KR100777349B1 - 민감한 생물학적 물질의 보존방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 민감한 생물제제, 바이러스, 세균 및 진핵 세포를 건조에 의하여 보존하는 제형 및 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 바이러스 또는 세포, 및 보호제(protectant)를 함유한 보존 혼합물(preservation mixture)에 관한 것으로, 이때, 전기 혼합물은 탈수 및, 이후의 실온 및 그 이상의 온도에서 저장시 전기 시료들을 안정화시키도록 되어 있다.
보존 혼합물(preservation mixture), 유리전이온도(glass transition temperature), 1차 건조, 안정 건조/유리화
Description
본 발명은 민감한 생물제제, 바이러스, 세균(bacteria) 및 진핵 세포를 건조시켜 보존하는 제형(formulation) 및 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 바이러스 또는 세포, 및 보호제(protectant)를 함유한 보존 혼합물(preservation mixture)에 관한 것으로, 이때, 전기 혼합물은 탈수 및, 이후의 실온 및 그 이상의 온도에서 저장시 전기 시료들을 안정화시키도록 되어 있다.
민감한 생체분자(biomolecule), 바이러스, 세균, 벡터(vector), 진핵 세포 및 작은 다세포 표본은, 예로서 인간 및 수의 약제, 예방접종 및 백신, 분자 생물학, 유전자 치료, 및 식품 산업계 등에서 광범위하게 사용된다. 일반적으로, 전기 생활성(bioactive) 물질, 바이러스 및 세포들은 수성(aqueous) 환경에서 활성을 갖는다; 따라서, 이러한 시료들에 대하여 종래에는 수성 용액에서 제제화하였다. 그러나, 많은 생활성 물질, 특히 바이러스 및 세포들은 특히나 실온 또는 그 이상의 온도에서는 수용액에서 분해되거나 및 활성 및/또는 생존력을 잃어버리기 쉽다 따 라서, 이러한 시료들은 종종 냉장(refrigeration)을 요하거나, 또는 실온 하에서 짧은 유통기한(shelf)을 갖는다.
생활성 물질, 바이러스 및 세포들은 당업계에 알려진 많은 화학적 작용을 통하여 분해될 수 있다. 물은 거의 모든 이러한 분해 경로에서의 반응물이다. 나아가, 물은 가소제(plasticizer)로 작용하는데, 이는 단백질이 풀리거나(unfolding) 및 응집(aggregation)되게 한다. 물은 거의 모든 분해 경로에 참여하기 때문에, 그 수용액을 제거하거나 생활성 물질, 바이러스 및 세포들을 건성 분말(dry powder)에 현탁하는 것은 이러한 시료들의 안정성을 강화시키는 대안적인 제제 방법론을 제공한다. 바이러스 및 세포들은 동결 건조(freezing-drying), 거품 건조(foam-drying), 분무 건조(spray-drying) 및 탈수(desiccation) 등의 다양한 방법을 통하여 건조될 수 있다. 생체분자, 바이러스 및 세포의 수성 용액은 건조되어 사용되기 전까지 건성 분말로 저장된다.
탈수외에, 유리화(vitrification)는 민감한 생체분자, 바이러스 및 세포를 보존(안정화)하는 또다른 중요한 접근법이다. 유리화는 극저온(cryogenic) 상태(냉동)하의 수성 환경으로 뿐만 아니라, 실온의 건조 상태로도 이루어질 수 있다. 건조 상태에서의 실온 안정성은 저장의 편리성 및 경제성, 운송, 배달 선택사항의 유연성, 긴급 상황에의 적용성 및 제3세계 국가들에의 접근성 등의 여러가지 이유로 극히 바람직하다. 따라서, 생체분자, 바이러스 및 세포를 건조 상태로 유리화하는 것은 특히나 바람직하다. 그러나, 보호되지 않은 생체분자, 바이러스 및 세포를 건조시키는 것은, 이러한 시료들을 냉동하는 것과 마찬가지로 매우 손상을 입 힐 수 있다. 따라서, 생체분자, 바이러스 및 세포를 그 활성 또는 생존력 상실을 최소화하면서 탈수 및 유리화할 수 있는 보존 혼합물을 개발하여야 할 필요성이 있다.
발명의 요약
본 발명은 건조시 및, 실온 또는 그 이상의 온도에서 저장시 활성 또는 생존력을 잃어버리기 쉬운 생물제제, 비환원성(non-reducing) 단당 유도체, 및 비환원성 이당, 비환원성 올리고당, 비환원성 이당 유도체, 비환원성 올리고당 유도체, 단백질, 고분자 보호제(polymeric protectant) 및 글루탐산의 모노나트륨 염(MSG)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 부가적인 보호제를 포함한 보존 혼합물에 관한 것이다.
바람직한 한 양태로, 전기 보존 혼합물에서 전기 생물제제는 민감한 생물 분자, 바이러스, 세균(bacteria), 기타 원핵 세포, 및 진핵 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
전기 보존 혼합물은 어떤 총 용질 질량(total solute mass)을 가진다. 한가지 실시태양에서, 전기 변형된(modified) 비환원성 단당 유도체는 대략 5% 내지 80% 중량(wt)% 사이의 총 용질 질량으로 구성된다. 좀 더 바람직하게는, 전기 변형된 비환원성 단당 유도체는 대략 20% 내지 60% 중량% 사이의 총 용질 질량으로 구성된다.
본 발명의 한 바람직한 실시태양에 따른 보존 혼합물은 메틸화된 (methylated) 단당이다. 좀 더 바람직하게는, 전기 메틸화된 단당은 메틸 α-글루코피라노시드(methyl α-glucopyranoside) 또는 메틸 β-글루코피라노시드(methyl β-glucopyranoside)이다.
전기 보존 혼합물이 비환원성 이당을 함유하는 경우에, 그것은 슈크로스(sucrose) 또는 트레할로스(trehalose)이다. 전기 보존 혼합물에 함유된 단백질은 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 유장(whey) 알부민 또는 글로불린(globulin), 및 스트레스 단백질(stress protein)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 한가지 실시태양에서, 전기 단백질은 대략 50℃ 이상의 온도, 및 대략 9 이상 또는 대략 5 이하의 pH의 수성 매질(medium)에서 안정한 단백질은 어느 것이라도 가능하다. 바람직하게는, 전기 단백질의 농도는 약 3 중량% 이상이고, 좀 더 바람직하게는, 약 10 중량% 이상이다. 본 발명의 한가지 실시태양에 따라 사용되는 고분자 보호제는 HES, PVP, 사이클로덱스트린(cyclodextrin) 및 PEG로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
MSG, 비환원성 이당, 및/또는 비환원성 올리고당이 전기 보존 혼합물에 함유된 경우에, 이 부가적인 보호제들은 대략 5% 내지 80% 중량(wt)% 사이의 총 용질 질량으로 구성되며, 좀 더 바람직하게는, 대략 20% 내지 60% 중량% 사이의 총 용질 질량으로 구성된다. 올리고당이 전기 보존 혼합물에 이용된 경우에, 본 발명의 한가지 실시태양에서는 이들은 바람직하게는 라피노스(raffinose)가 아니다.
전기 보존 혼합물은 바람직하게는 건조시, 및 이후의 적어도 두 주 동안의 저장시 결정화되지 않도록 제형된다. 바람직한 제형은 다음을 포함한다: 슈크로스 대 메틸 (α또는 β) 글루코스의 비는 대략 4:1 내지 대략 1:2 사이이고, 슈크로스 대 MSG의 비는 대략 10:1 내지 대략 1:4 사이이다.
본 발명은 또한 건조 및 실온 또는 그 이상의 온도에서 저장시 활성 또는 생존력을 잃어버리기 쉬운 생물제제를 보존하는 방법에 관한 것이다. 전기 방법은 전기 생물제제를 어떤 변형된 비환원성 단당 유도체로 구성된 보호제 및, 비환원성 이당, 비환원성 올리고당, 비환원성 이당 유도체, 비환원성 올리고당 유도체, 단백질, 고분자 보호제 및 글루탐산의 모노나트륨 염(MSG)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 부가적인 화합물과 혼합하여 (상술한 바처럼) 어떤 보존 혼합물을 형성시키는 단계; 및, 전기 보존 혼합물을 건조시키는 단계(이때, 전기 생물제제의 활성 또는 생존력의 적어도 일부분이 건조 과정 및, 이후의 실온 또는 그 이상의 저장 온도에서의 저장시 보유되어 있다)로 구성되어 있다. 이 방법은 바이러스, 세균, 기타 원핵 세포, 및 진핵 세포의 보존에 대하여 매우 적합하다.
기술된 전기 방법은 동결 건조, 탈수, 분무 건조, 유동층 건조(fluidized bed drying), 진공에서의 건조(drying in a vacuum), 건조 대기에서의 건조, 및 거품 형성에 의한 건조를 포함한 다양한 건조 방법(protocol)에 대하여 적용가능하다.
전기 기술된 방법의 어떤 변형에서, 혼합하는 단계는, 바이러스 또는 세포에 비환원성 단당 유도체를 적재하는(loading) 단계 및, 그 후 적어도 하나의 부가적인 화합물을 첨가하여 전기 보존 혼합물을 형성시키는 단계를 포함하는 적어도 두 단계를 추가로 포함한다. 적재(loading)는 전기 비환원성 단당 유도체를 함유한 어떤 용액에서 전기 생물제제의 평형(equilibration)에 의하여 이루어진다.
도 1A는 상온(room temperature)에서 저장되는 동안 환원성 및 비환원성 당(sugar)이 ICDH 활성에 미치는 영향을 보여준다.
도 1B는 37℃에서의 저장 동안에 환원성 및 비환원성 당이 ICDH 활성에 미치는 영향을 보여준다.
도 2는 50℃에서의 저장 동안에 환원성 및 비환원성 당이 ICDH 활성에 미치는 영향을 보여준다.
도 3은 50℃에서의 저장 동안에 비환원성 당 및 말트린(maltrin)이 ICDH 활성에 미치는 영향을 보여준다.
도 4는 메틸화된 글루코스의 유리전이온도(glass transition temperature)를 보여준다.
도 5는 메틸 α-d-글루코피라노시드가 스트렙토코커스 에쿠이(Streptococcus equi.)의 보존에 미치는 영향을 보여준다.
도 6은 37℃에서의 저장 동안에 퍼플루오로데칼린(perfluorodecalin) 내의 탈수된 루시페라아제(luciferase)의 안정성이 향상된 것을 보여준다.
A. 정의
여기서 사용된 것으로서, "화학적 안정성(chemical stability)" 및/또는 "보존(preservation)"이라는 용어는, 예를 들어 산화, 가수분해 또는 효소 작용과 같은 화학적 경로에 의한 전기 생물학적 물질의 분해가 허용가능한 수준을 초과하지 않는다는 것을 의미한다.
"민감한 생물제제(sensitive biological)"라는 용어는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 효소 및 조효소(coenzyme), 혈청, 비타민, 항체 및 항체 절편(fragment) 일체를 포함한다. 자연적으로 유래되거나 정제된 부분 및 재조합으로 생성된 부분 둘 다 이 용어에 포함된다. 이 용어는 또한 지단백(lipoprotein) 및, 당부가 단백질(glucosylated protein) 등의 번역후(post-translationally) 변형된 형태를 포함한다. 이 중 어느 것의 유사체(analog), 유도체, 촉진제(agonist), 길항제(antagonist) 및 약학적으로 허용가능한 염도 이 용어에 포함된다. 전기 용어에는 또한, 변형된(modified), 유도된(derivatized) 또는 비자연적으로 발생한 D- 또는 L-형(configuration) 아미노산이 포함된다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 전기 생물제제는 면역 반응을 유도할 수 있는 모든 항원성 물질을 포함한다. 좀 더 구체적으로, 전기 항원은 종양의 세포외 영역(domain) 상의 어떤 단백질 또는 그 절편(예로서, 암치료시에), 알레르기유발항원(allergen), 또는 그들의(예로서, 바이러스 또는 세균) 감염원(infectious agent) 부위일 수 있다. "백신(vaccine)"이라는 용어는 특정한 형태의 면역을 지칭하는데, 이때, 전기 생활성 물질은 어떤 감염원(또는 그것의 어느 부위)이고, 이는 어떤 포유동물에 투여되어 전기 감염원에 의하여 유발되는 감염성 질병에 대한 저항성을 확립시킨다. 백신에는 바이러스, 세균 및 기생체(parasite), 바이러스 입자, 및/또는 단백질 및/또는 핵산을 포함한 바이러스의 어떠한 부분 또는 감염성 질병 유발원 또는 병원체가 있으며, 이들은 면역원성을 갖고 있어서 백신의 제제에 유용하다.
또 다른 양태로, 본 발명은 또한 세포의 형질전환에 유용한 바이러스성, 세균성 및 효모에서 유래한 벡터(vector) 일체를 포함한다. 이러한 벡터들은 분자 생물학 및 유전공학 뿐 아니라 유전자 치료에도 사용될 수 있다. 가장 바람직한 양태에서, "민감한 생물제제"라는 용어는 또한, 어떤 작은 다세포 표본 뿐 아니라, 어떠한 바이러스, 원핵 및 진핵 세포를 포함한다.
"거품 형성에 의한 보존"이라는 어구는 진공 상태하에서 끓임으로써 민감한 생물제제를 건조시키는 측정가능한 방법을 가리키며, 이때, 전기 생물제제는 실온 및 그 이상의 온도에서 더 오랜 기간동안 활성 또는 생존력을 지닌다. 전기 "거품 형성에 의한 보존"이라는 어구에 의한 일체의 특정한 방법론상의 제한점들은 하기 두 부분 (1)1차 거품-건조(Primary Foam-Drying) 및 (2)안정 건조/유리화 편에 상술되어 있으며, 브론슈타인(Bronshtein)의 미국 특허 제 5,766,520호에도 개시되어 있다.
"변형된 비환원성 단당"이라는 용어는 본 발명에 따라 일반적인 당류를 지칭하기 위하여 사용되었다. 전기 변형은 모든 알려진 화학적 변형으로서, 메틸화, 에틸화 및 염소화(chlorinated)된 유도체가 바람직하다. 전기 메틸 유도체는 전기 단당의 α 및 β 형태 둘 다를 포함한다. 따라서, "메틸 (α또는 β) 글루코스"가 사용되었다. 다수의 실시예에서, 한가지 특정한 변형된 비환원성 단당, 메틸 α-d-글루코피라노시드가 사용되었다; 이 화합물은 MAG로 약기되어 왔다.
B. 생물학적 물질의 보존
증가된 온도에서 생물학적 시료를 탈수하는 것은 매우 손상을 입히게 되는데, 특히 예를 들어, 건조를 위한 온도가 적용가능한 단백질 변성 온도보다 더 높을 때 그러하다. 온도 증가와 관련된 시료의 손상을 막기 위하여, 탈수 온도와 탈수 정도를 단계적으로 증가시키거나 또는 동시에 증가시키면서 전기 탈수 과정을 수행할 수 있다. 1차 탈수(primary dehydration)는 생물학적 활성을 잃어버리지 않는 범위에서 탈수가 되도록 충분히 낮은 온도에서 수행되어야 한다. 본 발명에 따른 전기 보존 방법은 브론슈타인의 미국 특허 제 5,766,520호, 및 함께 계류중인 미국 특허 출원 제 08/979,458 및 09/306,137, 09/589,381, 09/194,499 및 09/254,563호, 및 함께 계류중인 미국 임시 출원(Provisional Application) 제 60/149,795, 60/166,928 및 60/161,204호에 개시되어 있다; 그 명세서들의 전문이 이에 참조문헌에 나와있다.
본 발명의 한 바람직한 실시태양으로, 하기의 척도에 기초한 건조 변수들을 선택함으로써 바이러스 또는 세포의 탈수 동안에 그 생물학적 활성 또는 생존력이최대로 유지되게 할 수 있다: (1)탈수되는 내부 및 외부 분자들, 외피(envelop), 막(membrane) 및 기타 생물학적 구조물들은 전기 바이러스 또는 세포에 보호 화합물(protective chemical)을 적재(loading)함으로써 최적으로 보호된다, (2) 적재는 침투(permeating) 보호제를 함유한 적재 용액내에서 바이러스 또는 세포의 평형에 의하여 이루어진다, (3) 전기 보호제가 적재된 바이러스 또는 세포의 유리전이온도는 원하는 실온 저장 및/또는 배송 온도보다 높게 올리는 것이 바람직하다, 및 (4) 바이러스 또는 세포 및 보호제 제형(formulation)의 혼합물은 건조 및 이후의 저장동안 적어도 부분적으로는 비결정의(amorphous) 상태로 남아있는 것이 바람직하다.
보호제 제형 - 다양한 폴리올(polyol) 및 고분자들이 당업계에 알려져 있으며, 그들은, 전기 생물학적으로 활성이 있는 물질들의 건조 및 저장에 견디는 능력을 향상시키고 전기 특정 생물학적 활성을 손상시키지 않는 한, 보호제로 기능할 수 있다. 사실상, 전기 보호 분자들은 탈수 동안 생물학적 물질들을 안정화시키는 것 외에 보존하는 동안에도 기타의 잇점들을 제공한다(기계적으로 안정한 거품을 발생시키는데 도움이 되는 것으로서, 하기 참조). 좀 더 구체적으로, 본 발명에 따른 전기 보호제는, 이에 제한되지 않는 것으로서, 슈크로스, 글루코스, 말토스(maltose), 슈크로스. 자일룰로스(xylulose), 리보오스(ribose), 만노오스(mannose), 프럭토스(fructose), 라피노스, 및 트레할로스 등의 단순당(simple sugar), 비환원성 단당 유도체 및 기타 단수화물 유도체, 소르비톨(sorbitol) 등의 당알콜(sugar alcohol), 폴리에틸렌 글리콜, HES(hydroxyethyl starch), 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴아마이드, 및 폴리에틸렌아민 등의 합성 고분자, FICOLL 및 덱스트란(Dextran) 등의 당 공중합체(sugar copolymer), 및 이들의 조합을 포함한다. 저분자량, 고 수용성의 단백질 또한 보호제로 기능할 수 있다.
본 발명의 한가지 바람직한 변형으로, 세포, 바이러스, 바이러스 입자 및/또는 바이러스성 및 비바이러스성 벡터를 보존하는 경우에, 보호 조성물은 저분자량의 당, 이당, 올리고당, 및 생물학적 고분자를 포함한 고분자의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다. 저분자량의 당은 탈수 동안 세포내 구조물로 침투하여 이를 보호하는데 사용된다. 저분자량의 침투(permeating) 당은 다양한 케토스(ketose)로부터 선택되는데, 이들은 중성 또는 그 이상의 pH에서 비환원성인, 또는 메틸화 또는 에틸화된 단당류이다. 비환원성 케토스에는 다음이 포함된다: 6탄당, 프럭토스, 소르보스(sorbose), 및 피스코스(piscose); 5탄당, 라이불로스(ribulose) 및 자일룰로스; 4탄당, 에리트룰로스(erythrulose); 및 3탄당, 1,3-디하이드록시디메틸케톤(1,3-dihydroxydimethylketone). 전기 메틸화된 단당에는 글루코, 만노(manno), 및 갈락토 피라노시드의 알파 및 베타 메틸화된 형태가 있다. 전기 메틸화된 5탄(five carbon) 화합물에는 아라비노(arabino) 및 자일로(xylo) 피라노시드의 알파 및 베타 형태가 있다. 슈크로스 같은 이당은 수화(hydration)의 물을 생물학적 막 및 거대분자(macromolecule)의 표면에 되돌리기 때문에, 탈수 동안 효과적인 보호제가 되는 것으로 알려져 있다. 덧붙여, 슈크로스 및/또는 기타 부형제(filler)들은 진공하에서 건조시킴으로써 얇은 비결정의 농축된 당의 막(film)들로 구성된 안정한 거품으로 효과적으로 변형된다.
단당을 이당 및 올리고당과 결합시키면, 탈수 동안 전기 올리고당의 결정화를 막을 수 있다. 게다가, 고분자를 이용하여 탈수된 혼합물의 유리전이온도(Tg)를 증가시킬 수 있는데, 유리전이온도는 저분자량의 단당의 포함으로 감소될 수 있다. 농축된 당 용액에 용해될 수 있는 어떤 생물학적 고분자라도 이용될 수 있다. 예를 들어, 고도로 가용성인 천연의 및 합성 생체고분자(예를 들어, 단백질) 뿐 아니라, FICOLL 및 덱스트란 등의 다당류, 및 HES, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴아마이드 등의 합성 고분자도 생체막을 안정화시키고 Tg를 증가시키는 데 도움이 될 것이다.
일부 당, 당알콜 및 글루탐산 모노나트륨(MSG) 등의 아미노산이 건조 및 이후의 저장 동안 생물제제가 손상되는 것을 막는 능력이 있다는 것이 알려져 있다. 여러 간행물(publication)이 슈크로스 또는 트레할로스 등의 이당이 생체거대분자 및 막에 대하여 강력한 보호 작용을 갖는다는 것을 증명한다. 일부 연구자들은 동결 건조 동안 세포를 보호하기 위하여 단당류(예를 들어, 글루코스, 프럭토스 등) 또는 저분자량의 당알콜(만니톨(mannitol), 소르비톨 등)을 포함한 좀 더 복잡한 혼합물을 사용한다. 이당류와 달리, 저분자량의 당 및 그 유도체들은 세포내로의 침투력이 좀 더 뛰어나서 세포내를 보호한다. 이러한 이유로, 단당 및 저분자량의 당알콜은 세포 및 바이러스가 탈수 손상되는 것을 방지하는 보호제 제형에 광범위하게 사용되어 왔다.
환원성 단당류를 함유한 보존 용액은 건조 후 저장하는 동안 민감한 효소들에 손상을 입히며, 그 손상율은 저장 온도가 증가함에 따라 빠르게 증가한다(하기 실시예 1 참조). 이러한 이유로, 환원성 단당은 동결 건조된 시료를 4℃ 이하에서 보관할 경우에만 적용될 수 있는 것으로 가정되었다. 다르게는, 생물학적 시료를 상온 또는 그 이상의 온도에서 저장할 때, 전기 보호제의 환원력을 최소화하기 위하여 보호제 제형을 사용할 수 있다. 본 발명의 한 바람직한 실시태양에서, 당류(saccharide)의 환원기(reducing group)는 보호 능력의 향상을 위하여 메틸화된다. 단당의 환원기는 또한, 본 발명에 따라 염소화(chlorinated), 에틸화 등으로 될 수 있다.
저분자량의 탄수화물 첨가제(additive)는 전기 보호제 제형내에 있는 세포 또는 바이러스의 현탁물의 유리전이온도(Tg)를 감소시킨다. 예를 들어, 무수(anhydrous) 프럭토스의 Tg는 7℃에 가깝다; 무수 상태의 1:1 프럭토스:슈크로스 혼합물의 Tg는 40℃에서 조금 이하이다. 글루코스의 Tg는 훨씬 더 높다. 이러한 이유로, 글루코스 유도체를 사용하는 것은 좀 더 효과적이다. 예를 들어, 메틸화된 글루코스의 Tg는 29℃이다(도 4 참조).
보존 용액에서 저분자량 첨가제의 가소화(plasticizing) 효과는, 무수 상태에서 Tg를 증가시키는 가용성의 더 높은 분자량의 첨가제를 사용함으로써 부분적으로 상쇄시킬 수 있다. 본 발명의 한가지 바람직한 실시태양에 따라, 전기 보호제 제형은 MSG, 비환원성 올리고당 및 가용성 단백질로 구성된다. 본 특허 출원의 그 영역에서, 본 발명자들은 가장 실제적인 응용을 넓게 포함하기 위하여 대략 -20℃ 및 +50℃ 사이의 온도를 실온(ambient temperature)으로 정의할 것이다. 그러나, 본 출원에 기술된 방법 및 제형은 상온(20 내지 25℃) 또는 그 이상의 온도에서의 저장 및/또는 운송을 위한 생체분자, 바이러스 및 세포의 보존에 대한 것으로 보는 것이 바람직하다.
놀랍게도, 메틸화된 단당을 포함한 보호제 제형은 특히 바이러스 및 세포를 보호하는 데 효과적이었다. 예를 들어, α-메틸 글루코스(메틸 α-d-글루코피라노시드)는 건조에 의하여 민감한 생물제제를 보존할 때 유일하게 보호 특질을 나타내었다. 이는 메틸기가 전기 분자의 나머지 부분들 보다 더 소수성(hydrophobic)이기 때문이다. 이러한 이유로, 메틸화된 당은 단백질, 바이러스 외피, 및 기타 막 구조물의 소수성 부위에 우선적으로 흡착하는, 다소 양쪽친화적(amphiphilic) 행동을 나타낼 것이다. 이러한 행동은 메틸화된 글루코스의 보호 작용을 부분적으로 설명할 것이다. 게다가, 세포내의 보호를 위하여 글루코스로 적재될 수 있는 세포는 또한 α-메틸 글루코스로도 적재될 수 있는 것 같다. 실제로, α-메틸 글루코스는 세포막을 통한 글루코스 수송을 연구하는데 광범위하게 사용되어 왔다. 건조 상태로 생물학적 시료를 보존하는 선행 기술에서 메틸화된 단당은 사용되지 않았다.
불행히도, 물에서 α-메틸 글루코스 용액은 건조시키는 동안 결정화한다. 이러한 이유로, α-메틸 글루코스는 건조 및 이후의 저장 동안 α-메틸 글루코스 결정화를 최소화하고 비결정 상태에서의 안정성을 향상시키기 위하여 그 밖의 부형제들(예를 들어, 슈크로스, 트레할로스, 말트린, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 단백질 등)과 함께 사용되어야 한다. 예를 들어, 건조하는 동안 슈크로스/α-메틸 글루코 스 용액이 결정화할 가능성은 실시예 3과 관련하여 논의되고 보여진 바와 같이, 슈크로스/α-메틸 글루코스의 질량/질량 비에 의존한다. 추가로, α-메틸 글루코스를 함유한 보호제 제형에 더 높은 분자량의 첨가제를 첨가할 경우, Tg를 증가시켜 건조 상태에서도 수행될 수 있도록 한다.
1차 거품 건조 - 전기 처리과정의 규모 확대를 용이하게 하기 위하여, 거품 형성에 의한 보존에는 진공 상태에서 끓임으로써 기계적으로 안정한 다공성 구조물을 형성시키는 것이 포함된다. 전기 건조 단계는 약 -15 내지 70℃ 범위의 온도에서 수행된다. 한가지 바람직한 실시태양에서, 1차 건조 단계동안 전기 시료의 온도는 대략 5℃이거나 그 이하이다. 거품 형성에 의한 보존은 특히 유리화하기 전, 큰 부피의 시료를 효과적으로 건조하는데 적합하며, 상업용 용도에 적합한 쉽게 분쇄되는 건조 산물을 제조하는데 도움이 된다. 거품 건조의 한가지 잇점은 그 공정이 규모조절이 가능하다는 것이다. 따라서, 전기 공정은 (분석 및 최적화 실험용으로) 1 밀리리터(milliliter) 분획들로부터 (산업 규모의 생산용으로) 수백 리터 분획들에 이르기까지, 어떤 민감한 생활성 물질을 함유한 어떠한 부피의 용액 또는 현탁액에 대하여도 적용될 수 있다. 거품 형성에 의한 보존에 대한 더 상세한 정보는 브론슈타인의 미국 특허 제 5,766,520에 나와있다.
본 발명의 한가지 변형으로, 진공 하에서 거품 건조를 하기 전에, 묽은 생물학적 시료를 물을 부분적으로 제거함으로써 농축시킬 수 있다. 이 초기 농축 단계는, 농축 방법 선택에 따라, 처리 용기안으로 시료를 도입하기 전 또는 후 둘 중 한 시점에 수행될 수 있다. 다르게는, 어떤 시료들은 보호제 분자 첨가 후에 충분히 농축될 수 있기 때문에, 어떠한 초기 농축 단계도 필요로 하지 않는다. 시료의 농축을 증가시키는 것이 바람직한 상황에서, 초기 농축에 사용되는 방법에는 동결 건조, 액상의 또는 부분적으로 결빙된 상태에서의 증발, 역삼투(reverse osmosis), 기타 막 기술(membrane technologies), 또는 당업계에 알려진 어떠한 기타의 농축 방법도 포함된다.
시료들은 100℃보다 충분히 낮은 온도에서 건조하는 동안 끓게 하기 위하여 진공상태에 놓여진다. 생물학적으로 활성인 물질을 함유한 용액 또는 현탁액에 감압을 적용할 때, 전기 용액 또는 현탁액은 끓는 동안 거품을 일으키며, 거품 형성 공정 동안에 추가로 용매를 제거하면 최종 산물인 기계적으로 안정한 열린 기포(open-cell)의 또는 닫힌 기포의 다공성 거품이 생성된다. 전기 기계적으로 안정한 다공성 구조물, 또는 거품은 농축된 부형제의 얇은 비결정 막들로 구성되어 있다.
초기 증발을 용이하게 하여 농축된, 점성 있는 용액을 제조하는 데에는 낮은 진공 압력(0.1 내지 0.9기압의 범위)을 적용하는 반면, 끓게 하기 위하여는 그 보다 훨씬 높은 진공 기압(0 내지 24 토르(Torr))을 이용한다. 전기 비등(boiling) 단계에 대한 진공은 바람직하게는 0 내지 10 토르이며, 가장 바람직하게는 약 4토르 이하이다. 이러한 맥락에서, 비등은 공기 또는 기타의 기체가 아닌 수증기를 함유한 기포(bubble)의 핵생성(nucleation) 및 성장(growth)을 의미한다. 사실상, 어떤 용액에서는, 상온에서 저압의 진공(약 0.1 내지 0.9 기압)을 적용하여 용해되 어 있는 기체들을 제거하는 것이 유리하다. 이러한 "기체제거(degassing)"는 전기 용액이 건조 용기 밖으로 분출되는 것을 막는데 도움이 된다. 일단 전기 용액이 충분히 농축되고 점성이 생기면, 고압의 진공을 적용하여 통제된 비등 또는 거품발생을 일으킬 수 있다. 초기 증발 동안 상기 언급한 보호제 분자를 5 내지 70%의 범위로 농축하는 것은 이후의 고압 진공 하에서의 동결을 막는데 도움이 되며, 점성을 더하여, 거품발생을 용이하게 하는 반면 통제되지 않은 분출을 제한한다.
압력 또는 온도를 갑자기 증가시키면 거품이 함몰될 수 있다. 이러한 경우에, 전기 다공성 구조물의 기계적 안정성을 증가시키기 위하여, 계면활성제를 첨가할 수 있는데, 이 첨가물은 건조된 형태로 전환될 용질의 생물학적 활성을 해치지 않는 것이어야 한다. 나아가, 전기 보호제 고분자를 건조시키는 것 또한 전기 다공성 구조물의 기계적 안정성에 기여한다. 본 발명에 따라 제조된 거품은 이후의 처리 과정(예로서, 안정 건조, 유리화 또는 제분(milling))에 앞서 진공, N2 등의 건조 기체 대기 및/또는 화학적 건조제 하의 처리 용기내에 저장된다.
안정 건조/유리화 - 1차 건조 동안에 형성된 기계적으로 안정한 거품은 증가된 온도에서 2차 또는 "안정(stability)" 건조를 거친다. 유리전이온도(Tg)는 시료의 물 함유량에 의존하고 또한, 탈수 정도가 클수록 증가하기 때문에, 원하는 저장 온도에 따라서, 전기 저장 온도로 냉각시 유리화(예를 들어, 고체의 비결정질의 유리)에 맞는 Tg을 생성하기 위하여 서로 다른 안정 건조 수행법(protocol)을 적용할 수 있다. 그러나, 일단 유리 상태(glass state)로 된 물질의 탈수는 실제적으로 불가능하기 때문에, 실온에서의 저장을 원하는 경우에는, 본 발명에 따른 유리화에서 중요한 것은 전기 실온보다 훨씬 더 높은 온도에서 안정 건조를 수행하는 것이다.
최종적인 저장 온도는 0 내지 70℃ 범위내가 바람직하다. 좀 더 바람직하게는, 통상의 저장 온도를 0, 4, 20, 40 및 50℃로 또는 그 보다 더 많게 선택하는 것이다. 어떤 경우에, 냉동 저장이 바람직한 경우, 전기 저장 온도로 또는 그 보다 더 낮게 냉각시킨 후, 상온에서 안정 건조를 수행할 수 있다. 그러나, 다른 경우에, 상온에서의 안정성을 원하는 경우, 상온으로 냉각한 후 그 보다 더 높은 온도에서 탈수를 수행해야 한다.
보존되어야 할 주어진 시료에 대하여, 전기 시료의 본질 및 안정성 특질이 1차 건조 단계 동안 견딜 수 있는 최고 온도를 결정할 것이다. 효소 보존의 경우, 상온에서의 1차 건조 후, 효소 활성을 잃어버리지 않을 수 있는 안정 건조 온도는 50℃까지 증가될 수 있는 것으로 나타났다. 그 후, 전기 탈수 공정은 더 높은 온도에서의 안정 건조 동안 계속될 수 있다. 따라서, 탈수 온도를 연속적으로 또는 단계적으로 증가시킴으로써, 불안정한 단백질들을 그들의 변성 온도보다 훨씬 높은 온도에서 열안정성(thermal stability)을 가진 상태로 둘 수 있다.
선택한 저장 온도보다 높은 온도에서 안정 건조를 수행하는 것에 더하여, Tg를 실제적으로 전기 저장 온도보다 높이 올리기에 충분한 시간 동안 이러한 건조를 수행하는 것이 중요하다. 15% 슈크로스 + 15% 라피노스 용액의 건조된 10㎕ 방울 로 수득한 실험결과로서, Tg를 25℃ 이상으로 올리기 위해서는 70℃ 이상의 온도에서 12시간 이상동안 안정 건조를 수행하여야 함이 드러났다. 이 실험에서, 1차 건조는 상온(20℃)에서 12시간 동안이었다. 이 결과는, Tg를 상온 이상으로 올리기 위해서는 안정 건조 수행 시간을 (70℃에서 12시간 이상 및 50℃에서 60시간 이상으로) 늘일 필요가 있음을 시사한다. 열에 불안정하지 않은 어떤 생물학적 물질에 대하여서는, 고온에서 1차 건조를 수행할 경우, Tg를 선택한 저장 온도 이상으로 올리기 위하여 필요한 증가된 온도에서의 안정 건조 시간을 줄일 수 있다.
본 발명의 한가지 실시태양으로, 전기 거품을 안정 건조 온도에서 제분할 온도로 냉각시켜 제분하고, 그 후, 그 분말을 진공 하 또는 대기압에서 추가로 건조시킨다. 이후의 건조 온도는 약 0 내지 100℃ 범위이다. 유리전이온도가 약 0 내지 70℃ 범위내의 선택 저장 온도보다 높아질 때까지 이러한 건조를 계속 수행한다.
Tg가 실제로 전기 저장 온도보다 더 높은지 확증하기 위하여 열적분석 (thermal analysis)으로 Tg를 측정하는 적어도 두 가지 방법이 알려져 있다. 시차주사열량법(differential scanning calorimetry, DSC)은 가장 일반적으로 사용되는 방법이다. 그러나, 본 발명자는 DSC가 고분자를 함유한 시료의 Tg를 측정하는 데에는 신뢰성이 없을 수 있음을 발견하였다. 다르게는, 열자극편광(Thermally Stimulated Polarization, TSP)법은 특별히 고분자 분석용으로 개발된 것이다. TSP 법은 시료의 양이 약간 더 많이 필요하지만, 모든 시료에 대하여 신뢰성 있기 때문에, 바람직하다.
하기 실시예들은 바이러스 또는 세포, 및 보호제를 포함한 보존 혼합물에 관한 본 발명의 다양한 특정 양태를 설명한 것으로서, 이때, 전기 혼합물은 실온 및 그 이상의 온도에서의 탈수 및 이후의 저장 동안 전기 시료를 안정화하도록 되어 있다.
실시예 1
이소구연산 탈수소효소(Isocitrate Dehydrogenase, ICDH)에 대한 환원성 및 비환원성 당과 PVP의 효과를 상온 및 37℃에서 저장하며 연구하였다. 상기 실험은 당과 같은 첨가물의 환원성 능력을 시험하기 위하여 고안된 것이다. 상기 환원성 능력은 마일라드반응 또는 효소 갈색화반응을 생성하는 정도로 측정된다. 단당류 또는 단순당에 있어서, 당의 수산화기, 즉 탄소(C)에 연결된 OH기는 NH 또는 NH2를 포함하는 아미노 잔기인, 예를 들면 리신, 아스파라진과 화학적 반응을 일으키기 쉽다.
50% 글리세롤에서 효소 ICDH를 제조하였다. 다음과 같은 저장용액을 사용하였다: (1) 30% 슈크로스 + 10% PVP 용액, (2) 20% 글루코스 + 20% PVP 용액, (3) 20% 프룩토스 + 20% PVP 용액, 및 (4) 20% 메틸 α-d-글루코피라노시드 + 10% PVP 용액.
ICDH(200㎕)를 15 내지 17℃에서 5시간 동안 냉각된 0.1M Tris HCl 용액에서 투석하였다. 작은 분자 입자들이 완충용액에 고르게 분산될 수 있도록 용액을 천천히 교반하였다. 투석 후에, ICDH(총 부피= 180㎕) 용액을 1.7㎖ 미세원심분리 튜브에 옮기고, 0.1M Tris HCl(pH 7.8) 용액 250㎕를 첨가하였다. 상기 튜브를 얼음내에서 보관하였다.
ICDH(100㎕)는 4가지의 다른 저장용액 중의 하나를 첨가한 후에 1.7㎖ 미세원심분리 튜브에 저장하였다. 상기 저장 혼합용액을 볼텍싱(vortexing)한 뒤에 각각 10㎕씩 40개의 튜브에 분주하였다. 각각의 4가지 다른 저장 혼합용액에서 일부의 시료를 출발시간 0에서 분석하였다. 그 이외의 시료들을 실온에서 진공하에 하룻밤동안 건조하였다. 건조 후에, 각 저장 혼합용액의 시료의 일부를 분석하였다. 남아있는 시료들을 2 종류로 나눈 후에, 한 종류는 상온에서, 다른 종류는 37℃에 저장하였다. 2주 간격으로 각 저장 혼합용액 및 저장 온도조건에서 각각의 시료의 활성을 분석하였다.
분석된 모든 시료를 0.1M Tris HCl(pH 7.8)용액으로 10배 희석하고 볼텍싱으로 혼합하였다. 희석된 시료(10㎕)를, 0.1M Tris HCl(pH 7.8) 용액 3㎖, 10mM MnSO4 10㎕, 50mM 이소구연산 10㎕, 및 10mM NADP+ 용액 10㎕와 함께 반응시켰다. 340㎚에서 시간에 따른 흡광도를 측정하였다. 4cm/min 차트 속도의 20mV에서 흡광도의 변화로 상대 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 1A 및 1B에 나타낸다.
실시예 2
이소구연산 탈수소효소(ICDH)에 대한 환원성 및 비환원성 당과 PVP의 효과를 50℃에서 저장하며 연구하였다. 상기 실험은 당과 같은 첨가물의 환원성 능력을 시험하기 위하여 고안된 것이다. 상기 환원성 능력은 마일라드반응 또는 효소 갈색화반응을 생성하는 정도로 측정된다. 단당류 또는 단순당에 있어서, 당의 수산화기, 즉 탄소(C)에 연결된 OH기는 NH 또는 NH2를 포함하는 아미노 잔기인, 예를 들면 리신, 아스파라진과 화학적 반응을 일으키기 쉽다.
50% 글리세롤에서 효소 ICDH를 제조하였다. 다음과 같은 저장용액을 사용하였다: (1) 30% 슈크로스 + 10% PVP 용액, (2) 20% 글루코스 + 20% PVP 용액, (3) 20% 프룩토스 + 20% PVP 용액, 및 (4) 20% 메틸 α-d-글루코피라노시드 + 10% PVP 용액.
ICDH(200㎕)를 15 내지 17℃에서 5시간 동안 냉각된 0.1M Tris HCl 용액에 투석하였다. 작은 분자 입자들이 완충용액에 고르게 분산될 수 있도록 용액을 천천히 교반하였다. 투석 후에, ICDH(총 부피= 180㎕) 용액을 1.7㎖ 미세원심분리 튜브에 옮기고, 0.1M Tris HCl(pH 7.8) 용액 250㎕를 첨가하였다. 상기 튜브를 얼음내에서 보관하였다.
ICDH(100㎕)는 4가지의 다른 저장용액 중의 하나를 첨가한 후에 1.7㎖ 미세원심분리 튜브에 저장하였다. 상기 저장 혼합용액을 볼텍싱한 뒤에 각각 10㎕씩 분주하였다. 각각의 4가지 다른 저장 혼합용액에서 일부의 시료를 출발시간 0에서 분석하였다. 그 이외의 시료들을 상온에서 진공하에 하룻밤동안 건조하였다. 건조 후에, 각 저장 혼합용액의 시료의 일부를 분석하였다. 남아있는 시료들을 50℃에 저장하였다. 2주 간격으로 각 저장 혼합용액으로부터 일부 시료의 활성을 분석하였다.
분석된 모든 시료를 0.1M Tris HCl(pH 7.8)용액으로 10배 희석하고 볼텍싱으로 혼합하였다. 희석된 시료(10㎕)를, 0.1M Tris HCl(pH 7.8) 용액 3㎖, 10mM MnSO4 10㎕, 50mM 이소구연산 10㎕, 및 10mM NADP+ 용액 10㎕와 함께 반응시켰다. 340㎚에서 시간에 따른 흡광도를 측정하였다. 4cm/min 차트 속도의 20mV에서 흡광도의 변화로 상대 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타낸다.
실시예 3
이소구연산 탈수소효소(ICDH)에 대한 환원성 및 비환원성 당과 말트린의 효과를 50℃에서 저장하며 연구하였다. 이 실험은 당과 같은 첨가물의 환원성 능력을 시험하기 위하여 고안된 것이다. 상기 환원성 능력은 마일라드반응 또는 효소 갈색화반응을 생성하는 정도로 측정된다. 단당류 또는 단순당에 있어서, 당의 수산화기, 즉 탄소(C)에 연결된 OH기는 NH 또는 NH2를 포함하는 아미노 잔기인, 예를 들면 리신, 아스파라진과 화학적 반응을 일으키기 쉽다.
50% 글리세롤에서 효소 ICDH를 제조하였다. 다음과 같은 저장용액을 사용하 였다: (1) 30% 슈크로스 + 10% 말트린 용액, (2) 20% 글루코스 + 20% 말트린 용액, (3) 20% 프룩토스 + 20% 말트린 용액, 및 (4) 20% 메틸 α-d-글루코피라노시드 + 10% 말트린 용액.
ICDH(200㎕)를 15 내지 17℃에서 5시간 동안 냉각된 0.1M Tris HCl 용액에 투석하였다. 작은 분자 입자들이 완충용액에 고르게 분산될 수 있도록 용액을 천천히 교반하였다. 투석 후에, ICDH(총 부피= 180㎕) 용액을 1.7㎖ 미세원심분리 튜브에 옮기고, 0.1M Tris HCl(pH 7.8) 용액 250㎕를 첨가하였다. 상기 튜브를 얼음내에서 보관하였다.
ICDH(100㎕)는 4가지의 다른 저장용액 중의 하나를 첨가한 후에 1.7㎖ 미세원심분리 튜브에 저장하였다. 상기 저장 혼합용액을 볼텍싱한 뒤에 각각 10㎕씩을 분주하였다. 각각의 4가지 다른 저장 혼합용액에서 일부의 시료를 출발시간 0에서 분석하였다. 그 이외의 시료들을 상온에서 진공하에 하룻밤동안 건조하였다. 건조 후에, 각 저장 혼합용액의 시료의 일부를 분석하였다. 남아있는 시료들을 50℃에 저장하였다. 2주 간격으로 각 저장 혼합용액으로부터 일부 시료의 활성을 분석하였다.
분석된 모든 시료를 0.1M Tris HCl(pH 7.8)용액으로 10배 희석하고 볼텍싱으로 혼합하였다. 희석된 시료(10㎕)를, 0.1M Tris HCl(pH 7.8) 용액 3㎖, 10mM MnSO4 10㎕, 50mM 이소구연산 10㎕, 및 10mM NADP+ 용액 10㎕와 함께 반응시켰다. 340㎚에서 시간에 따른 흡광도를 측정하였다. 4cm/min 차트 속도의 20mV에서 흡광 도의 변화로 상대 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타낸다.
실시예 4
메틸 α-d-글루코피라노시드의 유리전이온도 측정을 위하여, DSC 연구를 위하여 이용되는 알루미늄 팬(pan)내에 결정을 밀봉하였다. 시료를 먼저 가열하여 액화시킨 후에, -100℃로 급속히 냉각시켰다. 냉각 과정에서 시료는 유리 형상으로 변화하였다. 유리전이온도를 가온(10℃/min)시키며 측정하였다. 유리의 액체로의 전환(Tg= 29℃)과 연결된 비열 변화를 도 4에 나타낸다.
실시예 5
탈수과정 및 이어지는 저장시의 비결정 상태(amorphous(glass) state)의 안정성 유지를 위한 제조 능력을 평가하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 생산물의 손상이 유리 메트릭스 내에서 결정화 또는 열분해 과정시에 일어날 수 있다. 결정화는 과포화 또는 불충분히 냉각된 용액 내에서 일어나는 2단계 과정이다. 제 1단계는 결정화 되어질 상(phase)의 안정된 핵을 형성되는 결정핵생성 단계이다. 상기 핵의 형성은 실험적으로 상기 재료내에 불순물의 양에 의해 결정된다. 상기 핵의 안정화는 온도와 용질이나 보조용질의 농도에 의해 결정된다. 제 2단계는 핵 크기로부터 결정 성장 과정을 통한 결정화 전파 단계이다. 이 단계 또한 온도와 재료 안의 다양한 구성성분의 농도에 의해서 결정된다. 시료가 완전히 탈수상태에 가깝도록 건조되었을때(만일, 용질의 결정화가 순수하다면) 핵생성은 최적화되고, 점도가 성장의 고유속도로 인하여 감소된다면 결정 성장은 촉진된다.
하기 표에 나타난 바와 같이, 합성물의 용해도 범위 내에서 구성성분 간의 다른 질량비를 갖도록 30 내지 50%(w/w) 총 용질농도 범위에서 용액을 제조하였다. 0.02㎛ 아크로디스크 여과기(Acrodisc filter)를 통하여 모든 용액을 여과하였다.
하기에서 설명하듯이, 상기 용액을 현미경 평판에서 액적상태로 분석하였고, 그 이후에 신속하며 완전한 건조 또는 저속의 비완결 탈수과정으로 처리하였다. 20㎕ 피펫을 이용하여 알콜로 세척된 현미경 슬라이드 위에 액적(10㎕)을 떨어뜨려서, 각 슬라이드 위에 10개의 10㎕를, 시료당 40방울을 떨어뜨렸다. 드리에리트(DRIERITE, 건조제) 층이 갖춰진 상자를 준비한다. 드리에리트 상자내에 시료 슬라이드를 넣고 파라필름으로 밀봉하였다. 형성된 결정 갯수를 시간 간격으로 측정하고 기록하였다. 2주 후에, 52% 상대습도(RH) 대기(포화된 Mg(NO3)2 사용)내로 시료를 이전시켰다. 결정 갯수를 다시 시간 간격으로 측정하고 기록하였다. 상기 결과를 표 1 내지 6으로 요약한다.
0% RH 저장* | 52% RH 저장** |
슈크로스:MSG 비 | 1주 | 2주 | 1주 | 2주 |
40:1 | 0.00 | 0.00 | 7.50 | 15.00 |
30:1 | 0.00 | 0.00 | 2.50 | 2.50 |
20:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
10:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
8:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
6:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
4:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
2.5:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
1:40 | 7.50 | N/A | 12.50 | 15.00 |
1:30 | 60.00 | N/A | 77.50 | 77.50 |
1:20 | 72.50 | N/A | 75.00 | 75.00 |
1:10 | 72.50 | N/A | 75.00 | 75.00 |
1:8 | 75.00 | N/A | 80.00 | 80.00 |
1:06 | 95.00 | N/A | 95.00 | 95.00 |
1:04 | 42.50 | N/A | 42.50 | 42.50 |
1:2.5 | 5.00 | N/A | 5.00 | 5.00 |
1:01 | 0.00 | N/A | 0.00 | 0.00 |
50% MSG | 70.00 | N/A | 70.00 | 70.00 |
* 드리에리트
** Mg(NO3)2
슈크로스 : MSG 비 | 1주 | 2주 |
50% 슈크로스 | 0.00 | 0.00 |
40:1 | 0.00 | 0.00 |
30:1 | 0.00 | 0.00 |
20:1 | 0.00 | 0.00 |
10:1 | 0.00 | 0.00 |
8:1 | 0.00 | 0.00 |
6:1 | 0.00 | 0.00 |
4:1 | 0.00 | 0.00 |
2.5:1 | 0.00 | 0.00 |
1:1 | 0.00 | 0.00 |
1:2 | 0.00 | 0.00 |
1:4 | 2.50 | 2.50 |
1:6 | 0.00 | 0.00 |
1:8 | 15.00 | 15.00 |
1:10 | 65.00 | 65.00 |
1:20 | 92.50 | 92.50 |
1:30 | 97.50 | 97.50 |
1:40 | 2.50 | 2.50 |
50% MSG | 100.00 | N/A |
0% RH 저장* | 52% RH 저장** |
이노시톨 : MSG 비 | 1주 | 2주 | 1주 | 2주 |
4:1 | 90 | 100 | N/A | N/A |
6:1 | 100 | N/A | N/A | N/A |
8:1 | 0 | 100 | N/A | N/A |
10:1 | 0 | 70 | 100 | N/A |
12:1 | 0 | 67.5 | 100 | N/A |
16:1 | 0 | 0 | 100 | N/A |
20:1 | 0 | 0 | 100 | N/A |
50% 슈크로스 | 0 | 0 | 12.5 | 22.5 |
* 드리에리트
** Mg(NO3)2
0% RH 저장* | 52% RH 저장** |
슈크로스: MAG 비 | 1주 | 2주 | 1주 | 2주 |
50% 슈크로스 | 0.00 | 0.00 | 2.50 | N/A |
40:1 | 0.00 | 2.50 | 2.50 | N/A |
30:1 | 0.00 | 0.00 | 5.00 | N/A |
20:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | N/A |
10:1 | 0.00 | 0.00 | 2.50 | N/A |
8:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | N/A |
6:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | N/A |
4:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | N/A |
2:1 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | N/A |
1:1 | 0.00 | 0.00 | 2.50 | N/A |
1:2 | 0.00 | 0.00 | 7.50 | N/A |
1:4 | 0.00 | 2.50 | 5.00 | N/A |
1:6 | 45.00 | 55.00 | 65.00 | N/A |
1:8 | 22.50 | 47.50 | 67.50 | N/A |
1:10 | 30.00 | 52.50 | 52.50 | N/A |
1:20 | 67.50 | 100.00 | N/A | N/A |
1:30 | 67.50 | 100.00 | N/A | N/A |
1:40 | 100.00 | N/A | N/A | N/A |
50% MAG | 100.00 | N/A | N/A | N/A |
* 드리에리트
** Mg(NO3)2
0% RH 저장* | 52% RH 저장** |
MSG : MAG 비 | 1주 | 2주 | 1주 |
50% MSG | N/A | N/A | N/A |
40:1 | N/A | N/A | N/A |
30:1 | N/A | N/A | N/A |
20:1 | 45.00 | 45.00 | 45.00 |
10:1 | 97.50 | 97.50 | 97.5 |
8:1 | 100.00 | N/A | N/A |
6:1 | 2.50 | 2.50 | 7.5 |
4:1 | 2.50 | 2.50 | 2.5 |
2:1 | 0.00 | 0.00 | 0 |
1:1 | 0.00 | 0.00 | 35 |
1:2 | 2.50 | 7.50 | 17.5 |
1:4 | 2.50 | 5.00 | 5 |
1:6 | 20.00 | 22.50 | 37.5 |
1:8 | 5.00 | 7.50 | 12.5 |
1:10 | 87.50 | 87.50 | 95 |
1:20 | 37.50 | 45.00 | 55 |
1:30 | 87.50 | 90.00 | 95 |
1:40 | 70.00 | 92.50 | 92.5 |
50% MAG | 100.00 | N/A | N/A |
* 드리에리트
** Mg(NO3)2
50% MSG와 메틸 α-d-글루코피라노시드가 사용되었을 때, 각각 40:1과 30:1의 비율에서, 용액이 상온에서 하룻밤동안 저장된 후 결정화 되었다(표 5 참조)는 것은 주목할만 하였다.
표 6(하기에 표시)에 나타난 결과를 참조로할 때, 50% MSG와 트레할로스가 1:10, 1:20, 1:30, 및 1:40 비율에서, 용액은 상온에서 하룻밤 동안에 결정화 되었다. 따라서, 상기 제조에 대해 어떠한 액적도 분석하지 않았다.
MSG:트레할로스 비 | 1주 |
50% MSG | 100 |
40:1 | 100 |
30:1 | 0 |
20:1 | 2.5 |
10:1 | 0 |
8:1 | 5 |
6:1 | 0 |
4:1 | 0 |
2:1 | 0 |
1:1 | 0 |
1:2 | 0 |
1:4 | 100 |
1:6 | 0 |
1:8 | 100 |
1:10 | N/A |
1:20 | N/A |
1:10 | N/A |
1:40 | N/A |
50% 트레할로스 | 100 |
실시예 6
소RS바이러스(Bovine Respiratory Syncytial Virus, BRSV), 비기관염(Rhinotracheitis, IBR), 바이러스성 설사(Viral Diarrhea, BVD), 및 파라인플루엔자(Parainfluenza, PI3) 바이러스를 각각 배양하고 수확하였다. 수확 후에, 바이러스를 안정제와 혼합하고 대략 40㎖씩 할당하여 분주한 뒤에, 처리공정 전까지 -80℃ 냉동고에 보관하였다.
다음과 같은 70%(w/w) 저장용액을 0.01M 인산 완충용액에 제조하였으며, 코닝(Corning) 0.22㎛ PES(Polyestersulfone) 여과기를 통하여 멸균 여과하였다: (1) 2:1 슈크로스:메틸 α-d-글루코피라노시드, (2) 6:1 슈크로스:이노시톨, (3) 2:1 슈크로스:이소말트(isomalt), (4) 5:2 슈크로스:소르비톨(sorbitol), (5) 트레할로스, 및 (6) 5:2 슈크로스:MSG.
모든 생성물 제조작업은 18℃인 실험실에서 수행되었다. 바이러스를 -80℃냉동고에서 꺼내어 차가운 수도물에 대략 1시간 동안 놓아둠으로써 해동하였다. 무균기법을 이용하여, 멸균된 50㎖ 폴리프로필렌 코니칼(conical) 튜브에서 4 바이러스 혼합액을 다양한 비율로 제조하였다. 바이러스 혼합액에 그 양의 2배의 무균 저장용액을 첨가하였다. 볼텍싱하여 균질 혼합액을 얻었다. 멸균된 30㎖ 보로실리케이트 유리 혈청 바이알(borosillicate glass serum vial, Wheaton)에 각각의 바이러스/저장용액 혼합액 2.4g을 넣었다. 다시, 멸균된 13㎜ 종결 동결건조 마개를 각각의 바이알 입구에 채워서 먼저 차단하였고, 이후에 마개에 노치(notch)를 만들어 기포 생성으로 저장 동안에 수분 증발이 가능하도록 하였다. 바이알을 다시 금속 건조대에 놓았다. 기포 생성으로 저장이 이루어지도록 변형된 미리-냉장된(5℃) 동결건조기내에 상기 건조대를 놓았다. 건조과정 동안 시료의 온도를 모니터링하기 위해서 바이알 중 하나에 열전쌍을 놓았다. 이후에 건조과정이 시행되었다. 기포생성에 의한 저장이 완결된 후에, 바이알을 진공 상태하에서 밀봉하고 건조기로부터 분리하였다. 바이알을 알루미늄 크림프 실(aluminum crimp seal)로 밀봉한 후에 4℃에서 보관하였다. 동결된 대조군 시료뿐만 아니라 저장된 시료를 다음과 같은 방법으로 분석하였다.
마딘-다비 보바인 키드니(Madin-Darby Bovine Kidney, MDBK) 세포를 5% 도너 호스 혈청(donor horse serum, JRH Biologicals)이 보충된 둘베코의 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM)에서 배양하였다. 상기 혈청은 BVD, IBR, PI3, 및 BRSV는 없으나 그 항체는 함유하고 있었다. 다음과 같은 바이러스를 중화시키는 혈청이 NVSL로부터 얻어졌고, 백신의 각 분율의 바이러스 역가 측정에 이용되었다: BVDV 항혈청 NVSL Lot 4X; PI3 항혈청 NVSL Lot 86.2; IBRV 항혈청 NVSL Lot 10X; 및 BRSV 항혈청 NVSL Lot 88-5X.
BRSV, IBR, BVD, 및 PI3 시료의 각 분율에 대한 바이러스 역가를 4-방향(way) 백신에 의해서 결정하였고, 바이러스 특이 항혈청으로 다른 3 가지 분율을 중화시킴에 의하여 수행하였다. 490cm2 롤러보틀(roller bottle) 내에서 배양된 MDBK 세포를 트립신-EDTA(Lot #7B2028, JRH Bioscience)에 의해 분리시켜, ㎖당 1.5 X 105 세포가 포함되도록 DMEM + 5% 호스 혈청배지(horse serum)에 현탁하였다. 96-웰 플레이트(96-well plate)에 웰당 200㎕ 세포 현탁액을 주입하였다. 미세적정 플레이트에서 하룻밤동안 배양하였으며, 바이러스 역가 측정을 위해 세포가 약 80% 융합 단일막이 형성된 날의 다음날에 상기 플레이트를 사용하였다.
저장된 바이러스의 각 바이알(4-방향 백신)을 DMEM 15.5㎖로 재수화시켰다. 이것을 10-0로 희석되도록 주의하였다. 각각의 재수화된 백신 4 바이알을 바이러스 역가 측정을 위해 함께 섞은 후에 사용하였다. 대조군 바이러스로는 동결된 바이러스를 사용하였다. 재수화된 백신 0.1㎖ 시료가 취해지고, 여기에 다른 3 바이러스에 대한 각각의 항혈청 0.3㎖을 포함하는 멸균된 1㎖ 바이알을 첨가하였다. 예를 들어, BVD의 역가를 측정하는 경우에는, 항-IBR 혈청 0.3㎖, 항-BRSV 혈청 0.3 ㎖, 및 항 PI3 혈청 0.3㎖을 포함하는 바이알에 백신 0.1㎖을 첨가하였다. 이 상태에서 총 부피는 1.0㎖이고, 바이러스 희석은 10-1이었다. 상기 혼합액을 실온에서 40분 동안 배양하였다.
플레이트의 제 1열 웰(220㎕)에 중화된(10-1) 시료 22㎕를 첨가함에 의하여 96-웰에서 바이러스의 10배의 희석액을 제조하였다. 각 웰을 혼합하였고(이것은 10-2 희석되었다), 22㎕를 제 2열에 첨가하였으며 마지막 열까지 동일한 방식으로 희석하였다. 바이러스 역가 측정을 컬럼 1 내지 10에서 수행하였다. 컬럼 11 및 12는 미감염된 세포 대조군으로 남겨놓았다. 상기 플레이트를 5% CO2가 포함된 공기로 37℃에서 4일 동안 배양하였다. 바이러스 감염은 세포변성효과(cytopathic effect, CPE) 측정에 의해 결정되었다. 최종적으로, 바이러스 역가를 리드-뮤엔치(Reed-Muench) 방법을 이용하여 계산하였다. 대조군 바이러스 및 저장된 백신으로부터 얻어진 4 바이러스의 역가를 기록하였고, 저장동안에 바이러스 손실을 비교하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다; 두가지 숫자는 동일 실험의 반복 결과를 나타낸다.
보존 후 초기 생존률(%) | ||||
보존 용액 | BSRV | IBR | BVD | PI3 |
2:1 슈크로스:메틸 α-d-글루코피라노시드 | 57.5, 64.6 | 52.5,, 37.2 | 66.1, 58.9 | 125.9, 89.1 |
6:1 슈크로스:이노시톨 | 38.0, 29.6 | 13.5, 10.7 | 97.7, 24.0 | 67.6, 24.0 |
2:1 슈크로스:이소말트(isomalt) | 36.3, 33.9 | 16.6, 13.5 | 83.2, 9.8 | 69.2, 26.9 |
5:2 슈크로스:소르비톨 | 35.5 | 17.8 | 2.5 | 28.8 |
트레할로스 | 33.9 | 20.0 | 16.2 | 102.3 |
5:2 슈크로스:MSG | 21.0, 29.5 | 38.0, 35.5 | 87.1, 49.0 | 91.2, 35.5 |
실시예 7
뉴캐슬(Newcastle) 및 기관지염(Bronchitis) 바이러스를 각각 배양하고 수확하였다. 수확 후에, 바이러스를 안정제와 혼합하고 대략 200㎖씩 할당하여 분주한 뒤에, -80℃에서 동결시켰다. 동결된 바이러스를 공정처리시까지 -80℃ 레브코(Revco) 냉동고에 보관하였다.
다음과 같은 70%(w/w) 보관용액을 0.01M 인산 완충용액으로 제조하였으며, 코닝 0.22㎛ PES 여과기를 통하여 멸균 여과하였다: (1) 2:1 슈크로스:메틸 α-d-글루코피라노시드, (2) 4:1 슈크로스:MSG, (3) 4:1 슈크로스:말티톨(maltitol), 및 (4) 13:1 슈크로스:만니톨.
모든 생성물 제조작업은 18℃인 실험실에서 수행되었다. 바이러스를 -80℃냉동고에서 꺼내어 차가운 수도물에 대략 2시간 동안 놓아둠으로써 해동하였다. 무균기법을 이용하여, 멸균된 50㎖ 폴리프로필렌 코니칼 튜브에서 2 바이러스 혼합액을 1:1 비율로 제조하였다. 바이러스 혼합액에 그 양의 2배의 무균 저장용액을 첨가하였다. 볼텍싱하여 균질한 혼합액을 얻었다. 멸균된 30㎖ 보로실리케이트 유리 혈청 바이알(Wheaton)에 각각의 바이러스/저장용액 혼합액 3.0g을 넣었다. 다시, 멸균된 13㎜ 종결 동결건조 마개를 각각의 바이알 입구에 채워서 먼저 차단 하였고, 이후에 마개에 노치를 만들어 기포 생성으로 저장 동안에 수분 증발이 가능하도록 하였다. 바이알을 다시 금속 건조대에 놓았다. 본 발명의 기포 저장방법을 수행하도록 변형된 미리-냉장된(5℃) 동결건조기내에 상기 건조대를 놓았다. 건조과정 동안 시료의 온도를 모니터링하기 위해서 바이알 중 하나에 열전쌍을 놓았다. 저장 후에, 바이알을 진공 상태하에서 밀봉하고 건조기로부터 분리하였다. 건조 수행의 Td에 따라서, 바이알을 알루미늄 크림프 실로 밀봉한 후에 실온 또는 4℃에서 보관하였다(즉, 만일 Td = 30℃인 경우에는, 상기 시료를 실온에서 저장하였다; 만일 Td = 20℃인 경우에는, 상기 시료를 냉장하여 저장하였다).
바이러스 역가를 상기 실시예 6에서 설명된 방법으로 분석하였다. 단일 실험의 결과를 표 8에 나타낸다.
보존 후 초기 생존률(%) | ||
보존 용액 | 뉴캐슬 | 기관지염 |
2:1 슈크로스:메틸 α-d-글루코피라노시드 | 100 | 20.4 |
4:1 슈크로스:말티톨 | 56.2 | 2.4 |
13:1 슈크로스:만니톨 | 55.0 | 4.8 |
4:1 슈크로스:MSG | 23.4 | 0.4 |
실시예 8
스트렙토코커스 에쿠이(Streptococcus equi)의 저장을 위하여, 다음과 같은 70%(w/w) 저장 용액을 0.01 M 인산 완충용액에 제조하였고, 코닝 0.22㎛ PES 여과기를 통하여 멸균 여과하였다: (1) 4:1 슈크로스:메틸 α-d-글루코피라노시드, (2) 1:1 슈크로스:메틸 α-d-글루코피라노시드, (3) 5:2 슈크로스:글루탐산 (glutamate).
동결된 씨드 스톡(seed stock)(lot WS012696) 한 바이알을 -80℃ 냉동고로부터 꺼내서 냉수에서 해동시켰다. 모든 내용물(1.0㎖)을 "S. equi 성장배지(lot 0757)" 150㎖에 접종하였다. 화학식량(formular weight)에 따라, 리터당 50% 덱스트로스(Dextrose) 20g을 배지에 첨가하였다. 느슨하게 마개로 막은 플라스크를 37℃에서 대략 20 내지 24시간 동안 100rpm의 교반기에서 배양하였다. 배양액을 600㎚ 파장(-12시간)에서 0.8 내지 1.5 광학밀도(OD)에 도달할 때까지 성장하도록 하였다. TSA II + 5% 혈액한천배지(lot K1RUWW)에서 배양 1루프(loop)로 순수배양을 위한 스트리킹(streaking)을 수행하였다. 37℃에서 24 내지 48시간 배양후에 플레이트를 검사하여 오염되지 않았음을 확인하였다.
대략 23.5시간의 배양후에, 전배양액(pre-culture) 10㎖을 성장배지 250㎖을 포함하는 500㎖ 플라스크에 접종하였다. 전배양액을 상기에서 설명된 조건하에서 대략 4시간 동안 배양하였다. TSA II + 5% 혈액한천배지에서 다시 순수배양을 위한 스트리킹을 수행하였다. 37℃에서 24 내지 48시간 동안 배양한 후에 플레이트를 검사하여 오염되지 않았음을 확인하였다. 600㎚에서 전배양액의 흡광도는 1.888이었다.
대략 5시간 뒤에 제 2 전배양액 50㎖을 S. equi 배지 + 덱스트로스 혼합액 1000㎖을 포함하는 발효조에 접종하였다. 발효조건은 다음과 같다: 분당 1리터의 가압 산소로 통기, 100rpm으로 교반, 그리고 37℃ 온도에서 2.5N HCl 및 2.5N NaOH을 이용하여 pH 조절.
배양액이 안정기(stationary phase)에 도달하면, 세포 배양액을 저장용액과 1:1의 비율로 혼합하였다. 볼텍싱하여 균질 혼합액을 얻었다. 멸균된 10㎖ 보로실리케이트 유리 혈청 바이알(Wheaton)에 각각의 바이러스/저장용액 혼합액 1.0g을 넣었다. 다시, 멸균된 13㎜ 종결 동결건조 마개를 각각의 바이알 입구에 채워서 먼저 차단하였고, 이후에 마개에 노치를 만들어 저장 동안에 수분 증발이 가능하도록 하였다. 바이알을 다시 금속 건조대에 놓았다. 기포 건조방법을 수행하도록 변형된 미리-냉장된(5℃) 동결건조기내에 상기 건조대를 놓았다. 건조과정 동안 시료의 온도를 모니터링하기 위해서 바이알 중 하나에 열전쌍을 놓았다. 저장 후에, 바이알을 진공 상태하에서 밀봉하고 건조기로부터 분리하였다. 바이알을 알루미늄 크림프 실로 밀봉한 후에 실온에서 보관하였다.
각 대조군 시료(세포 배양액 + 저장용액) 일부(1g)를 PBS로 10배 희석하였다. 저장된 세포의 시료 바이알을 PBS 10㎖로 재수화시켰다. 추가적으로, 대조군과 저장시료를 10-4 및 10-5로 희석시켰다. 혈청한천배지에서 10-5 및 10-6의 3개의 스프레드(spread) 플레이트를 제조하였다. 상기 플레이트를 48시간 동안 37℃에서 배양하였다. 모든 시료에서 각 플레이트에 형성된 콜로니 갯수를 계산하였다. 30 내지 300 콜로니를 생성한 플레이트를 CFU/㎖을 계산하기 위하여 사용하였다. 다시, 저장후에 % 생존을 결정하기 위하여, 저장된 시료에 있어서 CFU/㎖을 대조군 시료(세포 배양액)로 부터의 CFU/㎖로 나누었다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.
실시예 9
소RS바이러스(BRSV), 비기관염(IBR), 바이러스성 설사(BVD) 및 파라인플루엔자(PI3) 바이러스를 각각 배양하고 수확하였다. 수확 후에, 바이러스를 안정제와 혼합하고 대략 40㎖씩 할당하여 분주한 뒤에, 처리공정 전까지 -80℃ 냉동고에 보관하였다.
다음과 같은 70%(w/w) 저장용액을 0.01M 인산 완충용액에 제조하였으며, 코닝 0.22um PES 여과기를 통하여 멸균 여과하였다: (1) 2:1 슈크로스:메틸 α-d-글루코피라노시드, (2) 4:1 슈크로스:메틸 α-d-글루코피라노시드, (3) 5:2 슈크로스:라피노스.
모든 생성물 제조작업은 18℃인 실험실에서 수행되었다. 바이러스를 -80℃냉동고에서 꺼내어 차가운 수도물에 대략 1시간 동안 놓아둠으로써 해동하였다. 무균기법을 이용하여, 멸균된 50㎖ 폴리프로필렌 코니칼 튜브에서 4 바이러스 혼합액을 다양한 비율로 제조하였다. 바이러스 혼합액에 그 양의 2배의 무균 저장용액을 첨가하였다. 볼텍싱하여 균질 혼합액을 얻었다. 멸균된 30㎖ 보로실리케이트 유리 혈청 바이알에 각각의 바이러스/저장용액 혼합액 2.4g을 넣었다. 다시, 멸균 된 13㎜ 종결 동결건조 마개를 각각의 바이알 입구에 채워서 먼저 차단하였고, 이후에 마개에 노치를 만들어 기포 생성으로 저장 동안에 수분 증발이 가능하도록 하였다. 바이알을 다시 금속 건조대에 놓았다. 기포 생성으로 저장이 이루어지도록 변형된 미리-냉장된(5℃) 동결건조기내에 상기 건조대를 놓았다. 건조과정 동안 시료의 온도를 모니터링하기 위해서 바이알 중 하나에 열전쌍을 놓았다. 이후에 건조과정이 시행되었다. 기포생성에 의한 저장이 완결된 후에, 바이알을 진공 상태하에서 밀봉하고 건조기로부터 분리하였다. 바이알을 알루미늄 크림프 실로 밀봉한 후에 4℃에서 보관하였다. 동결된 대조군 시료뿐만 아니라 저장된 시료를 다음과 같은 방법으로 분석하였다.
마딘-다비 보바인 키드니(MDBK) 세포를 5% 도너 호스 혈청(JRH Biologicals)이 보충된 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM)에서 배양하였다. 상기 혈청은 BVD, IBR, PI3, 및 BRSV는 없으나 그 항체는 함유하고 있었다. 다음과 같은 바이러스를 중화시키는 혈청이 NVSL로부터 얻어졌고, 백신의 각 분율의 바이러스 역가 측정에 이용되었다: BVDV 항혈청 NVSL Lot 4X; PI3 항혈청 NVSL Lot 86.2; IBRV 항혈청 NVSL Lot 10X; 및 BRSV 항혈청 NVSL Lot 88-5X.
BRSV, IBR, BVD, 및 PI3 시료의 각 분율에 대한 바이러스 역가를 4-방향 백신에 의해서 결정하였고, 바이러스 특이 항혈청으로 다른 3 가지 분율을 중화시킴에 의하여 수행하였다. 490cm2 롤러보틀 내에서 배양된 MDBK 세포를 트립신-EDTA(Lot #7B2028, JRH Bioscience)에 의해 분리시켜, ㎖당 1.5 X 105 세포가 포함되도록 DMEM + 5% 호스 혈청배지에 현탁하였다. 96-웰 플레이트에 웰당 200㎕ 세포 현탁액을 주입하였다. 미세적정 플레이트에서 하룻밤동안 배양하였으며, 바이러스 역가 측정을 위해 세포가 약 80% 융합 단일막이 형성된 날의 다음날에 상기 플레이트를 사용하였다.
저장된 바이러스의 각 바이알(4-방향 백신)을 DMEM 15.5㎖로 재수화시켰다. 이것을 10-0로 희석되도록 주의하였다. 각각의 재수화된 백신 4 바이알을 바이러스 역가 측정을 위해 함께 섞은 후에 사용하였다. 대조군 바이러스로는 동결된 바이러스를 사용하였다. 재수화된 백신 0.1㎖ 시료를 취하고, 여기에 다른 3 바이러스에 대한 각각의 항혈청 0.3㎖을 포함하는 멸균된 1㎖ 바이알을 첨가하였다. 예를 들어, BVD의 역가를 측정하는 경우에는, 항-IBR 혈청 0.3㎖, 항-BRSV 혈청 0.3㎖, 및 항 PI3 혈청 0.3㎖을 포함하는 바이알에 백신 0.1㎖을 첨가하였다. 이 상태에서 총 부피는 1.0㎖이고, 바이러스 희석은 10-1이었다. 상기 혼합액을 실온에서 40분 동안 배양하였다.
플레이트의 제 1열 웰(220㎕)에 중화된(10-1) 시료 22㎕를 첨가함에 의하여 96-웰에서 바이러스의 10배의 희석액을 제조하였다. 각 웰을 혼합하였고(이것은 10-2 희석되었다), 22㎕가 제 2열에 첨가되었으며 마지막 열까지 동일한 방식으로 희석되었다. 바이러스 역가 측정을 컬럼 1 내지 10에서 수행하였다. 컬럼 11 및 12는 미감염된 세포 대조군으로 남겨놓았다. 상기 플레이트를 5% CO2 포함된 공기로 37℃에서 4일 동안 배양하였다. 바이러스 감염을 세포변성효과(CPE) 측정에 의해 결정하였다. 최종적으로, 바이러스 적정을 리드-뮤엔치 방법을 이용하여 계산하였다. 대조군 바이러스 및 저장된 백신으로부터 얻어진 4 바이러스의 적정을 기록하였고, 저장동안에 바이러스 손실을 비교하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.
보존 후 생존률(%) | ||||
보존 용액 | BRSV | IBR | BVD | PI3 |
2:1 슈크로스:MAG | 115.0 | 12.6 | 97.7 | 105.0 |
4:1 슈크로스:MAG | 63.1 | 7.4 | 37.2 | 85.1 |
5:2 슈크로스:라피노스 | 44.7 | 4.6 | 77.6 | 34.7 |
실시예 10
퍼플루오로데칼린(perfluorodecalin)에 현탁된 저장 루시페라아제(Sigma # L-9560) 제제를 제조하고 안정성을 시험하였다. 동결건조된 루시페라아제(1㎎)을 1㎎/㎖ BSA를 포함하는 0.1M Tris 완충용액(pH 7.4) 1㎖에 용해시켰다. 생성된 1㎎/㎖ 루시페라라아제 용액을 3.5시간 동안 4℃에서 1㎎/㎖ BSA를 포함하는 0.1M Tris 완충용액(pH 7.4) 500㎖에서 투석하였다. 투석된 루시페라아제를 미세원심분리 튜브로 옮기고 다음의 식을 이용하여 루시페라아제 농도를 결정하였다.
10: 1의 비율의 50% 슈크로스:MSG 저장용액의 혼합액 99.5g과 1㎍/㎕인 투석된 루시페라아제 500㎕를 혼합하여 저장 혼합액을 제조하였다. 다시 저장 혼합액을 바이알당 10 ±0.05g가 되도록, 9개의 멸균된 100㎖ 혈청 바이알에 정량하여 넣었다. 남아있는 투석된 루시페라아제는 20개의 미세원심분리 튜브에 각각 20㎍을 할당하여 넣고, 표준 루시페라아제로서 추가적인 이용을 위하여 -80℃에서 보관하였다. 저장 혼합액 시료를 20℃에서 4.5시간, 45℃에서 60시간, 60℃에서 8시간, 그리고 65℃에서 16.5시간 동안 차례로 건조하였다. 다시 시료를 진공하에서 마개를 막았다. 상기 바이알을 건조실(대기 r.h. -14%)로 이전시켰다. 상기 바이알을 멸균된 밀링플라스크(milling flask)내에서 개봉하여 기포가 빠져나가도록 하였다. 기포가 부드럽게 일어나도록 하였다. 결과적인 분말을 1.07 내지 1.11g/vial이 되도록 멸균된 바이알에 정량하여 넣었다. 다시 페르플루오로데칼린(Aldrich # p-990-0) 2㎖을 각 바이알에 첨가하였고, 각 바이알은 건조 대기하에 마개를 막은 뒤에 37℃ 배양기로 이전시켰다.
루시페라아제 분석시약 및 1㎎/㎖ BSA를 포함하는 PBS를 적어도 30분 동안 실온(RT)에서 평형화시켰다. 1㎎/㎖ BSA를 포함하는 PBS 9.42㎖을 분말시료(1㎍/㎖)에 첨가하여 혼합하였다. 상기 용액 1㎍/㎖을 10배씩 연속적으로 희석하여 1 X 10-5 ㎍/㎖의 최종 농도를 얻었다. 희석된 루시페라아제 20㎕와 RT 루시페라아제 분석시약 100㎕를 혼합하여 반응 혼합액을 제조하였다. 반응 혼합액을 광도측정기(luminometer)에 놓고 생성된 빛을 1분 동안 매 10초 간격으로 측정하였 다. 상대적인 효소 농도(㎍/㎖)에 대한 초당 상대적인 빛 크기(RLU/s)를 나타내었다.
매번 페르플오로에칼린내 분말 루시페라아제 시료를 분석하였으며, 표준 루시페라아제 시료를 대조군으로 분석하였다. 표준 루시페라아제 분석은 루시페라아제 분석기질 1 바이알을 루시페라아제 분석완충액 10㎖에 먼저 용해시키고 적어도 30분 동안 RT에서 평형화시켜서 수행하였다. 다시 표준 루시페라아제 1 X 10-5 내지 1㎍/㎖ 범위의 농도를 얻기 위하여 최초의 농도에서 10배씩의 연속된 희석에 의하여 제조하였다. 희석된 루시페라아제 20㎕와 RT 루시페라아제 분석시약 100㎕를 혼합하여 반응 혼합액을 제조하였다. 반응 혼합액을 광도측정기에 놓고 생성된 빛을 1분 동안 매 10초 간격으로 측정하였다. 다시 상대적인 효소 농도(㎍/㎖)에 대한 초당 상대적인 빛 크기(RLU/s)를 나타내었다. 이때, 페르플루오로데칼린내 분말 루시페라아제의 활성을 표준 루시페라아제 활성과 비교하였다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.
실시예 11
박테리아 균주 Lactobacillus acidophilus를 상기 종에 특이적인 표준 프로토콜을 이용하여 2 리터 용량의 발효조에서 배양하였다. 발효조 세포수는 8.1 ∀ 0.73 X 108으로 계산되었다. 세포를 원심분리로 수확하고, 7.83 ∀ 0.75 X 109 세포수를 갖는 농도로 200㎖을 얻었다. 상기 세포 농도의 용액을 50%(w/w) 완충용액 에 용해시킨 40% 슈크로스, 10% 메틸 α-d-글루코피라노시드 800㎖를 포함하는 저장용액에 희석시켰다. 결과적인 혼합액을 폴리에틸렌 페트리디쉬 백(polyethylene Petri dish bag)에 300㎖을 채웠다. 남은 용액은 추후의 이용을 위하여 보관하였다. 알루미늄 틀로 지지되는 4 1/2 X 19 인치의 원통형 유리 용기(chamber)내에 위치한 부착장치에 빈 폴리에틸렌 백을 고정시켰다. 상기 유리 용기는 기포 생성에 의한 저장을 위한 전량 건조 용기로 작용하였다. 상기 시험용액을 실리콘 튜브의 길이만큼 폴리에틸렌 백에 채웠다. 또한 상기 유리 용기에 전체 튜브 길이를 따라 외부유리 워터자켓(external glass water jacket)를 설치하였다. 상기 자켓을 재순환하는 온도 조절된 수조에 연결하였다. 워터자켓은 상기 과정을 위한 가열원(heating source)으로 작용하였다. 유리 용기를 동결건조기의 응축기에 방출말단에 연결하였다. 기포형성 과정에 의한 저장의 종결시에, 진공상태가 건조 질소에 의해 중단되었다. 상기 백을 분리하여 검사하였다. 분명하게 건조하며 기계적으로 안정되지만 부서지기 쉬운 기포가 생성되었다. 상기 재료가 가볍게 손으로 눌러주었을 때, 모래와 같은 성질을 갖는 입자로 부드럽게 부서졌다. 상기 백을 절단하여 개봉하고 그 내용물을 깨끗한 용기로 이전하였다. 상기 용기를 3벌로 시료화하였다. 다시 상기 용기를 건조 질소로 정화한 후에 밀봉하였다. 상기 시료를 배양하고 동일 과정에 의하여 10㎖ 바이알에 건조시킨 Lactobacillus acidophilus 건조된-기포 1㎖의 대조군 배양과 비교하였다. 시험 박테리아 균주의 생존을 증명하는 결과를 표 10에 요약한다.
시료의 원천 | 플레이트당 평균 세포수 | 플레이트당 세포수의 표준편차 | 질량 분석 (g) | 희석된 부피 (ml) | 활성 세포/g | 시료당 평균 | 생존 세포 대 바이알 대조군(%) |
Bag A | 1.21E+0.9 | 0.91E+0.7 | 0.2415 | 2.4 | 1.21E+0.9 | 1.21E+0.9 | 92.50 |
Bag A | 1.09E+0.9 | 1.05E+0.8 | 0.3366 | 3.4 | 1.09E+0.9 | 83.10 | |
Bag A | 1.07E+0.9 | 1.07E+0.8 | 0.1848 | 1.8 | 1.07E+0.9 | 81.32 |
본 발명의 다양한 실시예를 수행하는 상기 설명된 방식은 지금까지 개시된 본 발명의 설명을 뒤따르는 다양한 방법으로 변형될 수 있음을 본 분야의 당업자들에게 분명히 인식될 것이다. 상기에서 설명된 실시예들은 본 발명을 한정하는 것이 아니며 단지 예시함에 그치는 것이고, 본 발명의 범위는 하기의 청구범위에 의하여 한정된다.
Claims (45)
- 다음을 포함하는, 거품 형성에 의한 보존에 적합한 조성물:실온 또는 그 이상의 온도에서 건조 및 저장시 생존력(viability)이 손실되기 쉬운 바이러스 또는 박테리아를 포함하는 살아있는 백신;메틸화된 단당류인 α-메틸 글루코스; 및,α-메틸 글루코스의 결정화를 최소화하고, 물질의 건조 및 저장시 비결정질 (amorphous) 상태에서의 안정성을 증가시키며, 수크로스(sucrose), 트레할로스 (trehalose), 말토덱스트린(maltodextrine), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolido ne) 및 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는, 부형제(filler).
- 제1항에 있어서,메틸화된 단당류는 조성물이 가지는 총 용질 질량(total solute mass)에 대하여 5% 내지 80%의 중량%를 구성하는 것을 특징으로 하는거품 형성에 의한 보존에 적합한 조성물.
- 제 1항에 있어서,메틸화된 단당류는 총 용질 질량에 대하여 20% 내지 60%의 중량%를 구성하는 것을 특징으로 하는거품 형성에 의한 보존에 적합한 조성물.
- 제 1항에 있어서,부형제는 조성물이 가지는 총 용질 질량에 대하여 5% 내지 80%의 중량%를 구성하는 이당류인 것을 특징으로 하는거품 형성에 의한 보존에 적합한 조성물.
- 제 1항에 있어서,이당류는 총 용질 질량에 대하여 20% 내지 60%의 중량%를 구성하는 것을 특징으로 하는거품 형성에 의한 보존에 적합한 조성물.
- 다음의 단계를 포함하는, 실온 또는 그 이상의 온도에서 건조 및 저장시 생존력이 손실되기 쉬운 바이러스 또는 박테리아를 포함하는 살아있는 백신을 보존하는 방법:바이러스 또는 박테리아를, 메틸화된 단당류인 α-메틸 글루코스 및, α-메틸 글루코스의 결정화를 최소화하고, 물질의 건조 및 저장시 비결정질(amorphous) 상태에서의 안정성을 증가시키며, 수크로스(sucrose), 트레할로스 (trehalose), 말토덱스트린(maltodextrine), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone) 및 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 부형제(filler)와 혼합하여, 보존 혼합물을 형성하는 단계; 및,상기 보존 혼합물을 건조하는 단계,이때, 건조 과정 및 이어지는 실온 또는 그 이상의 온도에서의 저장 과정 동안, 바이러스 또는 박테리아에서의 생존력의 적어도 일부가 유지된다.
- 제6항에 있어서,상기 살아있는 백신은 벡터로 형질전환된 박테리아, 원핵세포 또는 진핵세포인 것을 특징으로 하는살아있는 백신을 보존하는 방법.
- 제6항에 있어서,건조 단계는 동결 건조(freeze-drying), 탈수(desiccation), 분무 건조(spray-drying), 유동층 건조(fluidized bed drying), 진공에서의 건조(drying in a vacuum), 건조한 대기에서의 건조, 또는 거품 형성에 의한 건조에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는살아있는 백신을 보존하는 방법.
- 제6항에 있어서,메틸화된 단당류는 보존 혼합물이 가지는 총 용질 질량에 대하여 5% 내지 80%의 중량%를 구성하는 것을 특징으로 하는살아있는 백신을 보존하는 방법.
- 제9항에 있어서,메틸화된 단당류는 총 용질 질량에 대하여 20% 내지 60%의 중량%를 구성하는 것을 특징으로 하는살아있는 백신을 보존하는 방법.
- 제6항에 있어서,부형제는 수크로스 또는 트레할로스인 것을 특징으로 하는살아있는 백신을 보존하는 방법.
- 제6항에 있어서,부형제는 보존 혼합물이 가지는 총 용질 질량에 대하여 5% 내지 80%의 중량%를 구성하는 것을 특징으로 하는살아있는 백신을 보존하는 방법.
- 제12항에 있어서,부형제는 총 용질 질량에 대하여 20% 내지 60%의 중량%를 구성하는 것을 특징으로 하는살아있는 백신을 보존하는 방법.
- 제6항에 있어서,적어도 하나의 부형제는 수크로스이고, 수크로스 대 α-메틸 글루코스의 비는 4:1 내지 1:2인 것을 특징으로 하는살아있는 백신을 보존하는 방법.
- 제6항에 있어서,혼합하는 단계는,바이러스, 박테리아 또는 세포에 메틸화된 단당류를 적재하는(loading) 단계, 및그 다음 적어도 하나의 부형제를 첨가하여 보존 혼합물을 형성하는 단계를 포함하는적어도 두 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는살아있는 백신을 보존하는 방법.
- 제15항에 있어서,적재 단계는 메틸화된 단당류를 포함하는 용액 내에서 바이러스, 박테리아 또는 다른 생물의 평형을 만들어서 이루어지는 것을 특징으로 하는것을 특징으로 하는살아있는 백신을 보존하는 방법.
- 제6항에 있어서,2차 건조 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는살아있는 백신을 보존하는 방법.
- 제17항에 있어서,상기 2차 건조 단계는 0° 내지 100°의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는살아있는 백신을 보존하는 방법.
- 제18항에 있어서,상기 2차 건조 단계는 유리전이온도가 0° 내지 70°의 범위 내에서 일정 저장온도 이상으로 상승할 때까지 지속되는 것을 특징으로 하는살아있는 백신을 보존하는 방법.
- 제6항에 있어서,상기 건조 단계는 진공 하에서 끓여 안정적인 거품을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는살아있는 백신을 보존하는 방법.
- 제20항에 있어서,상기 안정적인 거품을 분쇄하여 파우더를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는살아있는 백신을 보존하는 방법.
- 제21항에 있어서,상기 파우더를 2차 건조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는살아있는 백신을 보존하는 방법.
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