山羊痘病毒的增殖方法、山羊痘活疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及疫苗制备技术领域,尤其是涉及一种山羊痘病毒的增殖方法、山羊痘活疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
山羊痘是由山羊痘病毒起的一种严重危害山羊的高度接触性传染病。山羊痘广泛分布于亚洲、欧洲、北美和非洲许多国家,目前主要在非洲、中东及亚洲的一些国家流行,对养羊业造成极大的危害,国际动物卫生组织(OIE)将该病被列为A类重大传染病,我国也将其列为一类动物疾病。建国初期山羊痘主要发生在内蒙古、甘肃、宁夏、新疆、西藏、浙江、河北等9省区。20世纪60年代中期全国各地贯彻执行以预防为主的综合防疫措施,使该病在我国得到有效的控制。但近年来山羊痘又开始在各地频频暴发,而且越来越严重。
当前接种山羊痘活疫苗是预防山羊痘最为有效的方法。山羊痘活疫苗一般采集4月龄以内的绵羊睾丸细胞制备,主要在每年的3-5月,生产季节性很强。另外,由于绵羊睾丸是从个体养殖户处采集,数量时多时少,不稳定。因而细胞批量时多时少,批次较多。
传统的山羊痘病毒制备方法是采集羊睾丸、制备羊睾丸原代细胞在转瓶上进行贴壁培养,但存在以下缺点,制约了该疫苗的批量稳定生产。
1.羊睾丸获取困难,需在羊场采集羊睾丸,季节性强,存在采集人员感染布病风险。
2.原代细胞质量不稳定、易污染、难以控制,导致疫苗质量批间差异较大。
3.采用贴壁细胞的转瓶培养工艺进行生产,操作繁琐、易污染、工作量大,成为当前该疫苗规模化生产的主要障碍。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种山羊痘病毒的增殖方法,该方法实现了细胞系的大规模悬浮培养,提高了病毒对细胞的适应性,缓解了病毒毒价低且不稳定的技术问题。
本发明的第二个目的在于提供一种山羊痘病毒在疫苗制备中的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种山羊痘活疫苗的制备方法,该方法工艺简单,成本低,缓解了疫苗制备过程中损伤病毒,疫苗稳定性差,保存时间短的技术问题。
本发明的第四个目的在于提供一种山羊痘活疫苗,该疫苗安全有效。
本发明的第五个目的在于提供一种山羊痘活疫苗在山羊痘防控中的应用。
为了解决上述技术问题,特采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种山羊痘病毒的增殖方法,包括以下步骤:
将山羊痘病毒在悬浮培养细胞系上传代驯化,得到驯化病毒;
将细胞系进行悬浮扩大培养;
将驯化病毒接种至扩大培养的细胞系上,经培养得到增殖病毒。
作为进一步技术方案,所述山羊痘病毒为山羊痘病毒AV41株;
所述细胞系包括MDBK、Vero或ST细胞系。
作为进一步技术方案,所述传代驯化包括以下步骤:
每2.0×106~4.0×106个/mL浓度的细胞系接种山羊痘病毒的量为0.005~0.02MOI,培养48~120小时,得到驯化病毒;
优选地,每2.0×106个/mL浓度的细胞系接种山羊痘病毒的量为0.01MOI,培养96小时,得到驯化病毒;
优选地,所述传代驯化的培养参数至少满足如下一种:温度36~38℃、5%CO2、相对湿度>60%、转速120~130rpm;
优选地,将所述山羊痘病毒传代驯化4~6代。
作为进一步技术方案,所述悬浮扩大培养包括以下步骤:
将细胞系进行摇瓶悬浮培养,然后将摇瓶悬浮培养的细胞进行第一次悬浮扩大培养,培养至细胞密度为7×106~9.0×106个/mL,再进行第二次悬浮扩大培养,培养至细胞密度为7×106~9.0×106个/mL;
优选地,摇瓶的接种密度为0.9×106~1.2×106个/mL;
优选地,摇瓶的培养参数至少满足如下一种:温度36~38℃、5%CO2、相对湿度>60%、转速120~130rpm;
优选地,第一次悬浮扩大培养包括:将摇瓶悬浮培养的细胞接种到5L摇袋式反应器进行悬浮培养;
优选地,5L摇袋式反应器的接种密度为0.9×106~1.2×106个/mL;
优选地,5L摇袋式反应器的培养参数至少满足如下一种:转速35~45r/min、温度36~38℃、溶氧值40%~60%、pH值7.0~7.2、通气量50~300mL/min,培养体积2.5~5.0L;
优选地,第二次悬浮扩大培养包括:将第一次扩大培养的细胞接种到50L摇袋式反应器进行悬浮培养;
优选地,50L摇袋式反应器的接种密度为0.9×106~1.2×106个/mL;
优选地,50L摇袋式反应器的培养参数至少满足如下一种:转速35~45r/min、温度36~38℃、溶氧值40%~60%、pH值7.0~7.2、通气量50~300mL/min、培养体积20~50L。
作为进一步技术方案,所述驯化病毒的接种剂量为0.005~0.02MOI,优选为0.01MOI;
作为进一步技术方案,所述驯化病毒接种细胞系的细胞浓度为2.0×106~4.0×106个/mL,优选为2.0×106个/mL;
作为进一步技术方案,所述驯化病毒接种后,培养时间为72~96h,优选为96h;
作为进一步技术方案,所述驯化病毒接种后,培养参数至少满足如下一种:转速35~45r/min、温度36~38℃、溶氧值40%~60%、pH值7.0~7.2、通气量50~300mL/min。
第二方面,本发明提供了一种山羊痘活病毒在疫苗制备中的应用。
第二方面,本发明提供了一种山羊痘活疫苗的制备方法,包括以下步骤:
将应用山羊痘病毒的增殖方法增殖得到的山羊痘病毒加入病毒保护液,得到病毒液;
将病毒液与耐热冻干保护剂混合,制备得到山羊痘活疫苗;
其中,耐热冻干保护剂为水溶液,包含海藻糖20~50g/L、明胶5~20g/L、聚乙烯吡咯酮5~40g/L、组氨酸0.5~3g/L和维生素C1~4g/L。
作为进一步技术方案,所述山羊痘病毒加入病毒保护液前还要经过纯化过滤步骤,纯化过滤步骤包括去除细胞碎片、培养基、细胞代谢产物和菌;
作为进一步技术方案,所述病毒保护液为含0.5~1%BSA、1~3%蔗糖、1~2.5%芦荟多糖、0.01%硫柳汞和0.05%吐温-20的0.01mol/L的PBS溶液;
作为进一步技术方案,所述病毒液中,病毒与病毒保护液的体积比为1:45~55,优选为1:50。
作为进一步技术方案,所述病毒液与耐热冻干保护剂混合的体积比为1:0.8~1.2,优选为1:1。
第三方面,本发明提供了一种应用山羊痘活疫苗的制备方法制备得到的山羊痘活疫苗。
第四方面,本发明提供了一种山羊痘活疫苗在山羊痘防控中的应用。
与现有技术相比,本发明提供的山羊痘病毒的增殖方法、山羊痘活疫苗及其制备方法和应用具有如下有益效果:
本发明提供的山羊痘病毒的增殖方法,首先将山羊痘病毒在悬浮培养细胞系上传代驯化,得到驯化病毒,然后将驯化后病毒接种至经过悬浮扩大培养的细胞系上,经培养得到增殖病毒。本发明的病毒增殖方法通过对病毒传代驯化培养,提高了病毒对细胞的适应性;通过对细胞系进行悬浮扩大培养,实现了细胞系的高密度大规模培养,有利于病毒的大批量增殖,缓解了病毒毒价低且不稳定的技术问题。
本发明提供的山羊痘病毒活疫苗的制备方法,首先将增殖得到的病毒进行纯化过滤,加入病毒保护液,得到病毒液,然后将病毒液与耐热冻干保护剂混合,低温冻干,制备得到山羊痘活疫苗。该方法工艺简单,成本低,提高了疫苗中病毒的含量,而且病毒经过提纯,配合耐热冻干保护剂,降低了病毒在冻干过程中的损伤,缓解了疫苗稳定性差,保存时间短的技术问题。
本发明提供的山羊痘活疫苗安全有效,稳定性强,在2~8℃下能够保存36个月,能够用于山羊痘的防控。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例5提供的病毒对照组细胞病变图;
图2为本发明实施例5提供的空白对照组细胞病变图;
图3为本发明实施例5提供的中和试验组细胞病变图;
图4为本发明实施例5提供的病毒对照组免疫荧光图;
图5为本发明实施例5提供的空白对照组免疫荧光图;
图6为本发明实施例5提供的中和试验组免疫荧光图。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施方式和实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面,在一些具体的实施方式中提供了一种山羊痘病毒的增殖方法,包括以下步骤:
将山羊痘病毒在悬浮培养细胞系上传代驯化,得到驯化病毒;
将细胞系进行悬浮扩大培养;
将驯化病毒接种至扩大培养的细胞系上,经培养得到增殖病毒。
山羊痘是由山羊痘病毒起的一种严重危害山羊的高度接触性传染病。目前最为有效的预防方式为接种山羊痘活疫苗,其疫苗原料为山羊痘病毒。传统的山羊痘病毒制备方法是采集羊睾丸,制备羊睾丸原代细胞,将原代细胞在转瓶上进行贴壁培养,接种病毒并培养。但该方法存在着羊睾丸获取困难、原代细胞质量不稳定、工艺繁琐等问题制约了该疫苗的批量稳定生产。有鉴于此,特提出本发明的上羊痘病毒增殖方法,包括以下步骤:
首先,将山羊痘病毒在悬浮培养细胞系上传代驯化,得到驯化病毒。病毒传代驯化法,即将预驯化的病毒接种到相应的宿主细胞上,收获后利用收获液继续感染该细胞,如此重复传代,使病毒逐步适应该细胞基质,达到一定的滴度,满足生产疫苗及提高生产效率的需求。本发明通过将山羊痘病毒在悬浮培养细胞系上传代驯化,得到适应该细胞系、产量高且稳定的驯化病毒。
然后,将细胞系进行悬浮扩大培养。山羊痘病毒的宿主细胞为动物细胞,而动物细胞在培养过程中通常是贴壁生长,培养密度低。现有技术中,山羊痘病毒的培养就是在贴壁细胞上培养的,病毒产量低。在本发明中以悬浮培养的方式对细胞系进行扩大培养,能够培养得到大量高浓度的细胞,将这些细胞作为病毒接种的宿主细胞。
最后,将驯化病毒接种至扩大培养的细胞系上,经培养得到增殖病毒。病毒经细胞系驯化后,对该细胞系的适应性增强,再将驯化病毒接种至相同的细胞系后,缩短了病毒对宿主的适应时间,有助于提高病毒产量,经过适宜的条件培养增殖后,最终得到增殖病毒。
本发明的病毒增殖方法通过对病毒传代驯化培养,提高了病毒对细胞的适应性;通过对细胞系进行悬浮扩大培养,实现了细胞系的高密度大规模培养,有利于病毒的增殖,缓解了病毒毒价低且不稳定的技术问题。
在一些优选的实施方式中,山羊痘病毒为山羊痘病毒AV41株。
山羊痘病毒AV41株毒性弱,能够用于制备山羊痘活疫苗,在本发明中以山羊痘病毒AV41株为研究对象,设计病毒增殖工艺。
在一些优选的实施方式中,细胞系包括但不限于MDBK、Vero或ST细胞系,或者其他能够悬浮培养并增殖山羊痘病毒的其他细胞系。
MDBK细胞系来自于表观正常牛的肾脏细胞;Vero细胞系为从正常的成年非洲绿猴肾细胞获得的转化细胞;ST细胞系来自于正常猪的睾丸细胞。以上三种细胞系均能够作为宿主用于山羊痘病毒的培养。在本发明中,通过优化操作参数,采用无血清培养基等手段实现了三种细胞系的悬浮培养,并以此细胞为宿主,用于山羊痘细胞的增殖。
在一些优选的实施方式中,所述传代驯化包括以下步骤:
每2.0×106~4.0×106个/mL浓度的细胞系接种山羊痘病毒的量为0.005~0.02MOI,培养48~120小时,得到驯化病毒。
在本发明中,细胞系浓度典型但非限制性的为2.0×106个/mL、2.5×106个/mL、3.0×106个/mL、3.5×106个/mL或4.0×106个/mL。病毒接种时需要保证细胞系浓度在一定范围内,浓度过低会导致接种病毒的增殖速度降低,浓度过高,会影响宿主对营养物质的摄入,同样会降低病毒的增殖量。
病毒接种量典型但非限制性的为0.005MOI、0.008MOI、0.01MOI、0.013MOI、0.015MOI、0.018MOI或0.02MOI。将一定量的病毒接种宿主细胞后,经过吸附、侵入、增殖、装配和释放步骤完成病毒的复制,释放出来的病毒会继续感染相邻细胞,最终得到大量的病毒。病毒接种量受宿主细胞量的影响,接种量过大会导致病毒的不必要浪费,接种量过小则会导致病毒增殖不完全,增殖量低。
培养时间典型但非限制性的为48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时或120小时。病毒接种宿主细胞,完成复制释放后会继续感染相邻的宿主细胞,直至所有宿主细胞被裂解。在本发明中,通过选择合适的培养时间,使宿主细胞充分感染,提高病毒的增殖量。
优选地,每2.0×106个/mL浓度的细胞系接种山羊痘病毒的量为0.01MOI,培养96小时,得到驯化病毒。
在本发明中,通过对细胞系浓度、病毒接种量及培养时间的进一步优化和调整,使得培养后病毒的产量更高。
优选地,传代驯化的培养参数至少满足如下一种:温度36~38℃、5%CO2、相对湿度>60%、转速120~130rpm。
在本发明中,设置合适的培养条件,对病毒进行传代驯化培养。病毒传代驯化培养温度典型但非限制性的为36℃、36.3℃、36.5℃、36.8℃、37℃、37.3℃、37.5℃、37.8℃或38℃;相对湿度典型但非限制性的为60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%;转速典型但非限制性的为120rpm、121rpm、122rpm、123rpm、124rpm、125rpm、126rpm、127rpm、128rpm、129rpm或130rpm。通过选择合适的培养条件,实现病毒快速稳定的传代驯化。
优选地,将山羊痘病毒传代驯化4~6代。
在本发明中,山羊痘病毒传代驯化典型但非限制性的为4代、5代或6代。病毒经过传代驯化后,会提高其子代对同一宿主细胞的适应性,一般来说,随着病毒传代驯化次数的增多,子代病毒的适应性会逐渐增强,直至稳定。在本发明中,山羊痘病毒经过5代传代驯化后,病毒对宿主细胞的适应性趋于不变。
在一中优选的实施方式中,将生长良好、浓度为4.0×106个/mL的细胞系置于500mL摇瓶中,按0.02MOI剂量接种病毒,培养条件为:温度36~38℃、5%CO2、相对湿度60%、转速125rpm。取培养96小时的病毒为子代,按此方式传代驯化5代。对得到的驯化病毒进行特异性检测,结果如图1-6所示。从结果中可知,应用本发明提供的山羊痘病毒的增殖方法增殖得到的病毒特异性良好。
在一些优选的实施方式中,悬浮扩大培养包括以下步骤:
将细胞系进行摇瓶悬浮培养,然后将摇瓶悬浮培养的细胞进行第一次悬浮扩大培养,培养至细胞密度为7×106~9.0×106个/mL,再进行第二次悬浮扩大培养,培养至细胞密度为7×106~9.0×106个/mL。
在本发明中,以悬浮扩大培养的方式得到大批量的宿主细胞,为病毒的增殖提供宿主。两次扩大培养后,培养液中的细胞密度典型但非限制性的为7.0×106个/mL、7.3×106个/mL、7.5×106个/mL、7.8×106个/mL、8.0×106个/mL、8.3×106个/mL、8.5×106个/mL、8.8×106个/mL或9.0×106个/mL。培养至细胞密度为此范围内的细胞,在保证细胞质量的前提下,细胞数量最高。
优选地,摇瓶的接种密度为0.9×106~1.2×106个/mL,典型但非限制性的摇瓶接种密度为0.9×106个/mL、0.95×106个/mL、1.0×106个/mL、1.05×106个/mL、1.1×106个/mL、1.15×106个/mL或1.2×106个/mL。摇瓶培养至此密度下的细胞,细胞的质量好,数量多,适宜接种和扩大培养。
优选地,摇瓶的培养参数至少满足如下一种:温度36~38℃、5%CO2、相对湿度>60%、转速120~130rpm。
在本发明中,摇瓶培养温度典型但非限制性的为36℃、36.3℃、36.5℃、36.8℃、37℃、37.3℃、37.5℃、37.8℃或38℃;相对湿度典型但非限制性的为60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%;转速典型但非限制性的为120rpm、121rpm、122rpm、123rpm、124rpm、125rpm、126rpm、127rpm、128rpm、129rpm或130rpm。通过对摇瓶培养参数的进一步调整,使得摇瓶培养的得到的细胞质量更好,细胞数量更多。
优选地,第一次悬浮扩大培养包括:将摇瓶悬浮培养的细胞接种到5L摇袋式反应器进行悬浮培养。
优选地,5L摇袋式反应器的接种密度为0.9×106~1.2×106个/mL,典型但非限制性的接种密度为0.9×106个/mL、0.95×106个/mL、1.0×106个/mL、1.05×106个/mL、1.1×106个/mL、1.15×106个/mL或1.2×106个/mL。
优选地,5L摇袋式反应器的培养参数至少满足如下一种:转速35~45r/min、温度36~38℃、溶氧值40%~60%、pH值7.0~7.2、通气量50~300mL/min,培养体积2.5~5.0L。
在本发明中,5L摇袋式反应器的培养转速典型但非限制性的为35r/min、36r/min、37r/min、38r/min、39r/min、40r/min、41r/min、42r/min、43r/min、44r/min或45r/min;温度典型但非限制性的为36℃、36.3℃、36.5℃、36.8℃、37℃、37.3℃、37.5℃、37.8℃或38℃;溶氧值典型但非限制性的为43%、45%、48%、50%、53%、55%、58%或60%;pH值典型但非限制性的为7.0、7.05、7.1、7.15或7.2;通气量典型但非限制性的为50mL/min、80mL/min、100mL/min、130mL/min、150mL/min、180mL/min、200mL/min、230mL/min、250mL/min、280mL/min或300mL/min;培养体积典型但非限制性的为2.5L、3.0L、3.5L、4.0L、4.5L或5.0L。
在本发明中,通过对5L摇袋式反应器培养参数的进一步调整和优化,使得摇瓶培养的得到的细胞质量更好,细胞数量更多。
优选地,第二次悬浮扩大培养包括:将第一次扩大培养的细胞接种到50L摇袋式反应器进行悬浮培养。
优选地,50L摇袋式反应器的接种密度为0.9×106~1.2×106个/mL,典型但非限制性的接种密度为0.9×106个/mL、0.95×106个/mL、1.0×106个/mL、1.05×106个/mL、1.1×106个/mL、1.15×106个/mL或1.2×106个/mL。
优选地,50L摇袋式反应器的培养参数至少满足如下一种:转速35~45r/min、温度36~38℃、溶氧值40%~60%、pH值7.0~7.2、通气量50~300mL/min、培养体积20~50L。
在本发明中,50L摇袋式反应器的培养转速典型但非限制性的为35r/min、36r/min、37r/min、38r/min、39r/min、40r/min、41r/min、42r/min、43r/min、44r/min或45r/min;温度典型但非限制性的为36℃、36.3℃、36.5℃、36.8℃、37℃、37.3℃、37.5℃、37.8℃或38℃;溶氧值典型但非限制性的为43%、45%、48%、50%、53%、55%、58%或60%;pH值典型但非限制性的为7.0、7.05、7.1、7.15或7.2;通气量典型但非限制性的为50mL/min、80mL/min、100mL/min、130mL/min、150mL/min、180mL/min、200mL/min、230mL/min、250mL/min、280mL/min或300mL/min;培养体积典型但非限制性的为20L、25L、30L、35L、40L、45L或50L。
在本发明中,通过对50L摇袋式反应器培养参数的进一步调整和优化,使得摇瓶培养的得到的细胞质量更好,细胞数量更多。
在一些优选的实施方式中,驯化病毒的接种剂量为0.005~0.02MOI,典型但非限制性的接种剂量为0.005MOI、0.008MOI、0.01MOI、0.013MOI、0.015MOI、0.018MOI或0.02MOI,优选为0.01MOI。通过对驯化病毒接种剂量更进一步的优化和调整,使得增殖得到的病毒量更多。
在一些优选的实施方式中,驯化病毒接种细胞系的细胞浓度为2.0×106~4.0×106个/mL,典型但非限制性的细胞浓度为2.0×106个/mL、2.3×106个/mL、2.5×106个/mL、2.8×106个/mL、3.0×106个/mL、3.3×106个/mL、3.5×106个/mL、3.8×106个/mL或4.0×106个/mL,优选为2.0×106个/mL。
在本发明中,细胞系经过扩大培养得到了细胞密度为7×106~9.0×106个/mL的细胞系,但是此浓度远高于病毒接种的细胞浓度,需要将扩增得到的细胞密度稀释至2.0×106~4.0×106个/mL,在此浓度下接种病毒,病毒产量更高。
在一些优选的实施方式中,所述驯化病毒接种后,培养时间为72~96h,典型但非限制性的培养时间为72h、75h、78h、81h、84h、87h、90h、93h或96h,优选为96h。
在本发明中,通过选择合适的培养时间,使宿主细胞充分感染,提高病毒的增殖量。
在一些优选的实施方式中,驯化病毒接种后,培养参数至少满足如下一种:转速35~45r/min、温度36~38℃、溶氧值40%~60%、pH值7.0~7.2、通气量50~300mL/min。
在本发明中,病毒接种后,培养转速典型但非限制性的为35r/min、36r/min、37r/min、38r/min、39r/min、40r/min、41r/min、42r/min、43r/min、44r/min或45r/min;温度典型但非限制性的为36℃、36.3℃、36.5℃、36.8℃、37℃、37.3℃、37.5℃、37.8℃或38℃;溶氧值典型但非限制性的为43%、45%、48%、50%、53%、55%、58%或60%;pH值典型但非限制性的为7.0、7.05、7.1、7.15或7.2;通气量典型但非限制性的为50mL/min、80mL/min、100mL/min、130mL/min、150mL/min、180mL/min、200mL/min、230mL/min、250mL/min、280mL/min或300mL/min。
在本发明中,病毒接种后,通过选择合适的培养条件,促进病毒的感染和增殖,提高病毒的产量。
第二方面,在一些具体的实施方式中提供了一种山羊痘病毒在疫苗制备中的应用。
利用本发明山羊痘病毒的增殖方法增殖得到的病毒稳定,毒价高,能够应用于疫苗的制备。疫苗包括但不限于口服疫苗、注射疫苗或者本领域技术人员所熟知的其他病毒类疫苗。进一步地,本发明获得的山羊痘病毒可经口服途径进行免疫,有望在野生动物上进行推广免疫。
第三方面,在一些具体的实施方式中提供了一种山羊痘活疫苗的制备方法,包括以下步骤:
将应用山羊痘病毒的增殖方法增殖得到的山羊痘病毒加入病毒保护液,得到病毒液;
将病毒液与耐热冻干保护剂混合,制备得到山羊痘活疫苗;
其中,耐热冻干保护剂为水溶液,包含海藻糖20~50g/L、明胶5~20g/L、聚乙烯吡咯酮5~40g/L、组氨酸0.5~3g/L和维生素C1~4g/L。
在本发明中,向增殖得到的山羊痘病毒中加入病毒保护液得到病毒液,防止病毒的抗原活性改变,感染力降低,再向病毒液中加入耐热冻干保护剂,防止病毒在冻干过程中受到损伤,最后经过冷冻干燥制备得到山羊痘活疫苗。该方法工艺简单,成本低,提高了疫苗中病毒的含量,而且病毒经过提纯,配合耐热冻干保护剂,降低了病毒在冻干过程中的损伤,缓解了疫苗稳定性差,保存时间短的技术问题。
本发明的耐热冻干保护剂为水溶液,包含海藻糖、明胶、聚乙烯吡咯酮、组氨酸和维生素C。其中,海藻糖典型但非限制性的浓度为20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L或50g/L;明胶典型但非限制性的浓度为5g/L、8g/L、10g/L、13g/L、15g/L、18g/L或20g/L;聚乙烯吡咯酮典型但非限制性的浓度为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L或40g/L;组氨酸典型但非限制性的浓度为0.5g/L、0.8g/L、1g/L、1.3g/L、1.5g/L、1.8g/L、2g/L、2.3g/L、2.5g/L、2.8g/L或3g/L;维生素C典型但非限制性的浓度为1g/L、1.3g/L、1.5g/L、1.8g/L、2g/L、2.3g/L、2.5g/L、2.8g/L、3g/L、3.3g/L、3.5g/L、3.8g/L、4g/L。
在本发明中,通过对耐热冻干保护剂中包含的各组分浓度进一步的优化和调整,使得耐热冻干保护剂的性能更好,降低病毒在冻干过程中受到的损伤。
在一些优选的实施方式中,山羊痘病毒加入病毒保护液前还要经过纯化过滤步骤,纯化过滤步骤包括去除细胞碎片、培养基、细胞代谢产物和菌。
在本发明中,山羊痘病毒经过培养得到含有病毒的发酵液,发酵液成分复杂,包括培养基、细胞碎片、细胞代谢产物和病毒,为了得到单一的病毒,还需要对病毒进行纯化。纯化方法包括但不限于过滤、离心、吸附或本领域技术人员所熟知的其他纯化手段。经过纯化,得到了单一病毒。
在一些优选的实施方式中,病毒保护液为含0.5~1%BSA、1~3%蔗糖、1~2.5%芦荟多糖、0.01%硫柳汞和0.05%吐温-20的0.01mol/L的PBS溶液。
在本发明中,病毒保护液为含BSA、蔗糖、芦荟多糖、硫柳汞和吐温-20的PBS溶液,其中,BSA典型但非限制性的浓度为0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1%;蔗糖典型但非限制性的浓度为1%、1.3%、1.5%、1.8%、2%、2.3%、2.5%、2.8%或3%;芦荟多糖典型但非限制性的浓度为1%、1.3%、1.5%、1.8%、2%、2.3%或2.5%。
在本发明中,通过对病毒保护液中包含的各组分浓度进一步的优化和调整,使得病毒保护液的性能更好,能够防止病毒的抗原活性改变,感染力降低。
在一些优选的实施方式中,病毒液中,病毒与病毒保护液的体积比为1:45~55,典型但非限制性的病毒与病毒保护液的体积比为1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54或1:55,优选为1:50。
在本发明中,通过对病毒与病毒保护液的体积比进一步的优化和调整,使得病毒保护液充分发挥作用,防止病毒的抗原活性改变,感染力降低。
在一些优选的实施方式中,病毒液与耐热冻干保护剂混合的体积比为1:0.8~1.2,典型但非限制性的病毒液与耐热冻干保护剂混合的体积比为1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.0或1:1.2,优选为1:1。
在本发明中,通过对病毒液与耐热冻干保护剂混合的体积比进一步的优化和调整,使得耐热冻干保护剂充分发挥作用,降低病毒在冻干过程中受到的损伤。
第四方面,在一些具体的实施方式中提供了一种应用山羊痘活疫苗的制备方法制备得到的山羊痘活疫苗。
应用本发明的方法制备得到的山羊痘活疫苗,病毒含量高,成本低。
第五方面,在一些具体的实施方式中提供了一种山羊痘活疫苗在山羊痘防控中的应用。
本发明制备得到的山羊痘活疫苗安全有效,稳定性强,在2~8℃下能够保存36个月,能够用于山羊痘的防控。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
将生长良好、浓度为4.0×106个/mL的细胞系置于500mL摇瓶中,按0.02MOI剂量接种病毒,培养条件为:温度36~38℃、5%CO2、相对湿度60%、转速125rpm。取培养96小时的病毒为子代,按此方式传代驯化1次,在最后一次传代驯化时,分别在接毒后48、72、96、120小时取样,进行病毒含量检测。结果如表1所示。
实施例2
与实施例1的区别在于,传代驯化2代。
实施例3
与实施例1的区别在于,传代驯化3代。
实施例4
与实施例1的区别在于,传代驯化4代。
实施例5
与实施例1的区别在于,传代驯化5代。对得到的驯化病毒进行特异性检测,结果如图1-6所示。
实施例6
与实施例1的区别在于,传代驯化6代。
实施例7
将生长良好、浓度为1.0×106个/mL的细胞系置于500mL摇瓶中,按0.01MOI剂量接种驯化病毒,培养条件为:温度36~38℃、5%CO2、相对湿度60%、转速125rpm。分别在接毒后48、72、96、120小时取样,进行病毒含量检测。生物学重复3次,结果如表2所示。
实施例8
与实施例7的区别在于,细胞系浓度为2.0×106个/mL。
实施例9
与实施例7的区别在于,细胞系浓度为3.0×106个/mL。
实施例10
与实施例7的区别在于,细胞系浓度为4.0×106个/mL。
实施例11
将生长良好、浓度为2.0×106个/mL的细胞系置于500mL摇瓶中,按0.01MOI剂量接种驯化病毒,培养条件为:温度36~38℃、5%CO2、相对湿度60%、转速125rpm。培养96小时后,进行病毒含量检测,结果如表3所示。
实施例12
与实施例11的区别在于,接度剂量为0.02MOI。
实施例13
与实施例11的区别在于,接度剂量为0.03MOI。
实施例14
步骤1.将生长良好,浓度为1.0×106个/mL的细胞系接种至500mL摇瓶中悬浮培养72小时,培养参数为:温度37℃、5%CO2、相对湿度60%、转速125rpm;
步骤2.取摇瓶悬浮培养的细胞,以1.2×106个/mL的细胞浓度接种到5L反应袋中培养,培养体积为2.5L,培养参数为:转速40r/min、温度37℃、溶氧值50%、pH值7.1、通气量150mL/min;
步骤3.待细胞增殖密度达到8.0×106个/mL,将2.4L细胞移至50L反应袋中培养,培养体积为20L,培养参数为转速40r/min、温度37℃、溶氧值50%、pH值7.1、通气量150mL/min;
步骤4.待细胞增殖密度达到8.0×106个/mL,将反应袋中的细胞浓度调整至2.0×106个/mL,按0.01MOI接种剂量接毒,反应器培养参数不变。培养96小时后,进行病毒含量检测。以上操作生物学重复3次,结果如表4所示。
实施例15
与实施例14的区别在于,没有步骤3。
实施例16
将实施例14的病毒先用pall深层过滤器去除细胞碎片,再用中空纤维或膜包进行浓缩、换液,去除培养基及细胞代谢产物,将病毒置换至0.01M的PBS缓冲液中除菌过滤,以1:50比例加入特定的病毒保护液,置于-80℃长期保存或置于2~8℃保存。
将病毒液与耐热冻干保护剂(海藻糖30g/L、明胶12g/L、聚乙烯吡咯酮20g/L、组氨酸1.5g/L、维生素C 2.5g/L、剩余超纯水)以体积比1:1的比例均匀混合,以2mL/瓶无菌条件下封装于青瓶内,放置于冷冻干燥机内冻干,即可制得山羊痘悬浮毒耐热保护剂活疫苗。
取2~8℃条件下保存1、3、6、12、18、24、30、36、42个月的3批次疫苗取样进行病毒含量测定。结果如表5所示。
对比例1
一种商品化山羊痘活疫苗。
对比例2
与实施例16的区别在于,耐热冻干保护剂组成更换为:5%蔗糖、10%牛奶、剩余超纯水。
病毒的鉴定
1.特异性
将实施例5的病毒用无血清MEM细胞营养液稀释成200TCID50/0.1mL,与等量的抗山羊痘病毒特异性血清混合,置37℃作用1小时,将中和液接种已长成羊睾丸单层细胞的96孔细胞培养板10孔,0.1mL/孔;同时设立病毒对照和健康细胞对照各10孔,病毒对照组10孔,健康细胞对照组接种无血清MEM营养液0.1mL,接种后观察4~6日观察细胞病变。结果如图1-3所示,中和试验组未出现细胞病变,病毒对照组全部出现以细胞圆缩为特征的细胞病变,细胞对照组正常无细胞病变出现。
2.免疫荧光检测
将实施例5的病毒用无血清MEM细胞营养液稀释成200TCID50/0.1mL,与等量的抗山羊痘病毒特异性血清混合,置37℃作用1小时,将中和液接种已长成山羊睾丸单层细胞的96孔细胞培养板10孔,0.1mL/孔;同时设立病毒对照和健康细胞对照各10孔,病毒对照组10孔,健康细胞对照组接种无血清MEM营养液0.1mL。将96孔细胞培养板置36~38℃二氧化碳培养箱中培养5日。PBST清洗3次。用80%预冷丙酮固定10分钟后,PBST清洗3次。加抗山羊痘病毒特异性血清(1:100),37℃下孵育1小时,PBST清洗3次。加抗山羊的FITC二抗(1:200),37℃下孵育1小时,PBST清洗3次。最后每孔加入50μL PBST。用倒置荧光显微镜观察,结果如图4-6所示,病毒与阳性血清发生特异性抗原抗体反应,加入荧光二抗后,视野下出现明显的特异性荧光,空白对照孔无荧光。
3.最小发痘量
用无血清MEM将实施例5的病毒作10倍系列稀释,取10-3、10-4、10-53个滴度,每个滴度于胸腹部皮内接种1~4岁健康易感山羊3只(山羊痘病毒中和抗体<1:4),每只2颗,每颗0.5mL(也可在每只羊体上同时注射10-3、10-4、10-5 3个滴度,每个滴度2颗,每颗0.5mL),连续观察15日。试验结果显示,10-4或10-5稀释度均有1只羊发痘,但其痘未出现紫红色、严重水肿、化脓、结痂等反应。
4.安全性
将实施例5的病毒用无血清MEM细胞营养液稀释成每0.5mL含2个使用剂量,胸腹部皮内注射1~4岁健康易感山羊3只,每只2颗,每颗0.5mL,观察15日,有2只羊发痘,但其痘未出现紫红色、严重水肿、化脓、结痂等反应。
5.纯净
按现行《中国兽药典》(三部)附录进行了检验,无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。
疫苗安全性试验
选取15只山羊痘病毒抗体阴性羊作为供试动物。用生理盐水将山羊痘悬浮毒耐热保护剂活疫苗和上市的商品化疫苗分别稀释成每0.5mL含2个使用剂量,胸腹部皮内各注射5只试验羊,每只2颗,每颗0.5mL;5只不做处理作为对照组,连续观察15日,观察注射部位痘肿反应和颜色、精神、食欲、全身反应等。结果表明,两个免疫组均有不少于2只羊出现直径为0.5~4cm微红色或无色痘肿反应,持续4日以上,逐渐消褪,间有轻度体温反应,但精神、食欲正常,即山羊痘悬浮毒耐热保护剂活疫苗安全性与商品化疫苗一致。
疫苗有效性试验
1.本动物检验
选取15只山羊痘病毒抗体阴性羊作为供试动物。用生理盐水将实施例16的山羊痘悬浮毒耐热保护剂活疫苗和上市的商品化疫苗分别稀释100倍后,胸腹部皮内分别注射山羊各5只,每只2颗,每颗0.5mL;5只不做处理作为对照组,连续观察15日,观察注射部位痘肿反应和颜色、精神、食欲、全身反应等。试验结果表明,在接种后5~7日,两个免疫组均有3只山羊出现直径为0.5~3cm微红色或无色痘肿反应,且持续4日以上后逐渐消褪。精神食欲正常。
2.病毒含量测定
将实施例16的山羊痘活疫苗用细胞培养液作10倍系列稀释(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5),每个稀释度分别接种于96孔细胞培养板,每个稀释倍数接种8个孔,100μL/孔。将羊睾丸细胞密度调整为约5×105个/mL,分别加入100μL细胞悬液到各病毒稀释孔中,同时设正常细胞对照。将96孔细胞培养板置36~38℃恒温培养箱中培养5日。观察细胞病变,用Reed-Muench法计算病毒半数组织细胞感染量(TCID50)。商品化山羊痘活疫苗和山羊痘悬浮毒活疫苗病毒含量分别是103.6TCID50/头份、104.0TCID50/头份,均不低于103.5TCID50/头份。
口服疫苗的应用
将全悬浮细胞生产的山羊痘病毒用脂质体包载(总脂质与病毒质量浓度比为1:1),病毒与保护剂以体积比1:1的比例均匀混合,以2mL/瓶无菌条件下封装于青瓶内,放置于低温冷冻干燥机内冻干,即可制得山羊痘悬浮毒口服活疫苗。选取10只山羊痘病毒抗体阴性羊作为供试动物。1mL/只口服,与5只对照羊同条件饲养28日后,采血,测定病毒中和抗体效价;5只免疫山羊至少有4只血清中和抗体效价不低于1:32。5只对照山羊血清中和抗体效价均不高于1:4。
实施例结果
表1实施例1-6不同取样时间病毒含量(单位:TCID50/mL)
从表1可以看出,取样时间相同时,山羊痘病毒含量随着传代驯化次数的增加逐渐增加,至第5代达到最大值,5代后趋于稳定。因此,本发明选择将病毒传代驯化4~5代,此时病毒对宿主的适应性最好,培养得到的病毒含量最高。
对于实施例5,接种病毒后,病毒含量随培养时间的增加呈现升高后降低的趋势,于96小时达到最大值,因此选取培养96小时后收获病毒。
表2实施例7-10不同取样时间病毒含量(单位:TCID50/mL)
从表2可以看出,病毒接种时宿主细胞的浓度会影响培养后病毒的含量,宿主细胞浓度过低会导致接种病毒的增殖量降低,浓度过高,会影响宿主对营养物质的摄入,同样会降低病毒的增殖量。在本发明中,选择细胞浓度为2.0×106~4.0×106个/mL接种病毒,得到的病毒量高。
表3实施例11-13不同取样时间病毒含量(单位:TCID50/mL)
实施例 |
实施例11 |
实施例12 |
实施例13 |
病毒含量 |
10<sup>6.1</sup> |
10<sup>6.7</sup> |
10<sup>6.6</sup> |
病毒的接种剂量会影响培养得到的病毒含量。从表3中可以看出,随着病毒接种剂量从0.005MOI增加至0.02MOI,培养得到的病毒含量从106.1升高至106.7,后趋于不变。在本发明中,选择病毒接种剂量为0.005~0.02MOI。
表4实施例14、15病毒含量(单位:TCID50/mL)
本发明提供了一种病毒扩大培养工艺,从表4可以看出,5L反应器扩大培养与50L反应器扩大培养得到的病毒含量均在107.2TCID50/mL以上,且显著高于摇瓶繁殖病毒的病毒含量,说明本发明的反应器工艺可以进行病毒的放大生产。
表5实施例16的3批次疫苗和对比例1-2不同储存时间病毒含量(单位:TCID50/mL)
从表5可以看出,本发明得到的山羊痘活疫苗稳定性好,在2~8℃下能够保存36个月,相较于市售商品化疫苗或者采用商品化山羊痘活疫苗冻干保护剂制备得到的疫苗效果更好。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。