacharidu a polymeru obsahujícího biologický polymer. Nízkomolekulární cukr je používán za tím účelem, aby pronikl a chránil intracelulámí struktury během dehydratace. Nízkomolekulární prostupující cukiy mohou být vybrány z mnoha druhů ketóz, které jsou neredukující při neutrálním nebo vyšším pH nebo meíhylovaných či ethylovaných monosaeharidů. Mezi neredukujícími ketózami jsou obsaženy tyto: šestiuhlíkaté cukry sachróza, fruktóza, sorbóza a piskóza, pětiuhlíkaté cukry ribulóza a xylulóza, čtyřuhlíkatý cukr erytrulóza a tříuhiíkatý cukr 1,3-dihydroxydimeťhylketon. Mezi methylovanými monosacharidy jsou alfa a be-tamethylované formy gluko, manno a galakíopyranosidu. Mezi methylovanými pětiuhlíkatými sloučeninami jsou alfa a beta formy arabino a xylopyranosidů. Disacharidy jako sachróza jsou známé svým ochranným účinkem během sušení, protože vracejí hydratovanou vodu na povrch biologických membrán a makromolekul. Navíc, sacharóza a/nebo jiná plnidla mohou být sušením ve vakuu účinně přeměněna na stabilní pěny tvořených tenkými amorfními filmy koncentrovaného cukru.
Kombinace monosaeharidů s disacharidy a oligosacharidy účinně zabraňuje krystalizaci oligosacharidů během dehydratace. Navíc, může být použit polymer ke zvýšení teploty zesklovatění (Tg - glass transition temperature) dehydrované směsi, která může být snížena inkluzí nízkomolekulámích mono-
• · ·· ·©»· sacharidů. Mohou být použity též kterékoliv biologické polymery rozpustilé v koncentrovaných roztocích cukrů. Například polysacharidy jako Ficoll a dextran a syntetické polymery jako hydroxyeťhylovaný škrob, polyethylenglykol, polyvinylpyrrolidon, polyaki y lan iid, stejně tak i vysoce rozpustné přírodní a syntetické biopolymeiy (např. proteiny) pomohou stabilizovat biologické membrány a zvýší Tg.
Schopnost některých cukrů, alkoholických cukrů a aminokyselin jako je glutamát sodný (MSG) chránit biologické látky před poškozením v průběhu sušení a následného skladování je známa. Je zde uvedeno několik publikací ukazujících silný ochranný účinek disacharidů jako jsou sacharóza nebo írelialóza na biomolekuly a membrány. Někteří badatelé používají složitější směsi obsahující monosacharidy (glukóza, íiuktóza atd.) nebo nízkomolekulámí alkoholické cukry (rnanitoí, sorbitol atd.) za účelem ochrany buněk v průběhu lyofilizace. Na rozdíl od disacharidů, nízkomolekulámí cukry a jejich deriváty pronikají lépe do buněk a zabezpečují tak intracelulární ochranu. Z toho důvodu jsou monosacharidy a nízkomolekulámí alkoholické cukry široce používány do ochranných přípravků při ochraně buněk a virů před poškozením při dehydrataci.
Ochranné roztoky obsahující redukující monosacharidy poškozují citlivé enzymy během skladování po sušení a rozsah tohoto poškození se rychle zvětšuje se zvýšením skladovací teploty (viz níže uvedený příklad 1.) Z toho důvodu se předpokládalo, že redukující monosacharidy by měly být používaný jen v těch případech, kde by byly lyofilizované vzorky skladovány při teplotě nižší než 4 °C. Eventuelně, mají-li být biologické vzorky skladovány při pokojové teplotě nebo vyšší může být ochranný přípravek vybrán tak, aby se minimalizovala redukční síla ochranných látek. V preferovaném způsobu tohoto vynálezu jsou redukující skupiny sacharidů methy lovány, za účelem zvýšení ochranného účinku.Redukující skupiny monosacharidů mohou být též ethy lovány, atd., podle tohoto vynálezu.
·· « · « · * * * <
• * · · ♦ ·· »·»«
- ·· ·· • · · · • · t * · · · • · · ·· ····
Nizkomolekulární uhlovodíkové přídavné látky snižují teplotu zesklovatění (Tg) suspenzí buněk nebo virů v ochranném přípravku. Například Tg bezvodé fruktózy se blíží 7 °C, Tg směsi fruktóza :glukóza (1:1) v bezvodém stavuje trochu pod 40 °C. Glukóza má mnohem vyšší Tg. Z toho důvodu může být použití derivátů glukózy účinnější. Například Tg methy lované glukózy je 29 °C (viz obrázek 4).
Změkěovaeí účinek nízkomolekulámích přídavných látek do ochranných roztoků může být částečně kompenzován použitím rozpustné přídavné látky s vyšší molekulovou hmotností, která zvýší Tg v bezvodém stavu. Podle jednoho z preferovaných provedení tohoto vynálezu obsahuje ochranný přípravek MSG, neredukující oligosaeharid a rozpustný protein. V rozsahu této přihlášky vynálezu budeme teplotu okolí defínovatjako teplotu mezi asi - 20 °C a + 50 °C, aby bylo možné zahrnout co nejvíce praktických použití. Nicméně, přednost je dávána těm způsobům a přípravkům uvedeným v tomto vynálezu, které jsou zaměřeny na ochranu biomolekul, virů a buněk při skladování a doručování při pokojové teplotě (20 - 25 °C ) nebo vyšší.
Neočekávaně účinné při ochraně virů a buněk byly zejména ochranné přípravky obsahující methylované monosacliridy. Například a-methylgiukóza (methyl n-d-glukopyranosid) vykazovala jedinečné ochranné charakteristiky při ochraně citlivých biologických látek při sušení. Může to být způsobeno tím, že methylová skupina je hydrofobnější než zbytek molekuly. Z toho důvodu bude mít methylovaný cukr amfifilní chování, adsorbujíce přednostně hydrofobní oblasti molekuly proteinu, obalí virus a další membránové struktury. Toto chování může částečně vysvětlil ochranný účinek methylované glukózy. Navíc je pravděpodobné, že buňky, které mohou být dávkovány s glukózou, mohou být též dávkovány s α-melhylglukózou za účelem zabezpečení intramolekulámí ochrany, α-methylglukóza je skutečně široce používána při studiu transportu glukózy přes buněčné membrány. Methylované monosacha11 • *·· · ♦· «·»· • · * ♦ • · · ·· * A ♦· ·· ♦ · · · • · t ♦ · · · ·· ···· ridy nebyly dosud v oboru pří ochraně biologických vzorků v suchém slávu používány.
Bohužel, roztoky α-methylgíukózy ve vodě během sušení krystalizují. Z tohoto důvodu by měla být a-methy {glukóza používána společně s jinými plnidly (t.j. sacharóza, trehalóza, maitrin, polyvinylpyrrolidon (PVP), proteiny atd.), aby se minimalizovala krystalizace a-methylglukózy a zvýšila stabilita amorfního stavu během sušení a následného skladování. Například pravděpodobnost krystalizace roztoku sacharóza/a-methylglukóza během sušení závisí na hmotnostním poměru sacharózy a a-methylglukózy, jak je diskutováno a ukázáno v příkladu 3. Kromě toho, bude přídavek aditiv s vyšší molekulovou hmotností k ochranným prostředkům obsahujícím α-methylglukózu, zvyšovat Tg, které může být dosaženo v suchém stavu.
Primární pěnové sušení
Pro usnadnění zpracování ve větším měřítku, zahrnuje ochrana, pěnovým vařením ve va kuu. Krok sušení je proveden při teplotě v rozmezí asi od -15 do 70 °C. V jednom preferovaném provedení je teplota vzorku během kroku základního sušení menší nebo rovna asi 5 °C. Ochrana pěnovými prostředky je zvlášť vhodná při výkonném sušení vzorků větších objemů, před vitrifikací a jako pomoc při přípravě snadno mletých sušených výrobků vhodných pro komerční využití. Jednou z výhod pěnového sušení je, že postup je stupňovatelný. To znamená, že tento postup může být použit pro ochranu jakéhokoli objemu roztoku nebo suspenze obsahující citlivý bioaktivní materiál, počínaje frakcemi o objemu jednoho mililitru (pro analytické a optimalizační postupy, až po objemy stovek litrů (pro výrobu v průmyslovém měřítku). Další podrobnosti o ochraně pěnovými přípravky jsou uvedeny v US patentech ě. 5 7660520 a 6 306 345, Bronshtein.
V obměnách tohoto vynálezu mohou být zředěné biologické vzorky před pěnovým sušením koncentrovány částečným odstraněním vody ve vakuu.
• ·· ·· t · • · • · • · · · · »·* ··*· **· j ♦· 0000 ·♦ »· • ♦ · · • · 0 • 00 # • 0 0 ·· ····
Tento počáteční koncentrační krok může být proveden buď před a nebo po zavedení vzorku do provozní komory, což závisí na vybraném způsobu koncentrace. Tam, kde je třeba zvýšit koncentraci bioiogicky aktivních materiálů, se uvažuje o způsobech použitelných pro počáteční koncentrování, které zahrnují lyofílizaci, odpařování z kapalného či částečně zmrazeného stavu, reverzní osmózu, jiné membránové technologie nebo jakýkoli jiný ze způsobů známých v oboru.
Vzorky jsou umístěny do vakua, aby se během sušení docílilo varu za teploty podstatně nižší nežli 100 °C. Jestliže je použit u roztoků nebo suspenzí obsahující biologický materiál snížený tlak, roztoky nebo suspenze pění během varu a další odstraňování rozpouštědla v průběhu pěnění způsobuje konečnou produkci mechanicky stabilní open-cell nebo closed-cellů porézní pěny .Mechanicky stabilní porézní struktura nebo pěna obsahuje tenký amorfní film koncentrovaných plnidcl.
Nej vhodnější vakuum pro krok vaření je 0 až 10 torů a to nejlépe okolo 4 torů. Vaření v této souvislosti znamená nukleaci a růst bublin obsahujících vodní páru, nikoli vzduch nebo plyny. Ve skutečnosti v některých roztocíeh může být výhodné pročistit rozpuštěné plyny použitím mírného vakua (okolo 0,1 až 0,9 atm) při pokojové teplotě. Takovéto odplynování může pomoci zabránit roztoku vypěnit ze sušíeí nádoby.
Stabilita sušení/vitrifikace Mechanicky stabilní pěna vytvořená během primárního sušení může vydržet sekundární nebo stálé sušení při zvýšených teplotách. Pokud teplota zesklovatění (Tg) závisí na obsahu vody, ve vzoru a jestliže Tg stoupá se zvyšující se dehydratací, mohou být použity rozdílné protokoly stability sušení v závislosti na požadované skladovací teplotě, za účelem vytvoření Tg souhlasné s vitrifikací (t.j. vytvoření pevného amorhiího skla) při ochlazení na tuto skladovací teplotu. Nicméně, protože dehydratace materiálů je prakticky nemožná, pokud se materiály již jednou dostaly do sklovitého stavuje vitrifikace podle tohoto *· ·»»♦ .: .··, z·.··»;
: .· · · · : .····♦ ♦ ·» ·*·· ·♦ ·· • * · · • · 0 • · · 0 • · 0 ♦ · ♦··· vynálezu, kde mohou být požadovány okolní skladovací teploty, prováděna pomocí stabilního sušení při teplotě výrazně vyšší nežli teplota okolí
Nej vhodnější hlavní skladovací teploty se pohybují v rozmezí 0 až 70 °C. Ještě vhodnější je-li běžný výběr skladovacích teplot vyšší nebo roven 0, 20, 40 a 50 °C. V některých případech, tam, kde je vhodnější skladování ve zmrazeném stavu, může být stabilní sušení provedeno při pokojové teplotě, pak následuje ochlazení na skladovací teplotu nebo nižší V jiných případech, kde je požadována stabilita při pokojové teplotě, by měla být použita dehydratace při teplotě vyšší než je pokojová teplota, následována ochlazením na pokojovou
Pro jakýkoli daný vzorek, klety má být chráněn, budou stanoveny podle charakteristik vlastností a stability maximální teploty, které může snést během kroku primárního sušení V případě ochrany enzymů bylo ukázáno, že po primárním sušení při pokojové teplotě může být teplota stabilního sušení zvýšena až na 50 °C bez ztráty aktivity. Pak může proces dehydratace pokračovat během stabilního sušení při teplotě vyšší. Plynulým zvyšováním nebo postupným zvyšováním dehydrataění teploty v krocích mohou být labilní proteiny převedeny do sta vu termální stability při teplotách dosti nad jejich denaturaění teplotou.
Kromě provedení stabilního sušení při teplotě nad vybranou skladovací teplotou je rozhodující že toto sušení je prováděno po dobu Času potřebného ke skutečnému zvýšení Tg nad skladovací teplotu. Na základě empirických výsledků získaných se sušenými 10 mikroliírovými kapkami roztoku 15 % sacharózy s 15 % rafinózy bylo ukázáno, že zvýšení Tg nad 25 °C vyžadovalo více než 12 hodin stabilního sušení při teplotách nad 70 °C. Primární sušení v těchto experimentech probíhalo po dobu 12 hod při teplotě místnosti (20 °C). Výsledky nasvědčují, že prodloužené stabilní časy sušení (více než 12 hod při 70 °C a více nežóO hodin při 50 °C) mohou nezbytné k provedení zvýšení Tg nad teplotu místnosti. Pro některé biologické materiály, které nejsou termoia14 ·· »*·· • <* • · « * * · · • * · ·· ·« • * * · • · · • » ♦ » • · · ·· ··*» biblí, byl, při zvýšených teplotách, stabilní čas sušení potřebný ke zvýšení Tg nad vybranou skladovací teplotu zkrácen.
V jednom provedení tohoto vynálezu je pěna ochlazena z teploty stabilního sušení na teplotu mletí, umleta a pak je prášek podroben dalšímu sušení buď pod vakuem nebo při atmosférickém tlaku. Následné teploty sušení mohou být v rozmezí asi 0 až 100 °C. Takovéto sušení může pokračovat, dokud teplota zesklovatění nestoupne nad vybranou skladovací teplotu v rozmezí asi 0 až 70 °C.
Aby se zaručilo, že Tg je skutečně vyšší než skladovací teplota, jsou známé alespoň dva způsoby určení Tgpotnoeí terrnábií analýzy. Nejběžnější používanou technikou je diferenciální rastrovací kalorimetrie (DSC). Přesto však bylo zjištěno, že DSC mohou být nespolehlivé pro měření Tg u vzorků obsahujících polymery. Pro analýzu polymerů jsou alternativně zvlášť vhodné metody termálně stimulované polarizace (TSP). Technika TSP je nevhodnější, protože je spolehlivá pro všechny vzorky, ačkoli vyžaduje trochu větší objemy.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1A ukazuje vliv redukujících a neredukujícíeh cukrů na aktivitu isoeitrátdehydrogenázy (ICDH) během skladování při teplotě místnosti. Obrázek 1B ukazuje účinek redukujících a neredukujícíeh cukrů na aktivitu ICDH během skladování při teplotě 37 °C.
Obrázek 2 ukazuje vliv redukujících a neredukujícíeh cukrů na aktivitu ICDH během skladování při teplotě 50 °C.
Obrázek 3 ukazuje vliv neredukujícíeh cukrů a rnaltrinu na aktivitu ICDH během skladování při teplotě 50 °C.
Obrázek 4 ukazuje teplotu zesklovatění methylované glukózy.
• · ·· «
*·· *··· »9
Μ · «4 • · 4 • · • 4 • · • Μ «
Obrázek 5 ukazuje vliv me(hyla-d-glukopyranosidu na ochranu Streploeoccus equi.
Obrázek 6 ukazuje zvýšenou aktivitu iueiferázy v perfluorodekalinu během skladování při teplotě 37 °C,
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady ukazují různé charakteristické stránky tohoto vynálezu týkající se ochrany směsí obsahujících viry nebo buňky a ochranné prostředky v nicliž jsou směsi přizpůsobené ke stabilizaci těchto vzorků během dehydratace a následného skladování při teplotě okolí a vyšších teplotách.
Přikladl:
Byl studován vliv redukujících a neredukujících cukrů a póly vinylpyrrolidonu (PVP) na isocitratdehydrogenázu (ICDH) při teplotě místnosti a při 37 °C. Tento pokus je navržen pro zkoušení redukční schopnosti přídavných látek jako jsou cukry. Tato vlastnost je charakteristická při schopnosti produkovat Maillardovu reakci nebo reakci enzymatického hnědnutí. Pro monosacharidy nebo jednoduché cukry je glykosylová hydroxylové skupina nebo OH na C náchylná chemicky reagovat s aminovými zbytky obsahujícími NH nebo NH2, např. lysin, asparagin.
Enzym ICDH byl dodavatelem připraven v 50% glycerolu. Byly použity následující ochranné roztoky: 1) 30 % sacharózy + 10 % PVP roztoku, 2) 20 % glukózy + 20 % PVP roztoku, 3) 20 % írukíózy + 20 % PVP roztoku a
4) 20 % methyl u-d-glukopyranosidu + 10 % PVP roztoku.
ICDH (200 μΐ) byla dialyzována ve studeném 0,lM Tris HC1 pulru po dobu 5 hodin při 15 až 17 °C. Pufr byl mírně míchán tak, aby malé molekuly byly rovnoměrně dispergovány v celém roztoku. Po dialýze byla ICDH (celkový objem: 180 μΐ) převedena do 1,7 ml kyvety pro mikrocentrifugu, k níž bylo ·· : .· • · ··· ···· ·· · • · fl • · · • · · · • · · .: : ,· • · · ·· ·00· přidáno 250 μΐ 0,1 m Tris HCl pufru, pH 7,8. Kyveta byla umístěna do mrazáku.
Po přídavku jednoho ze čtyř různých ochranných prostředků ICDH (100 μΐ podíly) byla uchovávána v 1,7 ml ky větách pro mikroeentrifugu. Ochranné směsi byly intenzivně promíchány (vířivé míchadlo) a pak aiikvotně rozděleny po 10 μΐ do každé ze 40 kyvet. Z každé ze čtyř ochranných směsí byl analyzován jeden vzorek v nulovém čase. Zbylé vzorky byly sušeny při teplotě místnosti ve vakuu přes noc. Po tomto sušení byl z každé ochranné směsi analyzován další vzorek. Zbylé vzorky byly rozděleny do dvou sad, jedna pro skladování při teplotě místnosti a druhá pro skladování při 37 °C. Každé dva týdny byl odebrán z každé ochranné směsi a to z obou skladovacích teplot jeden vzorek a stanovena aktivita.
Všechny vzorky určené k analýze byly lOx zředěny 0,lM Tris HCl pufrem, pH 7,8 a intenzivně promíchány vířením. Zředěné vzorky (10 μΐ) byly inkubovány se 3 ml 0,lM Tris HCl pufru, pH 7,8, 10 μ! 50mM isoeitrátu a 10 μΐ lOmM roztoku NADP+. Po čase byla změřena absorbance při 340 nm. Ze změn absorbaneí při 20 mV a při rychlosti posunu papíru zapisovače 4 cm/ min byla stanovena relativní aktivita. Výsledky ukazují obrázky 1A a 1B.
Příklad 2:
Byl studován vliv redukujících a neredukujícíeh cukrů a polyvinylpyrrolidonu (PVP) na isocitratdehydrogenázu (íCDH) během skladování pň 50 °C. Tento pokus byl navržen pro testování redukční schopnosti přídavných látek jako jsou cukry. Tato redukční vlastnost je charakteristická schopností produkovat Maillardovu reakcí nebo reakci enzymového hnědnutí. Pro monosacharidy nebo jednoduché cukry je glykosylová hydroxylová skupina nebo OH na C náchylná chemicky reagovat s aminovými zbytky obsahujících NH nebo NH2, např. lysin, asparagin.
• ·· · · ···· · · · · ···· · · · · · · ·
Enzym ICDH byl připraven dodavatelem v 50% glycerolu.Byly použity následující ochranné roztoky: 1) 30 % sacharózy + 10 % roztok PVP, 2) 20 % glukózy + 20 % roztok PVP, 3) 20 % fruktózy + 20 % roztok PVP a 4) 20 % methyl α-d-glukopyranosidu + 10 % roztok PVP.
ICDH byla dialyzována ve studeném 0,lM Tris HCl pufru po dobu 5 hodin při 15 až 17 °C. Pufr byl mírně míchán tak, že malé molekuly byly rovnoměrně dispergovány v celém objemu roztoku. Po dialýze byla ICDH (celkový objem = 180 μΐ) převedena do l,7ml mikrolitrové kyvety, do které bylo přidáno 250 μΐ 0,1Μ Tris HCl pufru pH 7,8. Kyveta byla umístěna do mrazáku.
chrannýeh prostředků v l,7ml ky vě tách pro mikrocentrifugu. Ochranné směsi byly intenzivně promíchány a pak rovnoměrně rozděleny do 10 μι částí. Z každé ze čtyř ochranných směsí byl analyzován jeden vzorek byl analyzován v nulovém čase. Zbylé vzorky byly sušeny ve vakuu přes noc při teplotě místnosti. Po sušení byl z každé ochranné směsi analyzován další vzorek. Zbylé vzorky byly skladovány při teplotě 50 °C. Každé dva týdny byla stanovena aktivita jednoho vzorku z každé ochranné směsi.
Všechny vzorky určené k analýze byly zředěny 10 x 0,lM Tris HCl pufrem, pH 7,8 a intenzivně promíchány vířením. Zředěné vzorky (10 μϊ) byly inkubovány se 3 tni 0,lM Tris HCl pufru, pH 7,8,10 μϊ lOmM M11SO4, 10 μϊ 50 mM isocitrátu a 10 μϊ lOmM roztoku NxADP+. Po čase byla měřena absorbance při 340 nM. Ze změn absorbance při 20 mV a při rychlosti posunu papíru 4 cm/min byla stanovena relativní aktivita. Výsledky ukazuje obrázek 2.
Příklad 3:
Byl studován vliv redukujících a neredukujících cukrů a maltrinu na isocitratdehydrogenázu (ICDH) během skladování při teplotě 50 °C. Tento pokus byl navržen pro testování redukční schopnosti přídavných látek jako jsou cukry. Tyto redukční vlastnosti jsou charakteristické svou schopností produkovat • · · · • · · · · ···· · · · ···· • · · · · ·· · • ····· ··· · • · · · · · · · ··· ···· ·· · ·· ····
Maillardovu reakci nebo reakci enzymatického hnědnutí. Pro monosacharidy nebo jednoduché cukry je giykosyiová hydroxylová skupina nebo OH na C náchylná k chemické reakci s aminovými zbytky obsahujícími NH nebo NH2 např. lysin, asparagin.
Enzym ICDH byl dodavatelem připraven v 50% glycerolu. Byly použity následující ochranné roztoky: 1) 30 % sacharózy + 10 % roztoku maitrinu,
2) 20 % glukózy + 20 % roztoku maitrinu, 3) 20 % frukíózy + 20 % roztoku maltrin a 4) 20 % methyl α-d-glukopyranosig + 10 % roztoku maitrinu.
ICDH (200 μΐ) byla dialyzována v studeném 0,lM tris HCl pufru po dobu 5 hodin při 15 až 17 °C. Pufr byl jemně míchán takže malé molekuly byly rovnoměrně dispegovány v celém objemu roztoku. Po dialýze byla ICDH (celkový objem — ISO μΐ) převedena do 1,7 ml kyvety pro mikrocentriíugu do níž bylo přidáno 250 μΐ 0,lM Tris HCl pufru, pH 7,8. Kyveta byla umístěna do mrazáku.
Po přídavku jednoho ze čtyř ochranných prostředků byla ICDH (100 μΐ podíly) uchovávána v 1,7 ml ky větách pro mikrocentrifugu. Ochranné směsi byly intenzivně promíchány vířením a pak přidány každá po 10 μΐ. Z každé ze čtyř ochranných směsí byl analyzován jeden vzorek v nulovém čase. Zbylé vzorky byly sušeny ve vakuu přes noc při teplotě místnosti. Po sušení byl z každé ochranné směsi analyzován další vzorek. Zbylé vzorky byly skladovány při 50 °C. Každé dva týdny byla u jednoho vzorku z každé ochranné směsi stanovena aktivita.
Všeclmy analyzované vzorky byly zředěny 10 x 0,lM Tris HCl pufrem, pH 7,8 a intenzivně proiníchány vířením. Zředěné vzorky (10 μΐ) byly inkubovány se 3 ml 0,lM Tris HCl pufru, pH 7,8,10 μΐ lOmM MnSO4,10 μΐ 50mM kyseliny isocitronové a 10 μΐ 10 mM roztoku NADP+. Po čase byla změřena absorbance při 340 nm. Ze změn absorbance při 20 mV a při rychlosti posunu papíru zapisovače 4 cin/inin byla stanovena relativní aktivita. Výsledky ukazuje obrázek 3.
• ·· ·9 ···· ·· ·· • · · · · · · · · · « • · · · · « · · • 9 9 9 9 9 9 9
9999999 99 9 99 9999
Příklad 4:
Pro měření teploty zesklovatění methyl α-d-glukopyranosidu byíy krystaly zataveny do hliníkové misky používané pro zkoušky DSC (differential scanning ealorimetry, tj. diferenční skanovaeí kalorimetrie). Vzorek byl nejprve během rozžhavení roztaven a pak rychle ochlazen na teplotu 100 °C. Během zchlazení vzorek zesklovatěl.V průběhu zahřívání (10 °C/min) byla měřena teplota zesklovatění. Změna měrného tepla spojená s přeměnou skla na kapalinu, Tg = 29 °C, je znázorněna na obrázku 4.
Příklad 5:
Následující pokusy byly provedeny za účelem určení schopnosti přípravků chránit stabilitu amorfního (sklo) stavu během dehydratačního procesu a následného skladování. Může dojít k poškození produktu během krystalizace nebo k popraskání uvnitř skleněné matrice. Krystalizace je proces probíhající ve dvou krocích, k němuž dochází v přesycených nebo podchiazených roztocích. Prvním krokem je nukleace, při které dochází k tvorbě stabilních jader následné krystalizační fáze.Tvorba jader je experimentálně závislá na nečistotách obsažených v materiálu. Stabilizace těchto jader závisí na teplotě a koncentraci roztoků nebo pomocných roztoků. Druhý krok kultivace kiystalizaee prostřednictvím procesu růstu krystalů z velikosti jader. To je též závislé na teplotě a koncentraci různých složek v materiálech. Nukleace je optimální, pokud je vysušený vzorek téměř úplně v dehydrovaném stavu (jestližeje krystalizovaný roztok čistý) a růst krystalů bude podporován, je-li viskozita snižována v závislosti na vnitřní kinetice růstu.
Byly připraveny roztoky v rozmezí koncentrací 30 až 50 % hmotnostních celkového roztoku v rozsahu rozpustnosti sloučenin s rozdílnými hmotnostními poměry mezi složkami, jak je patrné z následující tabulky. Všechny roztoky byly filtrovány přes 0,2μιη filtrační jednotky Acrodisc.
Roztoky byly rozděleny do kapiček na destičky mikroskopu a pak buď vy• · · · • · · ·· « slaveny rychlému úplnému vysušení a nebo pomalému neukončenému procesu dehydratace, jak je popsáno níže. Kapičky(10 μΐ) byly umístěny na alkoholem vyčištěná mikroskopovací sklíčka za použití 20μ1 pipet za účelem kápnutí deseti 1 Ομί kapiček na každé sklo, 40 kapiček na vzorek. Byly připraveny krabičky s vrstvou sušidla DRIERITE. Destičky byly umístěny do krabiček s výše uvedeným sušidlem a zality parafínem. Po čase byl zjištěn a zaznamenán počet vytvořených krystalů. Po dvou týdnech byly vzorky převedeny do atmosféry o relativní vlhkosti 52 % (RH-relative humidity) nasycené ívíg(NO3)2. Po čase byl znova zjištěn a zaznamenán počet vytvořených krystalů. Výsledky jsou shrnuly v níže uvedených tabulkách 1 až 6.
Podíly (lg) z každého kontrolního vzorku (buněčná kultura s ochranným roztokem) byly 10 násobně zředěny PBS.
• ·· ·· ··*· 9 · 9 9 • · · · · ♦ · » « 9 · • · 9 · · «9 9 • · · · · · · · 9 9 • 9 · · · 999
999 9999 99 · 9· 9999
Tabulka 1:
50% sacharóza : MSG kapková krystalizace
0% rel. vlhkost skladování # | 52% rel. vlhkost skladování* |
Poměr sacharáza:MSG | týden 1 | týden 2 | týden 1 | týden 2 |
40:1 | 0.00 | 0.00 | 7.50 | 15.00 |
30:1 | 0.00 | 0.00 | 2.50 | 2.50 |
20:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
10:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
8:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
6:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
4:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
2.5:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
1:40 | 7.50 | N/A | 12.50 | 15.00 |
1:30 | 60.00 | N/A | 77.50 | 77.50 |
1:20 | 72.50 | NIA | 75.00 | 75.00 |
1:10 | 72.50 | N/A | 75.00 | 75.00 |
1:8 | 75.00 | N/A | 80.00 | 80.00 |
1:06 | 05.00 | N/A | 95.00 | 95.00 |
1:04 | 42.50 | N/A | 42.50 | 42.50 |
1:2.5 | 5.00 | N/A | 5.00 | 5.00 |
1:01 | 0.00 | N/A | 0.00 | 0.00 |
50% MSG | 70.00 | N/A | 70.00 | 70.00 |
* DRIERITE *’ Mg(N03)2 • 0 0 00 0
00 0* 0 0000 • 0000 00 0
000 000 000 0000 00 0 00 0000
Tabulka 2:
50% sacharóza : MSG kapková krystalizace (pouze DRIERITE)
Poměr sacharóza:MSG | týden 1 | týden 2 |
50% sucrose | 0,00 | 0.00 |
40:1 | 0.00 | 0.00 |
30:1 | 0.00 | 0.00 |
20:1 | 0.00 | 0.00 |
10:1 | 0.00 | 0.00 |
8:1 | 0.00 | 0.00 |
6:1 | 0.00 | 0.00 |
4:1 | 0.00 | 0.00 |
2.5:1 | 0.00 | 0.00 |
1:1 | 0.00 | 0.00 |
1:2 | 0.00 | 0.00 |
1:4 | 2.50 | 2.50 |
1:6 | 0.00 | 0.00 |
1:8 | 15.00 | 15.00 |
1:10 | 65.00 | 65.00 |
1:20 | 92.50 | 92.50 |
1:30 | 97.50 | 97.50 |
1:40 | 2.50 | 2.50 |
50% MSG | 100.00 | N/A |
• ·* ·© ··»· ·· ·· ··♦· · · · · © « · • · · · © ·· · © ··©·· «·· · 9© ··© · · · ©·© ···© ·* · ·· ····
Tabulka 3
50% sacharóza : inositol kapková krystalizace
I
0% rel. vlhkost skladování* 52% rd. vlhkost skladování** .----· - - '·· — -- -- ..---. ------ ... . ...
Ratio InositohMSG | week 1 | week 2 | week 1 | week 2 |
4:1 | 90 | 100 | N/A | N/A |
6:1 | 100 | N/A | N/A | N/A |
8:1 | 0 | 100 | N/A | N/A |
10:1 | 0 | 70 | 100 | N/A |
12:1 | 0 | 67.5 | 100 | N/A |
16:1 | 0 | 0 | 100 | N/A |
20:1 | 0 | 0 | 100 | N/A |
50% sucrose | 0 | 0 | 12.5 | 22.5 |
• DRIERITE ·· Mg{N03)2 • ft ftftftft • ft · ftft ftft • ftft · ftftftft • ftftftft ftft ft • ft ftftft ftftft • ftft ftftftft ftft · ftft ftftftft
Tabulka 4:
50% sacharóza:methyl a-d-glukopyranosid (MAG) kapková krystalizace
0% rel. vlhkost skladování*
52% rel. vlhkost skladování4*
Poměr sacharóza:MAG | týden 1 | týden 2 | týden 1 | týden 2 |
50%sacharóza | 0.00 | 0.00 | 2.50 | NA |
40:1 | 0.00 | 2.50 | 2.50 | NA |
30:1 | 0.00 | 0.00 | 5.00 | NA |
20:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | NA |
10:1 | 0.00 | 0.00 | 2.50 | NA |
8:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | NA |
6:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | NA |
4:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | NA |
2:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | NA |
1:1 | 0.00 | 0.00 | 2.50 | NA |
1:2 | 0.00 | 0.00 | 7.50 | NA |
1:4 | 0.00 | 2.50 | 5.00 | NA |
1:6 | 45.00 | 55.00 | 65.00 | NA |
1:8 | 22.50 | 47.50 | 67.50 | NA |
1:10 | 30.00 | 52.50 | 52.50 | NA |
1:20 | 67.50 | 100.00 | N/A | NA |
1:30 | 67.50 | 100.00 | N/A | NA |
1:40 | 100.00 | N/A | N/A | NA |
50% MAG | 100.00 | N/A | N/A | NA |
* DRIERITE ” Mg(N03)2 ♦« ······ 00 00 • 0 · 0 00 0 0000
0000 00 0
0 000 000 • 00 0000 00 0 00 0000
Tabulka 5:
50% MSG : methyl α-d-glukopyranosid (MAG) kapková krystalizace
0% rel. vlhkost skladování* | 52% rel. vlhk. skladování4* |
PoměrMSG:MA( | ' týden 1 | týden 2 | týden 1 |
50% MSG | N/A | Ji/A | N/A |
40:1 | N/A | N/A | N/A |
30:1 | N/A | N/A | N/A |
20:1 | 45.00 | 45.00 | 45.00 |
10:1 | 97.50 | 97.50 | 97.5 |
8:1 | 100.00 | N/A | N/A |
6:1 | 2.50 | 2.50 | 7.5 |
4:1 | 2.50 | 2.50 | 2.5 |
2:1 | 0.00 | 0.00 | 0 |
1:1 | 0.00 | 0.00 | 35 |
1:2 | 2.50 | 7.50 | 17.5 |
1:4 | 2.50 | 5.00 | 5 |
1:6 | 20.00 | 22.50 | 37.5 |
1:8 | 5.00 | 7.50 | 12.5 |
1:10 | 87.50 | 87.50 | 95 |
1:20 | 37.50 | 45.00 | 55 |
1:30 | 87.50 | 90.00 | 95 |
1:40 | 70.00 | 92.50 | 92.5 |
50% MAG | 100.00 | N/A | N/A |
* DRIERITE ·* Mg(NQ3)z
Jestliže byl použit 50% MSG a methyl α-d-glukopyranosid, bylo zjištěno, že při poměrech 40 :1 a případně 30 :1, krystalizovaly roztoky po té, co byly uchovávány přes noc při teplotě místnosti (tabulka 5).
9 9 4 9 4»» 9 99 99
9· ·· * 9999
999« 99 9
99999 999 9 «4 «·· «49 «4« 4*9« 4« 4 «9 9494
S ohledem na výsledky uvedené v tabulce 6 (uvedené níže) při poměrech 50% MSG 1 : 10,1 : 20,1 : 30 a 1 :40 k frehalóze, krystalizovaly roztoky přes noc při teplotě místnosti. Následně nebyla provedena u těchto přípravků analýza kapiček.
Tabulka 6:
50% MSG ; trebalóza kapková krystalizace (pouze DRIERITE)
Poměr MSG:trehalóza | týden 1 |
50% MSG | 100 |
40:1 | 100 |
30:1 | 0 |
20:1 | 2.5 |
10:1 | 0 |
8:1 | 5 |
6:1 | 0 |
4:1 | 0 |
2:1 | 0 |
1:1 | 0 |
1:2 | 0 |
1:4 | 100 |
1:6 | 0 |
1:8 | 100 |
1:10 | N/A |
1:20 | NJA |
1:10 | N/A |
1:40 | N/A |
50% 'trehalóza | 100 |
9 9 99 9 « ·>*·· ··>·
Příklad 6:
Byly samostatně kultivovány a odebrány tyto viry: virus respiraění syncytiální choroby skotu (Bovine Respirátory Syncytial Virus = BRSV), virus rhinotracheitidy skotu (IBR), virus průjmového onemocnění skotu (Viral Diarrhea — BVD) a virus chřipkového onemocnění typu 3 (Parainíluenza 3 - PI 3). Po odběru byly viry smíchány se stabilizátorem a pak rozděleny přibližně do 40 ml podílů a po té zmrazený v mrazáku při -80 °C až do doby použití.
Následující 70% (lunotnostní) ochranné roztoky byly připraveny v 0,01M fosfátovém pufru a sterilně přefiltrovány přes polyestersulfonové (PES) filtrační systémy Corning velikosti 0,22 μπι; 1) sacharóza : methyl a-d-glukopyranosid (2 :1), 2) sachróza : inositol (6 :1), 3) sacharóza: isomalt (2:1), 4) sacharóza : sorbitol (5 : 2), 5) trehalóza a 6) sacharóza: MSG (5 : 2).
Všechny práce týkající se přípravy produktu byly provedeny v místnosti o teplotě 18 °C. Viry byly vyjmuty z mrazáku (-80 °C) a umístěny pod tekou vodovodní vodu za účelem rozmražení (přibližně 1 hodina). Byla připravena směs čtyř virů v poměru vložena do sterilních 50ml polypropylénových kónických baněk. K jednomu dílu virové směsi byly přidány dva díly sterilního oehraruiého roztoku. Intenzivním promícháním vířením byla získána homogenní směs. Pro každou směs virus/ochranný roztok bylo vloženo 2,4 g do sterilních 30ml sérových ampulí z borokřemiěitého skla (Wheaton). Do hrdla každé ampule byla vložena 13nun lyofíiizační zátka k první zarážce, takže byla ponechána v zátce otevřená drážka, která umožňovala odpařování vody během ochrany tvorbou pěny. Ampule byly pak umístěny na kovový sušící podnos. Podnosy byly umístěny do předcházeného (5 °C) lyofilizaěnílio zařízení upraveného pro provádění ochrany tvorbou pěny. Do jedné z ampulí byl umístěn termočlánek za účelem sledování teploty během procesu sušení. Pak bylo provedeno sušení. Když byla ochrana tvorbou pěny ukončena, ampule byly ve
v 9» | 9999 | • 9 | |||
• * * • · | • · • · | • 9 | 9 9 | 9 9 | 9 |
• · *· ···« | 9 9 9· | 9 • | 9 99 | 9 | 9 999 |
vakuu zazátkovány a pak vyjmuty z lyofílizaěního zařízení. Ampule byly zapečetěny hliníkovými plombami a uchovávány při 4 °C. Chráněné vzorky, stejně jako zmrazené kontrolní vzorky byly analyzovány následujícími způsoby·
Buňky hovězích ledvin podle Madin-Darby ( Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) Cells) byly udržovány v médiu fy Dubleco Dulbeeo's Modifíed Eagle Medium (DMEM) s 5 % koňského séra (JRH Biologieals). Sérum bylo protilátkové a bez virů BVD, í BR, PI3 a BRSV. Z NVSL byla získána virová neutralizační séra a použita při virové titraci každé frakce vakcíny: BVDV antiserum NVSL série 4X, PI3 antiserum NVSL série 86,2; IBRV antiserumNVSL série 10X a BRSV antiserum NVSL série 88-5X.
Virová titrace pro každou frakci vzorků BRSV, IBR, BVD a PI3 byla stanovena pomocí 4 druhové vakcíny (4-way vaccine), připravené neutralizací ostatních tří frakcí virově specifického antisera. Kultury buněk MDBK ve 490 cm2 válcové lahvi byly přemístěny (vymyty) trypsin EDTA (série # 7B2028, JRH Bioseience) a suspendovány v DMEM + 5% koňského séra při koncentraci 1,5 χ 105 buněk na ml. Buněčnou suspenzí byly zaočkovány 96 jamkové desky po 200 μΐ na jamku. Tyto mikrotitrační desky byly kultivovány přes noc a následující den použity pro virovou titraci, když byly buňky asi v 80% souvislé jednoduché vrstvě.
Každá ampule chráněných virů (4 druhová vakeína) byla rehydratována pomocí 15,5 ml DMEM. Bylo uvažováno zředění 10°. Byly spojeny čtyři ampule z každé rehydratované vakcíny a použity pro virovou titraci. Kontrolními viry byly výše uvedené zmrazené viry. Bylo odebráno 0,1 ml vzorku rehydratované vakcíny a přidáno ke sterilníl ml ampuli obsahující 0,3 ml každého antisera k ostatním třem virům. Například, jestliže byl titrován BVD, bylo přidáno 0,1 ml vakcíny k ampuli obsahující 0,3 ml anti IBR séra, 0,3 ml anti BRSV séra a 0,3 ml anti PI3 séra. Celkový objem tohoto stádia byl
1,0 ml a zředění víru bylo 101. Směs byla ínkubována po dobu 40 minut při teplotě místnosti.
Desetinásobného zředění virů bylo dosaženo v 96 jamkových mikrotitraěních deskách přídavkem 22 μΐ neutralizovaných (101) vzorku do první řady jamek (200μ1) desky. Každá jamka byla promíchána (toto odpovídalo zředění ID2) a 22 μΐ bylo převedeno do druhé řady a tak dále až do konce.Virové titraee byly provedeny ve sloupci 1 až 10. Sloupce 11 a 12 byly ponechány jako neinfikované buněčné kontroly. Desky byly inkubovány po dobu čtyř dnů při 37 °C v atmosféře 5% CO2. Infekce viry byla vyhodnocena ze záznamů eytopatiekého účinku (CPE - cytopathic efecl). Nakonec byly vypočteny titri virů za použití Reed-Muenehovy metody. Byly zaznamenány litry čtyř virů získaných z kontrolních virů a z chráněných vakeín a srovnány z hlediska ztráty viru během ochrany, výsledky ukazuje tabulka 7; dvě uvedená čísla znamenají dvojité pokusy.
Tabulka 7:
Ochranné účinky methyl α-d-gfukopyranosidu alkoholických cukrů na ochranu virů BRSV, IBR, BVD a PI3
Počáteční přežití (%) po ochraně | ||||
Ochranný roztok | BRSV | IBR | BVD | Ph |
sacharóza:methyl a-d-glukopyranosi; ..... (2:1) | 57.5, 64.6 | 52.5,37.2 | 66.1,58.9 | 125.9,89.1 |
sacharóza:inositol (6:1) | 38.0,29.6 | 13.5,10.7 | 97.7,24.0 | 67.6,24.0 |
sacharózarisomalt (2:1) | 36.3,33.9 | 16.6,13.5 | 83.2,9.8 | 69.2,26.9 |
sacharóza: sorbitol (5:2) | 35.5 | 17.8 | 2.5 | 28.8 |
trehalóza | 33.9 | 20.0 | 16.2 | 102.3 |
sacharóza:MSG (5:2) | 21.0,29.5 | 38.0,35.5 | 87.1,49.0 | 91.2,35.5 |
Příklad 7:
Byly samostatně kultivovány a pěstovány Newcstle virus a virus bronchilidy. Po vypěstování byly viry smíchány se stabilizátorem a pak rozděleny přibližně do 200ml podílů a zmraženy při -80 °C. Zmrazené viry byly skladovány v mrazáku Revco až do doby použití.
Byly připraveny následující 70% (hmotnostní) ochranné roztoky v 0,01M fosfátovém pufru a sterilně přefiltrovány přes polyestersulfonové (PES) filtrační systémy Corning o velikosti 0,22 pm. 1) sacharóza : methyl a-d-gíukopyranosid (2 : 1), 2) sacharóza : MGS (4 :1),3) sachrža: maltitol (4 :1) a sacharóza : mannitol (13 :1).
Všechny práce týkající se přípravy produktu byly prováděny v místnosti o teplotě 18 °C. Viry byly vyjmuty z mrazáku (-80 °C) a umístěny pod tekoucí vodovodní vodu za účelem rozmražení (přibližně 2 hodiny). Použitím aseptických technik byla připravena směs dvou virů v poměru 1 : 1 do sterilních 50ml polypropylénových kónických baněk. K jednomu dílu virové směsi byly přidány dva díly ochranného roztoku. Intenzivním promícháním vířením byla získána homogenní směs. Pro každou směs virus/ochranný roztok bylo dávkováno 3,0 g do sterilních 30ml sérových ampulí z borokřemiěitého skla (Wheaton). Do hrdla každé ampule byla vložena I3mm lyofilizační zátka k první zarážce, takže byla ponechána v zátce otevřená drážka umožňující odpařování vody během ochrany tvorbou pěny. Pak byly ampule umístěny na kovový sušící podnos. Tyto podnosy byly vloženy do předehlazeného (5 °C) lyofilizaěního zařízení upraveného pro provádění pěnových ochranných způsobů podle tohoto vynálezu. Do jedné z ampulí byi umístěn termočlánek za účelem sledování teplota vzorku během procesu sušení. Po ukončení ochrany tvorbou pěny byly ampule ve vakuu zazátkovány a pak vyjmuty z lyofilizačnílio zařízení. Ampule byly zapečetěny hliníkovými plombami a uchovávány • · při teplotě místnosti nebo při 4 °C, což závisí na Td průběhu sušení (t j jestliže T(f=30 °C, vzorky byly uchovávány při pokojové teplotě, jestliže T<j=20 °C, vzorky byly uchovávány v lednici).
Tilry virů byly stanoveny stejným způsobem, jak je výše popsáno v příkladu 6. Výsledky jednoduchého pokusu jsou uvedeny v tabulce 8.
Tabulka 8:
Ochranné účinky methyl u-d-glukopyranosidu a alkoholických cukrů na ochranu Newcastle viru a viru bronchitidy
Počáteční přežití (%) po ochraně | ||
Ochranný roztok | virus Newcastle | virus bronchitidy |
sacharózarmethyl a-d-glukopyranpš | 100 | 20.4 |
fiacharóza:maltitol (4:1) | 56.2 | x 2.4 |
sacharóza:mannitol | 55.0 | 4.8 |
sacharóza:MSG (4:1) | 23.4 | 0.4 |
Příklad 8:
Pro ochranu Streptococcus equi byly připraveny v 0,01 M fosfátovém pufru následující 70% (hmotnostní) ochranné roztoky a sterilně přefiltrovány přes polyestersulfonové (PES) filtrační systémy Corning o velikosti 0,22 pm: 1) sacharóza : methyl u-d-glukopyranosid (4 :1), 2) sacharóza : methyl a-d-glukopyranosid (1 : 1) a 3) sacharóza : glutamát (5 : 2).
Jedna z atnpulí ze zmrazené inokulaění zásoby (série WS012696) byla vyjmuta z mrazáku na -80 °C a rozmražena ve studené vodě. Celý obsah (0,1 ml) byl převeden do 150 ml S. equi růstového média (série 0757). Podle hmotnostního vzorce bylo k médiu přidáno 20 g 50% dextrózy na litr. Baňka byla inkubována s víčkem a třepána při 37 °C na třepačce při 100 rpm přibližně po • · ·
dobu 20 až 24 hodin. Kultura byla nechána růst až do dosažení optické hustoty (OD - optieal density) 0,8 až 1,5 při vínové délce 600 nm (12 hodin). Na TSAII + 5% krevní agar (série KI RUWW) byl nanesen kličkou čistý proužek kultury. Po inkubaci 24 až 48 hodin při 37 °C, miska byla zkoušena a nekontaminovaná byla detekována.
Po přibližně 23,5 hodinách inkubace bylo převedeno 10 mi prekultury do 500ml baňky s 250 ml růstového média. Prekultura byla inkubována přibližně 4 hodiny za výše popsaných podmínek. Byl nanesen další čistý proužek na TSA II + 5% krevní agar. Po inkubaci po dobu 24 až 48 hodin při 37 °C byla miska zkoušena a nekontaminovná detekována. Absorbance prekultury při 600 nm byla 1,888.
Přibližně po 5 hodinách bylo z druhé prekultury inokuiováno 50 ml do fermentoru obsahujícího 1000 ml bujónu pro S.equi s glukózou. Fermentaění podmínky byly: aerace stlačeným kyslíkem 1 litr za minutu, míchání při 100 rpm a regulace pH použitím 2,5N HCl a 2,5 NaOH při teplotě 37 °C.
Jakmile kultura dosáhla stacionární fáze, byla buněčná kultura smíchána s ocliranným roztokem ve hmotnostním poměru 1:1. Intenzivním promícháním vířením byla získána homogenní směs. Pro každou směs virusZ/ochranný roztok bylo dávkováno 0,1 g do sterilních sérových ampulí z borokřemičitého skla (Wheaton). Do hrdla každé ampule byla vložena 13mm lyofilizaění zátka k první zarážce, takže byla ponechána otevřená drážka v zátce, což umožňovalo odpařování vody během ochranného procesu. Ampule byly pak umístěny na kovový sušící podnos. Podnosy byly umístěny do předehlazeného (5 °C) lyofilizaěnflio zařízení upraveného pro provádění metod pěnového sušení. Do jedné z ampulí byl vložen termočlánek za účelem sledování teploty vzorku během procesu sušení. Po ochraně byly ampule ve vakuu zazátkovány a vyjmuty z lyofilizaěnflio zařízení. Ampule byly zapečetěny hliníkovými plombami a uchovávány při teplotě místnosti.
Φφφ® φφ ·· • φ · φ φ ·
φ φ φφφ φ φφ φφφ
Alikvótní části (1 g) každého kontrolního vzorku (buněčná kultura s ochranným roztokem) byly 10 násobně zředěny pomocí PBS. Ampuie vzorků chráněných buněk byly rehydrátovány pomocí 10 ml PBS. Kontrolní a chráněné vzorky byly dále zředěny na IO-4 a 10'5. Na kultivační destičky7 s krevním agarem byly provedeny tří nátěiy o ředění 105 a IO-6. Destičky7 byly inkubovány při 37 °C po dobu 48 hodin. U všech vzorků byly spočítány všechny vytvořené kolonie. Destičky, které poskytly výtěžek mezi 30 a 300 koloniemi byly použity k výpočtu CFU/ml. CFU/ml pro chráněné vzorky bylo pak rozděleno podle CFU/inl kontrolních vzorků (buněčná kultura) pro určení % přežití po ochranné proceduře. Výsledky ukazuje obrázek 5.
Příklad 9:
Byly samostatně kultivovány a pěstovány tyto vity: virus respirační syncytiální choroby skotu (BRSV), virus rhinotracheitidy skotu (IBR), virus průjmového onemocnění skotu (BVD) a virus chřipkového onemocnění typu 3 (PI3). Po odběru byly viry smíchány se stabilizátorem a pak rozděleny přibližně po 40ml alikvotních podílech a pak zmraženy na -80 °C až do doby pouByly připraveny následující 70% (hmotnostní) ochranné roztoky v 0,01M fosfátovém pufru a sterilně přefiltrovány přes polyestersulfonové (PES) filtrační systémy Corning o velikosti 0,22 pm: 1) sacharóza : methyl a-d-gíukopyranosid (2 : 1), 2) sacharóza : methyl a-d-glukopyranosid (4 : 1) a 3) sacharóza : rafinóza (5 :2).
Všechny práce týkající se přípravy produktu byly provedeny v místnosti o teplotě 18 °C. Viry byly vyjmuty z mrazáku (-80 °C) a umístěny pod tekoucí vodovodní vodu za účelem rozmražení (přibližně 1 hodina).Za použití aseptiekých technik byla připravena v daném poměru směs čtyř virů do 50ml polypropylénových kónických baněk. K jednomu dílu virové směsi byly přidány dva díly sterilního ochranného roztoku. Intenzívním promícháním vířením
444 4
44 ► 4 4 « »4 4444 byla získána homogenní směs. Pro každou směs virus/ochranný roztok bylo dávkováno 2,4 g do sterilních 30ml sérových ampuli z borokřemičitého skla (Wheaton). Do hrdla každé ampule ba vložena lyofilizační zátka k první zarážce, takže byla ponechána v zátee otevřená drážka, která umožňovala odpařování vody během ochrany tvorbou pěny. Pak byly ampule umístěny na kovový sušící podnos. Podnosy byly vloženy do předchlazeného (5 °C) lyofilizaěnflio zařízení upraveného k provádění ochrany tvorbou pěny. Do jedné z ampuli byl vložen termočlánek za účelem sledování teploty během procesu sušení. Pak bylo provedeno sušení. Když byla ochrana tvorbou pěny ukončena, ampule byly ve vakuu zazátkovány a pak vyjmuty z lyofilizačního zařízení. Ampule byly zapečetěny hliníkovými plombami a uchovávány při teplotě 4 °C. Chráněné vzorky, stejně jako i zmrazené kontrolní vzorky byly analyzovány následujícími metodami.
Buňky hovězích ledvin podle Madin-Darby (MDBK byly udržovány v médiu fy Dubecco Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM) s 5 % koňským sérem (JRH Biologicals). Sérum bylo protilátkové a neobsahovalo viry BVD, IBR, PI3 a BRSV. Následující viry neutralizující séra byla získána od NVSL a použita k virové titraci každé frakce vakcíny: BVDV antisérum NVSL série 4X, PI3 antisérum NVSL série 86,2, IBRV antisérum NVSL série 10X a BRSV antisérum NVSL série 88-5X.
Virová titrace každé frakce vzorků BRSV, IBR, BVD a P13 byla vyhodnocena pomocí 4 druhové vakcíny připravené neutralizací ostatních tří frakcí virově specifickým antisérem. Kultura buněk MDBK v 490 cm2 válcové lahvi byla promyta trypsin EDTA (série //7B2028, JRH Bioscience) a suspendována v DMEM s 5 % koňského séra při koncentraci 1,5 x 105 buněk na ml. Buněčnou suspenzí byly naočkovány 96 jamkové mikrolilrační desky po 200 μΐ na jamku. Mikrotitrační desky byly kultivovány přes noc a použity následující den pro virovou titraci, jestliže buňky byly asi v 80% souvislé jednoduché vrstvě.
• ·« 9· ··♦· 99 94
4 4 94 9 9999
949« 99 4
9444« 444 4 «99 499 «99 9999 99 9 94 9499
Každá ampule chráněných virů (4 druhová vakcína) byla rehydraíována pomocí 15,5 ml DMEM. Toto bylo považováno za zředění 10°. Čtyři ampule od každé rehydratované vakcíny byly spojeny a použity pro virovou titraci. Kontrolními viry byly zmrazené viry. Bylo odebránno 0,1 ml vzorku rehydrátované vakcíny a přidáno do sterilní Iml ampule obsahující 0,3 mí každého antiséra k ostatním třem virům. Například, jestliže byl titrován BVD, bylo přidáno 0,1 ml vakcíny do ampule obsahující 0,3 ml anti IBR séra, 0,3 ml anti BRSV séra a 0,3 ml anti PI3 séra. Celkový objem v tomto stádiu byl 1,0 ml a zředění viru bylo 101. Směs byla inkubována po dobu 40 minut při teplotě místnosti.
Přídavkem 22 μΐ neutralizovaných (101) vzorků do jamek (200 μί) první řady mikrotitrační desky bylo dosaženo desetinásobného zředění v 96 jamkových mikrotitračních deskách. Každá jamka byla promíchána (toto bylo ředění 10') a bylo převedeno 22 μί do druhé řady a tak dále až do konce. Virové titrace byly provedeny na kolonách 1 až 10. Kolony 11a 12 byly ponechány jako neinfikované buněčné kontroly. Desky byly inkubovány po dobu čtyř dnů při 37 °C v atmosféře 5 % CO2. Infekce vily byla vyhodnocena ze záznamů cytopatického účinku (CPE). Nakonec byly vypočteny titry virů za použití Reed-Muenchovy metody. Byly zaznamenány titry čtyř virů získaných z kontrolních virů a z chráněných vakeín a srovnány z hlediska ztráty viru během ochrany. Výsledky ukazuje tabulka 9.
Tabulka 9:
přežití (%) po ochraně | ||||
Ochranný roztok | BRSV | IBR | BVD | Ph |
sacharóza:MAG (2:1) | . 115.0 | 12.6 | 97.7 | 105.0 |
sacharóza:MAG (4:1) | 63.1 | 7.4 | 372 | 85.1 |
sacharóza:rafinóza (5:2) | 44.7 | 4.6 | 77.6 | 34.7 |
*9 ···· ·· 99 • 9 9 9 • 9 • 99 9999
9 9 • 99
9999
Příklad 10:
Byl připraven a z hlediska stability testován prostředek chráněná luciferáza (Sigma # L-9560) suspendovaný v perfiuorodekalinu. Lyofilizovaná luciferáza(lmg)byla rozpuštěna v 1 ml 0,lm Tris pufru o pH 7,4 obsahujícího 1 g/ml BSA. Vzniklý roztok luciferázy o koncentraci 1 mg/inl byl dialyzován v 500 ml O,1M Tris pufru o pH 7,4 obsahujího 1 mg/ml BSA při teplotě 4 °C po dobu 3,5 hodiny. Dialyzovaná luciferáza byla převedena do do ky vet pro mikrocentrifugu a koncentrace luciferázy byla vypočtena s použitím následující rovnice.
pg původní luciferázy koncentrace luciferázy --------------------------------------konečný objem dialyzované luciferázy (ml)
Ochranná směs Byla připravena smícháním 500 μϊ dialyzované luciferázy (1 pg/μ) s 99,5 g 50% ochranného roztoku (sacharóza: MSG, 10 :1). Ochranná směs pak byla navážena do devíti sterilních lOOml sérových ampulí v množství 10 ± 0,05 g na ampuli. Zbývající dialyzovaná luciferáza byla alikvotně rozdělena do dvaceti ky vet pro mikrocenlrifugu, 20 pg do každé a uchová vána při -80 °C pro další použití jako standardní luciferáza. Vzorky ochranné směsi byly sušeny při 20 °C po dobu 4,5 hodiny, pak při 45 °C po dobu 60 hodin, pak při 60 °C po dobu 8 hodin a pak při 65 °C po dobu 16,5 hodiny. Pak byly vzorky zazátkovány ve vakuu. Ampule byly přemístěny do suché místnosti (okolní relativní vlhkost “14 %). Ampule byly otevřeny a suché pěny seškrabány do mlecí baňky. Tyto pěny byly jemně umlely. Vzniklý prášek byl navážen do sterilních ampulí a to 1,07 až 1,11 g/ampule. Pak byly do každé ampule přidány 2 ml perfiuorodekalinu (Aldrich # p-990-0) a ampule byly uzavřeny v suchém prostředí a umístěny do inkubátoru na 37 °C.
9» «9 «9*9
99
9 9 9
9 9
9 9 9 f 99 9999 v
Činidlo na stanovení luciferázy a PBS obsahující 1 mg/ml BSA bylo temperováno do vyrovnání teplot alespoň 30 minut při teplotě místnosti. Pak bylo k mletému vzorku (lpg/ml) přidáno 9,42 ml PBS obsahujícího 1 ing/ínl BSA a promícháno. 1 pg/ml tohoto roztoku bylo použito pro přípravu série ředění s faktorem 10 za účelem získání konečné koncentrace 1x105 pg/ml.Reakční směs byla připravena smícháním 100 μΐ vytemperovaného činidla pro stanovení luciferázy s 20 μΐ zředěné luciferázy. Reakční směs byla pak umístěna do luminometru a bylo měřeno produkované světlo každých 10 sekund po dobu 1 minuty. Relativní světelná jednotka za sekundu (RLU/s) byla vynesena do grafu proti relativní koncentraci enzymu (pg/ml).
Mletý vzorek luciferázy v períluordekalinu byl stanovován v každém čase, standardní vzorek luciferázy byl stanoven jako kontrola. Bylo provedeno standardní stanovení luciferázy při prvním ředění 1; ampule substrátu pro stanovení luciferázy s 10 ml pufru pro stanovení luciferázy a temperovány do vyrovnání teplot při teplotě místnosti po dobu alespoň 30 minut. Pak byla připravena série standardních ředění luciferázy při faktoru 10 od počáteční koncentrace až k získání koncentrace v rozmezí 1x10'5 pg/ml až 1 pg/mLReakění směs byla připravena smícháním 100 pl vytemperovaného činidla pro stanovení luciferázy s 20 μΐ zředěné lusiferázy. Reakční směs byla umístěna do luminometru a bylo měřeno produkované světlo každých 10 sekund po dobu 1 minuty. Relativní světelná jednotka za sekundu (RLU/s) byla vynesena do grafu proti relativní koncentraci enzymu (pg/ml). Aktivita mleté luciferázy v períluorodekalinu byla pak srovnána s aktivitou standardní luciferázy. Výsledky ukazuje obrázek 6.
Příklad 11:
Bakteriální kmen Lactobacillus aeidophilus byl pěstován ve fennentoru o kapacitě dva litry za podmínek podle standardního protokolu specifického pro tento druh. Hustota populace buněk fennentoru byla vypočtena na 8,1 V 0,73 • 00 00 0 0 · 0
Ml* ·· « 0 0 • · » 0 0 0000000 0 0 0 x 10s. Buňky byly sklizeny centrifugací, Čímž bylo získáno 200 ml buněčného koncentrátu s hustotou populace buněk 7,83 V 0,75 χ 109. Buněčný koncentrát byl zředěn v 800 ml ochranného roztoku s 40 % sacharózy, 10 % methyl a-d-glukopyranosidu rozpuštěného v 50% pufru (hmotnostní %). Vzniklá směs byla plněna do polyethylenových pytlů od Petriho misek po 300 ml. Zbytek byl uschován pro další použití. Prázdný polyethylenový pytel byl připojen k upínadlu umístěném uvnitř cylindrické skleněné komory velikosti 4,5 x 19,0 palců (tj. 11,43 x 48,26 cm) podepřené hliníkovým rámem. Tato skleněná komora sloužila jako velkoobjemová sušící komora pro ochranu tvorbou pěny. Testovací roztok byl plněn do polyethylenového pytle pomocí kusu silikonové hadice. Skleněná komora byla též opatřena skleněným vodním pláštěm podél celé délky hadice. Plášť byl spojen s recirkulační temperovanou vodní lázní. Vodní plášť sloužil při procesu jako zdroj vytápění. Skleněná komora byla připojena u vypoušlěcího konce ke kondenzátorů lyofilizaěního zařízení, za účelem ukončení procesu ochrany tvorbou pěny byl systém vakua přerušen suchým dusíkem. Pytel byl vyjmut a byly provedeny zkoušky. Byla připravena suchá, mechanicky stabilní, křehká pěna. Materiál byl za použití malého ručního lisu opatrně rozdrcen až na částice s konzistencí písku. Pytel byl otevřen proříznutím a jeho obsah byl převeden do čisté nádoby. Z nádoby byl odebrán trojnásobný vzorek. Nádoba byla pak pročištěna suchým dusíkem a zaplombována. Vzorky byly kultivovány a buněčné populace byly srovnány s kontrolní kulturou 1 ml sušeného Lactobacillus acidophilus sušeného pěnovým způsobem v lOml ampulíeh stejným postupem. Výsledky, které ukazují přežití zkoušeného bakteriálního kmene jsou stimuly v tabulce 10.
Tabulka 10:
Původ vzorku | Počítání z ; destičky průměr | Počítání z destičky std.odch. | Stanovená hmotnost (g) | Objem rozpouš- tědla (ml) | Aktivita (buňek/g) | Průměrná vzorek | % přeživší virů . Kontrolní ampule | ;h |
Bag A | 1.21E+09 | 0.91E+07 | 0.2415 | 2.4 | 1.21E+09 | 1.12E+09 | 92.50 | |
Bag A | J.09E+09 | 1.05E+08 | 0.3366 | 3.4 | 1.09E+09 | 83.10 | ||
Bag A | 1.07E+09 | 1.07E+08 | 0.1848 | 1.8 | 1.07E+09 | 81.32 |
99 ·· · 9
9 • · • O 9 ·»· 9
9 9
9
99
9 9 9
9 « »9 9999
Modifikace výše uvedených technik provádění různých provedení podle tohoto vynálezu bude zřejmé odborníkům v oboru, kteří se budou řídit instrukcemi podle tohoto vynálezu, jak jsou zde dále uvedeny. Výše popsané příklady nejsou nikterak limitující, ale jedná se pouze o typické příklady tohoto vynálezu, jehož oblast je definována následujícími nároky.
Claims (38)
- PATENTOVÉ NÁROKY
<» 99 9» 9·*· *9 99 ·· e r 9 · * • • • < 9 · • > 9 9 9 • 9 • 9 • · · • 9 9 1 *9 ···« 9 99 »·*· 1. Ochranná směs vyznačující se tím, že obsahuje:virus, bakterii nebo jinou buňku, která je citlivá na ztrátu životaschopnosti během sušení a skladování při teplotě okolí a nebo při vyšších teplotách, neredukující methylovaný monosacharid a alespoň jeden přídavný ocíiranný prostředek vybraný ze skupiny obsahující neredukující disacharidy, neredukující oligosacharidy, neredukující deriváty disacharidů, neredukující deriváty oligosacharidů, proteiny, polymerieké ochranné látky a sodnou sůl kyseliny glutamové (TvíSG). - 2. Ochranná směs podle nároku 1 vyznačující se tím, že ochranná směs má celkovou hmotnost rozpuštěné látky a neredukující methylovaný monosacharid v ní tvoří asi mezi 5 a 80 hmotnostními % celkové hmotnosti rozpuštěné látky.
- 3. Ochranná směs podle nároku 1 vyznačující se tím, že neredukující inethylovaný monosacharid tvoří asimezi 20 a 60 hmotnostními % celkové hmotnosti rozpuštěné látky.
- 4. Ochranná směs podle nároku 1 vyznačující se tím, že neredukujícím methylovaným monosacharidem je methyl (a nebo p)-d-giukóza.
- 5. Ochranná směs podle nároku 1 vyznačující se tím, že neredukujícím dísaeharidem je sacharóza nebo trehalóza.
- 6. Ochranná směs podle nároku 1 vyznačující se tím, že protein je vybraný ze skupiny obsahující želatinu, albumin, pšeničný albumin nebo globulin a stresový protein.
- 7. Ochranná směs podle nároku 1 vyznačující se tím, že polymeriekou ochrannou látkou je HES, PVP, cyklodextrin a PEG.
- 8. Ochranná směs podle nároku 1 vyznačující se tím, že proteinem může být jakýkoli protein, který je stabilní ve vodném prostředí při teplotě vyšší než asi 50 °C a pH vyšší než asi 9 nebo nižší než asi 5.
- 9. Ochranná směs podle nároku 1 vyznačující se tím, že koncentrace proteinu je vyšší než asi 3 hmotnostní %.
- 10. Ochranná směs podle nároku 9 vyznačující se tím, že koncentrace proteinu je vyšší než asi 10 lunotnostních %.
- 11. Ochranná směs podle nároku 1 vyznačující se tím, že ochranná směs má celkovou hmotnost rozpuštěné látky a kde MSG tvoří asi mezi 5 a 80 Innotnoslními % celkové hmotnosti rozpuštěné látky.
- 12. Ochranná směs podle nároku 11 vyznačující se tím, že MSG tvoří asi mezi 20 a 60 hmotnostními % celkové hmotnosti rozpuštěné látky.
- 13. Ochranná směs podle nároku 1 vyznačující se tím, že ochranná směs má celkovou hmotnost rozpuštěné látky a neredukující disacharid v ní tvoří asi mezi 5 a 80 hmotnostními % celkové hmotnosti rozpuštěné látky.
- 14. Ochrana látka podle nároku 13 vyznačující se tun, že neredukující disacharid tvoří asi mezi 20 a 60 hmotnostními % celkové hmotnosti rozpuštěné látky.
- 15. Ochranná směs podle nároku 1 vyznačující se tím, že ochranná směs má celkovou hmotnost rozpuštěné látky a neredukující oligosacharid v ní tvoří asi mezi 5 a 80 hmotnostními procenty celkové hmotnosti rozpuštěné látky.
- 16. Ochranná směs podle nároku 15 vyznačující se tím, že neredukující oligosacharid tvoří asi mezi 20 a 60 hmotnostními % celkové hmotnosti rozpuštěné látky.
- 17. Ochranná směs podle nároku 1 vyznačující se tím, že oligosacharid není rafínóza.
- 18. Ochranná směs podle nároku 1 vyznačující se tůn, že ochranná směs je tvořena tak, aby nekrystaíizovala během sušení a následného skladování po dobu alespoň dvou týdnů.
- 19. Způsob ochrany virů, bakterií nebo jiných buněk, které jsou citlivé na ztrátu životaschopnosti během sušení a skladování při teplotě okolí ne • · ft · · · • · bo pří vyšších teplotách vyznačující se tím, že tento způsob obsahuje: smíchání viru, bakterie nebo jiné buňky s ochrannou látkou obsahující neredukující methylovaný monosacharid a alespoň jednu přída vnou sloučeninu vybranou ze skupiny obsahující neredukující disacharidy, neredukující oligosacharidy, nereredukující deriváty disacharidů, neredukující deriváty oligosacharidů, proteiny, polymerické ochranné látky a sodnou sůl kyseliny glutamové (MSG) za účelem vytvoření ochranné směsí a sušení ochranné směsi, ve které zůstane zachována alespoň část životaschopnosti viru, bakterie nebo jiné buňky během procesu sušení a následného skladování při teplotě okolí nebo při vyšších skladovacích teplotách.
- 20. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že uvedený virus, bakterie nebo jiná buňka obsahuje ještě vakeínu nebo vektor.
- 21. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že uvedeným methy lovaným monosacharidem je methyl (a nebo P)-d-glukóza.
- 22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že sušení je provedeno lyofiližací, vysoušením, sprejovým sušením, sušením v kapalné vrstvě, sušením ve vakuu, sušením v suché atmosféře a sušením tvorbou pěny.
- 23. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že ochranná směs má celkovou hmotnost rozpuštěné látky a neredukující methylovaný monosacharid v ní tvoří asi mezi 5 a 80 hmotnostními % celkové hmotnosti rozpuštěné látky.
- 24. Způsob podle nároku 23 vyznačující se tím, že neredukující methylovaný monosacharid tvoří asi mezi 20 a 60 hmotnostními % celkové hmotnosti rozpuštěné látky.
- 25. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že neredukujícím disacharidem je sacharóza a trehalóza.
- 26. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že protein je vybrán ze skupiny obsahující želatinu, albumin, pšeničný albumin nebo globuiin a stresový protein.
- 27. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že polyrneriekou ochrannou látkou je HES, PVP, cykiodextrin a PEG.
- 28. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že proteinem může být jakýkoli protein, který je stabilní ve vodném prostředí při teplotě vyšší než 50 °C a při pH vyšším než asi 9 nebo nižším než asi 5.
- 29. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že koncentrace proteinu je vyšší než asi 3 hmotnostní %.
- 30. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že koncentrace proteinu je vyšší než asi 10 hmotnostních %.
- 31. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že ochranná směs má celkovou hmotnost rozpuštěné látky a MSG v ní tvoří asi mezi 5 a 80 hmotnostními % celkové hmotnosti rozpuštěné látky.
- 32. Způsob podle nároku 31 vyznačující se tím, že MSG vněm tvoří asi mezi 20 a 60 hmotnostními % celkové hmotnosti rozpuštěné látky.
- 33. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že ochranná směs má celkovou hmotnost rozpuštěné látky a neredukující disacharid v ní tvoří asi mezi 5 a 80 hmotnostními % celkové hmotnosti rozpuštěné látky.
- 34. Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že neredukujíeí disacharid v něm tvoří asi mezi 20 a 60 hmotnostními % celkové hmotnosti rozpuštěné látky.
- 35. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že ochranná směs má celkovou hmotnost rozpuštěné látky a neredukující oligosacharidy v ní tvoří asi mezi 5 a 80 hmotnostními % celkové hmotnosti rozpuštěné látky.
- 36. Způsob podle nároku 35 vyznačující se tím, že neredukující oligosacarid tvoří asi mezi 20 a 60 hmotnostními %celkové hmotnosti rozpuštěné látky.
- 37. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že oligosacharid není rafinóa.
- 38. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že ochranná směs je tvořena tak, aby nekrystalizovala během sušení a následného skladování alespoň42.43.44.45.46.47.48.po dobu dvou týdnů.Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že v něm je alespoň jednou přídavnou sloučeninou sacharóza a v němž je poměr sacharózy k methyl (a nebo 3)-d-glukóze asi mezi 4 :1 až asi 1 :2,Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že alespoň jedna přídavná sloučenina zahrnuje sacharózu a MSG a v němž je poměr sacharózy k MSG asi mezi 10 :1 až 1 :4.Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že míšení ještě obsahuje alespoň dva kroky zahrnující dávkování viru, bakterie nebo jiné buňky s neredukujíctm methylovaným monosaeharidem a pak přídavek alespoň jedné z přídavných sloučenin za účelem vytvoření ochranné směsi.Způsob podle nároku 41 vyznačující se tím, že dávkování je dosaženo vyvážením viru, bakterie nebo jiné buňky v roztoku obsahujícím neredukujíeí melhylovaný monosaeharid.Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že obsahuje ještě krok sekundárního sušení.Způsob podle nároku 43 vyznačující se tím, že uvedené sekundární sušení je provedeno při teplotě v rozmezí 0 až 100 °C.Způsob podle nároku 44 vyznačující se tím, že uvedené sekundární sušení se nechá pokračovat tak dlouho, dokud teplota zesklovatění nestoupne nad vybranou skladovací teplotu v rozmezí 0 až 40 °C.Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že uvedený krok sušení obsahuje vaření ve vakuu za účelem vytvoření stabilní pěny.Způsob podle nároku 46 vyznačující se tím, že dále obsahuje krok mletí uvedené stabilní pěny za účelem vytvoření prášku.Způsob podle nároku 47 vyznačující se tím, že dále obsahuje krok sekundárního sušení uvedeného prášku.Způsob ochrany viru, bakterie nebo jiné buňky citlivé na ztrátu životaschopnosti během sušení a skladování při teplotě okolí a při vyšších tep45 lotách vyznačující se tím, že tento způsob obsahuje:míšení viru, bakterie nebo jiné buňky s ochrannou látkou obsahující neredukující monosacharid a alespoň jednu přídavnou sloučeninu vybranou ze skupiny zahrnující neredukující dísacharidy, neredukující oíigosachacharidy, neredukující deriváty disacharidů, neredukující deriváty oligosasacharidů, proteiny, polymerické ochranné látky a sodnou sůl kyseliny glutamové (MSG) za účelem vytvoření ochranné směsi a sušení ochranné směsi varem ve vakuu za účelem vytvoření stabilní pěny v níž ie alespoň část životaschopnosti viru, bakterie nebo jiné buňky zůstane zachována během procesu sušení a během následného skladování při teplotě okolí a při vyšších teplotách.50. Způsob podle nároku 49 vyznačující se tím, že uvedeným neredukujícím monosaeharidem je methylovaný monosacharid.51. Způsob podle nároku 50 vyznačující se tím, že uvedený methylovaný rnonosacharid je methyl (a nebo p)-d-glukóza.52. Způsob podle nároku 49 vyznačující se tím, že ještě před vařením obsahuje krok koncentrování uvedeného viru, bakterie nebo jiné buňky odpařováním z Částečně zmrazeného stavu.53. Způsob podle nároku 49 vyznačující se tím, že ještě před vařením obsahuje krok koncentrování uvedeného viru, bakterie nebo jiné buňky pomocí reverzní osmózy.54. Způsob podle nároku 49 vyznačující se tím, že ještě obsahuje krok sekundárního sušení uvedené stabilní pěny při teplotě v rozsahu 0 až 100 °C.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US16692899P | 1999-11-22 | 1999-11-22 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ20021835A3 true CZ20021835A3 (cs) | 2002-11-13 |
Family
ID=22605249
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ20021835A CZ20021835A3 (cs) | 1999-11-22 | 2000-11-22 | Ochranná směs a způsob ochrany viru, bakterie a jiné buňky citlivé na ztrátu ľivotaschopnosti během suąení a skladování |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1231837B1 (cs) |
JP (1) | JP2003514556A (cs) |
KR (1) | KR100777349B1 (cs) |
CN (1) | CN1237873C (cs) |
AT (1) | ATE363826T1 (cs) |
AU (1) | AU780602B2 (cs) |
BR (1) | BR0015738A (cs) |
CA (1) | CA2391379A1 (cs) |
CZ (1) | CZ20021835A3 (cs) |
DE (1) | DE60035125T2 (cs) |
HU (1) | HUP0203307A2 (cs) |
IL (2) | IL149778A0 (cs) |
MX (1) | MXPA02005115A (cs) |
WO (1) | WO2001037656A2 (cs) |
Families Citing this family (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2001281614A1 (en) * | 2000-08-07 | 2002-02-18 | Aventis Pasteur Limited | Stabilization of immunogens derived from paramyxoviruses |
JP2006509513A (ja) * | 2002-12-13 | 2006-03-23 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | 微生物の乾燥のための方法およびデバイス |
GB0230152D0 (en) * | 2002-12-24 | 2003-02-05 | Sinvent As | Product |
CA2470765A1 (fr) * | 2004-06-10 | 2005-12-10 | Pierre-Philippe Claude | Methode de conditionnement de formulations microbiennes |
GB2416122A (en) | 2004-07-12 | 2006-01-18 | Ipsen Ltd | Botulinum neurotoxin composition |
US8137677B2 (en) | 2005-10-06 | 2012-03-20 | Allergan, Inc. | Non-protein stabilized clostridial toxin pharmaceutical compositions |
US8168206B1 (en) | 2005-10-06 | 2012-05-01 | Allergan, Inc. | Animal protein-free pharmaceutical compositions |
AU2013202329B2 (en) * | 2005-10-06 | 2016-04-14 | Allergan, Inc. | Non-protein stabilized clostridial toxin pharmaceutical compositions |
KR100802905B1 (ko) * | 2007-02-21 | 2008-02-13 | 김주태 | 인간 적혈구가 고농도 당에 노출되었을 때 발생하는단백질의 당화 현상과 지질의 과산화 현상에 의한 세포손상을 최소화하는 방법 |
US20090053806A1 (en) * | 2007-08-22 | 2009-02-26 | Deirdre Daniels | Coating solution and method for capturing and preserving biological materials |
CN102223788A (zh) * | 2008-10-22 | 2011-10-19 | 由卫生福利和体育大臣代表的荷兰王国 | 保存混合物及其用途 |
SG172812A1 (en) | 2008-12-31 | 2011-08-29 | Revance Therapeutics Inc | Injectable botulinum toxin formulations |
KR102328155B1 (ko) | 2009-06-25 | 2021-11-17 | 레반스 테라퓨틱스, 아이엔씨. | 알부민불포함 보툴리눔 독소 제제 |
JP5548436B2 (ja) * | 2009-12-17 | 2014-07-16 | 株式会社林原 | 血液寒天培地及びその保存方法 |
CA2806734A1 (en) | 2010-07-26 | 2012-02-09 | Biomatrica, Inc. | Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
EP2598660B1 (en) | 2010-07-26 | 2017-03-15 | Biomatrica, INC. | Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
KR101949270B1 (ko) | 2010-11-30 | 2019-02-19 | (주)아모레퍼시픽 | 펩타이드 또는 단백질 안정화제 |
WO2013185941A1 (en) * | 2012-06-13 | 2013-12-19 | Clextral | Method for the production of a porous powder product containing a probiotic or other microorganisms |
EP3007556B1 (en) * | 2013-06-13 | 2020-05-20 | Biomatrica, INC. | Cell stabilization |
EP3154338B1 (en) | 2014-06-10 | 2020-01-29 | Biomatrica, INC. | Stabilization of thrombocytes at ambient temperatures |
WO2017060329A1 (en) * | 2015-10-06 | 2017-04-13 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods for preventing plastic-induced degradation of biologicals |
CN108700498B (zh) | 2015-12-08 | 2021-07-13 | 生物马特里卡公司 | 降低红细胞沉降速率 |
JP7217700B2 (ja) | 2016-09-13 | 2023-02-03 | アラーガン、インコーポレイテッド | 安定化非タンパク質クロストリジウム毒素組成物 |
CN106857505B (zh) * | 2017-03-16 | 2020-12-29 | 河南省济源白云实业有限公司 | 一种昆虫核型多角体病毒干悬浮剂及其制备方法 |
CN106857680B (zh) * | 2017-03-16 | 2020-05-05 | 河南省济源白云实业有限公司 | 一种颗粒体病毒干悬浮剂及其制备方法 |
CN107232183A (zh) * | 2017-07-10 | 2017-10-10 | 薛松果 | 卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液及使用方法 |
CN108279302B (zh) * | 2017-07-11 | 2020-05-26 | 深圳市伯劳特生物制品有限公司 | 一种用于酶联免疫试剂盒的组合物以及幽门螺旋杆菌抗体谱检测试剂盒及其制备方法 |
CN114318865B (zh) * | 2021-12-30 | 2022-12-27 | 江南大学 | 一种羊毛预处理液及其应用 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB799644A (en) * | 1955-01-19 | 1958-08-13 | Commonweath Scient And Ind Res | Method for the dried storage of micro-organisms |
IL30448A (en) * | 1967-08-02 | 1972-06-28 | Diagnostic Data Inc | Protein metal chelate composition stabilized with saccharide,and preparation thereof |
GB9010742D0 (en) * | 1990-05-14 | 1990-07-04 | Quadrant Bioresources Ltd | Stabilization of biological macromolecular substances |
US5200399A (en) * | 1990-09-14 | 1993-04-06 | Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. | Method of protecting biological materials from destructive reactions in the dry state |
JPH05290765A (ja) * | 1992-04-09 | 1993-11-05 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 平板型画像表示装置 |
JPH09118091A (ja) * | 1995-10-25 | 1997-05-06 | Yasuo Aoki | ルースリーフ綴具 |
DE69735600T2 (de) * | 1997-11-26 | 2007-01-25 | Universal Preservation Technologies, Inc., San Diego | Konservierung empfindlicher biologischer proben durch verglasung |
US6306345B1 (en) * | 1998-05-06 | 2001-10-23 | Universal Preservation Technologies, Inc. | Industrial scale barrier technology for preservation of sensitive biological materials at ambient temperatures |
-
2000
- 2000-01-22 IL IL14977800A patent/IL149778A0/xx active IP Right Grant
- 2000-11-22 EP EP00980766A patent/EP1231837B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-22 MX MXPA02005115A patent/MXPA02005115A/es active IP Right Grant
- 2000-11-22 AT AT00980766T patent/ATE363826T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-11-22 CA CA002391379A patent/CA2391379A1/en not_active Abandoned
- 2000-11-22 CN CNB008179026A patent/CN1237873C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-22 BR BR0015738-4A patent/BR0015738A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-11-22 AU AU17986/01A patent/AU780602B2/en not_active Ceased
- 2000-11-22 JP JP2001539285A patent/JP2003514556A/ja active Pending
- 2000-11-22 CZ CZ20021835A patent/CZ20021835A3/cs unknown
- 2000-11-22 WO PCT/US2000/032261 patent/WO2001037656A2/en active IP Right Grant
- 2000-11-22 DE DE60035125T patent/DE60035125T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-22 KR KR1020027006561A patent/KR100777349B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-11-22 HU HU0203307A patent/HUP0203307A2/hu unknown
-
2002
- 2002-05-21 IL IL149778A patent/IL149778A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU780602B2 (en) | 2005-04-07 |
MXPA02005115A (es) | 2003-09-25 |
WO2001037656A2 (en) | 2001-05-31 |
ATE363826T1 (de) | 2007-06-15 |
JP2003514556A (ja) | 2003-04-22 |
KR20020075372A (ko) | 2002-10-04 |
DE60035125D1 (de) | 2007-07-19 |
KR100777349B1 (ko) | 2007-11-20 |
IL149778A (en) | 2007-06-17 |
CN1420721A (zh) | 2003-05-28 |
WO2001037656A3 (en) | 2002-01-10 |
AU1798601A (en) | 2001-06-04 |
IL149778A0 (en) | 2002-11-10 |
HUP0203307A2 (hu) | 2003-01-28 |
CA2391379A1 (en) | 2001-05-31 |
DE60035125T2 (de) | 2008-02-07 |
EP1231837A2 (en) | 2002-08-21 |
EP1231837B1 (en) | 2007-06-06 |
BR0015738A (pt) | 2003-04-15 |
CN1237873C (zh) | 2006-01-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ20021835A3 (cs) | Ochranná směs a způsob ochrany viru, bakterie a jiné buňky citlivé na ztrátu ľivotaschopnosti během suąení a skladování | |
US6872357B1 (en) | Formulation of preservation mixtures containing sensitive biologicals to be stabilized for ambient temperature storage by drying | |
US6071428A (en) | Stable compositions | |
US7153472B1 (en) | Preservation and formulation of bioactive materials for storage and delivery in hydrophobic carriers | |
US9469835B2 (en) | Preservation by vaporization | |
JP4502406B2 (ja) | 乾燥発泡ガラスマトリックス内に物質を安定に配合する方法及びそれによって得られた組成物 | |
AU2007231918B2 (en) | Preservation of bioactive materials by freeze dried foam | |
US20080152673A1 (en) | Desiccated Product | |
TWI398272B (zh) | 化學定義的安定劑 | |
US6294365B1 (en) | Method and formulation for stabilization of enzymes | |
US8617576B2 (en) | Preservation of bioactive materials by freeze dried foam | |
JP4889602B2 (ja) | 生物学的物質用の保存及び貯蔵媒体 | |
JP2002542815A (ja) | ウイルスおよびマイコプラズマの保存方法 | |
US20110064723A1 (en) | Formulation for room temperature stabilization of a live attenuated bacterial vaccine | |
WO2001037804A2 (en) | Preservation and formulation of bioactive materials |