CN107224579A - 一种用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种用传代细胞系生产猪伪狂犬病活疫苗的方法。本发明所用传代细胞系为Vero细胞，通过制苗用细胞的传代与培养、细胞毒种的繁殖、制苗毒液的繁殖及配苗、分装及冻干操作步骤制得。利用本发明生产方法得到的猪伪狂犬病毒含量高、效价高；最终制得的疫苗稳定性高，保存时间长。

Description

一种用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种用传代细胞系生产猪伪狂犬病活疫苗的方法。
背景技术
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒引起一种急性传染病。该传染病遍布世界主要养猪国家。免疫接种是预防猪伪狂犬病的主要措施。我国目前生产猪伪狂犬病活疫苗所用的细胞未鸡胚成纤维细胞和ST细胞。由于每批鸡胚原材料的差异，使得鸡胚成纤维原代细胞的批间差异大；用鸡胚成纤维细胞培养猪伪狂犬病病毒的病毒滴度不高，给疫苗产量、效力的提高带来困难，而且细胞碎片与杂蛋白多，容易引起过敏反应。
中国专利(CN101695573B)提供了一种用传代细胞源生产伪狂犬病活疫苗的方法及其伪狂犬病活疫苗产品。该方法包括如下步骤：用传代细胞培养伪狂犬病病毒弱毒株；收获得到的细胞培养毒液；再加入稳定剂和抗生素，经冷冻真空干燥得到传代细胞源伪狂犬病活疫苗。传代细胞为猪睾丸传代细胞ST、猪肾传代细胞PK15或IBRS-2。而ST细胞来源于猪，容易带上外源病毒，从而对生产猪伪狂犬病活疫苗有很大的影响。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法，所用传代细胞系为Vero细胞。利用本发明生产方法得到的病毒含量高，批间差异小；所得猪伪狂犬活疫苗稳定性高，保存时间长。
本发明通过以下技术方案实现：
一种用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.制苗用细胞的传代与培养：将传代细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成单层时，用于继续传代或接种病毒；
S2.细胞毒种的繁殖：将伪狂犬病病毒弱毒株接种生长良好的上述传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；2～3日后收获细胞培养毒液作为生产用毒种；
S3.制苗毒液的繁殖：取已形成单层的上述传代细胞培养瓶，弃去细胞生长液，接种上述含毒的维持液，继续培养；接毒后2～3日收获细胞培养毒液，收获的毒液置-15℃以下保存；
S4.配苗、分装及冻干：将病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；分装后进行冷冻真空干燥后即得；
所述稳定剂由以下成分及其终浓度组成：白蛋白3-6％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2-3％w/v、L-谷氨酸0.5-1.5％w/v、腐胺1-3％w/v、蔗糖2-5％w/v和柠檬酸钠3-7％w/v。
优选地，所用传代细胞系为Vero细胞。
优选地，步骤S1所述细胞生长液包括以下成分及其含量：DMEM液85-90％，无患子皂苷1-5％和新生牛血清5-14％。
优选地，步骤S1所述细胞生长液由以下成分及其含量组成：DMEM液89％，糖萜素0.25％，无患子皂苷2.75％和新生牛血清8％；且pH值为7.0-7.2。
优选地，步骤S2所述细胞维持液包括以下成分及其含量：DMEM液93-95％，蔗糖1-3％，乳酸链球菌肽0.01-0.05％，甘油0.5-1.5％，糖萜素0.1-0.3％和新生牛血清2-5.5％；
优选地，步骤S2所述细胞维持液由以下成分及其含量组成：DMEM液94％，蔗糖2％，乳酸链球菌肽0.03％，甘油1％和新生牛血清3％，且pH值为7.0-7.4。
优选地，步骤S2所述稳定剂由以下成分及其终浓度组成：白蛋白4％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2.5％w/v、L-谷氨酸1％w/v、腐胺2.75％w/v、蔗糖3.5％w/v和柠檬酸钠5％w/v。
优选地，步骤S3接种时的接种量为1％～2％体积百分比的生产用细胞种毒的维持液。
无患子皂苷含有丰富的糖苷类物质，主要为三萜皂苷类、倍半萜糖苷类，除此外还含有丰富的营养物质，如：还原糖，脂肪酸，油脂，油酸，类胡萝卜素，菸酸，核黄素，蛋白质，维生素C、维生素A、维生素B及赖氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸和组氨酸等10多种氨基酸，是一种天然的非离子型表面活性剂。在本发明细胞生长液中加入无患子皂苷有利于Vero细胞的传代培养，并且由实施例1制备得到的病毒效价明显高于对比例1，说明由本发明含有无患子皂苷的细胞生长液所培养得到的Vero细胞有利于伪狂犬病病毒的增殖和病毒液分泌。
本发明细胞维持液除DMEM和新生牛血清成分外，还含有蔗糖、乳酸链球菌肽、甘油和糖萜素成分。这些成分的加入不仅能够促进病毒液的分泌，而且还对病毒液具有保护作用。
本发明所用的稳定剂由白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、L-谷氨酸、腐胺、蔗糖2和柠檬酸钠组成，由试验例3可知，本发明稳定剂疫苗保护作用显著。
本发明用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法，与现有技术相比，具有以下优异效果：
(1)本发明以Vero细胞作为传代细胞系，能够制得高效价的病毒液，从而克服了用鸡胚成纤维细胞培养猪伪狂犬病病毒的病毒滴度不高、细胞碎片与杂蛋白多，容易引起过敏反应的问题；
(2)本发明制备得到的疫苗稳定性高、保持期长，从而有利于猪伪狂犬活疫苗的运输和贮存。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
无患子皂苷购于四川三禾田生物技术有限公司；新生牛血清购于南京迪安生物科技有限公司；乳酸链球菌肽CAS号1414455，购于上海将来实业股份有限公司。
实施例1一种用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法
所述用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法，分为以下步骤：
S1.制苗用Vero细胞的传代与培养：将传代细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成单层时，用于继续传代或接种病毒；
所述细胞生长液由以下成分及其含量：DMEM液89％，无患子皂苷3％和新生牛血清8％；且pH值为7.2；
S2.Vero细胞毒种的繁殖：将伪狂犬病病毒弱毒株接种生长良好的上述传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；3日后收获细胞培养毒液作为生产用毒种；
所述细胞维持液由以下成分及其含量组成：DMEM液94％，蔗糖2％，乳酸链球菌肽0.03％，甘油1％，糖萜素0.25％和新生牛血清3％，且pH值为7.4；
S3.制苗毒液的繁殖：取已形成单层的上述传代细胞培养瓶，弃去细胞生长液，接种上述含毒的维持液，接种量为1.5％，继续培养；接毒后3日收获细胞培养毒液，收获的毒液置-15℃以下保存；
S4.配苗、分装及冻干：将病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；分装后进行冷冻真空干燥后即得；
所述稳定剂由以下成分及其终浓度组成：白蛋白4％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2.5％w/v、L-谷氨酸1％w/v、腐胺2.75％w/v、蔗糖3.5％w/v和柠檬酸钠5％w/v。
实施例2一种用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法
所述用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法，分为以下步骤：
S1.制苗用Vero细胞的传代与培养：将传代细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成单层时，用于继续传代或接种病毒；
所述细胞生长液包括以下成分及其含量：DMEM液90％，无患子皂苷1％和新生牛血清9％；
S2.Vero细胞毒种的繁殖：将伪狂犬病病毒弱毒株接种生长良好的上述传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；3日后收获细胞培养毒液作为生产用毒种；
所述细胞维持液包括以下成分及其含量：DMEM液93％，蔗糖1％，乳酸链球菌肽0.01％，甘油0.5％，糖萜素0.1％和新生牛血清5.39％；
S3.制苗毒液的繁殖：取已形成单层的上述传代细胞培养瓶，弃去细胞生长液，接种上述含毒的维持液，接种量为1％，继续培养；接毒后3日收获细胞培养毒液，收获的毒液置-15℃以下保存；
S4.配苗、分装及冻干：将病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；分装后进行冷冻真空干燥后即得；
所述稳定剂由以下成分及其终浓度组成：白蛋白3％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2％w/v、L-谷氨酸0.5％w/v、腐胺1％w/v、蔗糖2％w/v和柠檬酸钠3％w/v。
实施例3一种用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法
所述用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法，分为以下步骤：
S1.制苗用Vero细胞的传代与培养：将传代细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成单层时，用于继续传代或接种病毒；
所述细胞生长液包括以下成分及其含量：DMEM液85％，无患子皂苷5％和新生牛血清8.7％；
S2.Vero细胞毒种的繁殖：将伪狂犬病病毒弱毒株接种生长良好的上述传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；3日后收获细胞培养毒液作为生产用毒种；
所述细胞维持液包括以下成分及其含量：DMEM液93％，蔗糖3％，乳酸链球菌肽0.05％，甘油1.5％，糖萜素0.3％和新生牛血清2.15％；
S3.制苗毒液的繁殖：取已形成单层的上述传代细胞培养瓶，弃去细胞生长液，接种上述含毒的维持液，接种量为2％，继续培养；接毒后2日收获细胞培养毒液，收获的毒液置-15℃以下保存；
S4.配苗、分装及冻干：将病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；分装后进行冷冻真空干燥后即得；
所述稳定剂由以下成分及其终浓度组成：白蛋白6％w/v、聚乙烯吡咯烷酮3％w/v、L-谷氨酸1.5％w/v、腐胺3％w/v、蔗糖5％w/v和柠檬酸钠7％w/v。
对比例1一种用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法
所述用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法与实施例1的区别在于步骤S1细胞生长液中不含有无患子皂苷，其它步骤均与实施例1类似。
对比例2一种用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法
所述用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法与实施例1的区别在于步骤S2细胞维持液中不含有糖萜素，其它步骤均与实施例1类似。
对比例3一种用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法
所述用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法与实施例1的区别在于步骤S4所述稳定剂中不含L-酪氨酸，其它步骤均与实施例1类似。
试验例1病毒效价检测
以Vero细胞为传代细胞，分别按照实施例1-3及对比例1-3用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法制备猪伪狂犬病病毒液B1、B2、B3、B4、B5和B6，按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验，结果证明无细菌、霉菌、支原体生长；并对病毒液进行效价测定，具体结果如表1所示。
表1不同病毒液效价
毒液 效价(TCID50/mL)
B1 108.3
B2 108.1
B3 108.2
B4 107.5
B5 107.8
B6 107.9
由表1可知，利用实施例1-3生产方法得到的病毒效价均在108TCID50/mL左右，说明利用传代细胞系Vero细胞可以生产高效价猪伪狂犬活疫苗；并且均高于对比例1、对比例2生产得到的病毒液，说明本发明生产过程中所用细胞生长液和细胞维持液中有利于病毒繁殖和病毒液分泌。
试验例2疫苗成品检验
取实施例1-3及对比例1-3制备得到的疫苗，按照《中华人民共和国兽药典》(2010年版)进行成品检验，每头份疫苗含病毒分别为108TCID50、107.6TCID50、107.8TCID50、106.8TCID50、106.5TCID50、107.0TCID50，符合“伪狂犬病活疫苗”的规定，每头份疫苗含病毒≥106TCID50。
试验例3疫苗的稳定性试验
将试验例2中制备得到的每份疫苗分为两份分别置于4℃条件下保存，不同时间取样，测定病毒含量，分别如表2所示。
表2 4℃条件下保存期试验
由表2数据可以看出本发明制备得到的猪伪狂犬活疫苗在4℃条件下，能够保持15天，其效价下降不超过0.5个滴度，具有显著的稳定性，尤其是与对比例相比3相比，稳定性更为突出，这说明本发明所用稳定剂对疫苗保护效果显著。

Claims (8)

1.一种用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.制苗用细胞的传代与培养：将传代细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成单层时，用于继续传代或接种病毒；
S2.细胞毒种的繁殖：将伪狂犬病病毒弱毒株接种生长良好的上述传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；2～3日后收获细胞培养毒液作为生产用毒种；
S3.制苗毒液的繁殖：取已形成单层的上述传代细胞培养瓶，弃去细胞生长液，接种上述含毒的维持液，继续培养；接毒后2～3日收获细胞培养毒液，收获的毒液置-15℃以下保存；
S4.配苗、分装及冻干：将病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；分装后进行冷冻真空干燥后即得；
所述稳定剂由以下成分及其终浓度组成：白蛋白3-6％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2-3％w/v、L-谷氨酸0.5-1.5％w/v、腐胺1-3％w/v、蔗糖2-5％w/v和柠檬酸钠3-7％w/v。
2.根据权利要求1所述用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于，所用传代细胞系为Vero细胞。
3.根据权利要求1所述用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于，步骤S1所述细胞生长液包括以下成分及其含量：DMEM液85-90％，无患子皂苷1-5％和新生牛血清5-14％。
4.根据权利要求3所述用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于，步骤S1所述细胞生长液由以下成分及其含量组成：DMEM液89％，无患子皂苷3％和新生牛血清8％；且pH值为7.0-7.2。
5.根据权利要求1所述用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于，步骤S2所述细胞维持液包括以下成分及其含量：DMEM液93-95％，蔗糖1-3％，乳酸链球菌肽0.01-0.05％，甘油0.5-1.5％，糖萜素0.1-0.3％和新生牛血清2-5.5％。
6.根据权利要求5所述用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于，步骤S2所述细胞维持液由以下成分及其含量组成：DMEM液94％，蔗糖2％，乳酸链球菌肽0.03％，甘油1％，糖萜素0.25％和新生牛血清2.75％，且pH值为7.0-7.4。
7.根据权利要求1所述用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于，步骤S2所述稳定剂由以下成分及其终浓度组成：白蛋白4％w/v、聚乙烯吡咯烷 酮2.5％w/v、L-谷氨酸1％w/v、腐胺2.75％w/v、蔗糖3.5％w/v和柠檬酸钠5％w/v。
8.根据权利要求1所述用传代细胞系生产猪伪狂犬活疫苗的方法，其特征在于，步骤S3接种时的接种量为1％～2％体积百分比的生产用细胞种毒的维持液。
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