CN102284061A

CN102284061A - 一种耐热型家畜用疫苗的制备方法

Info

Publication number: CN102284061A
Application number: CN 201010202115
Authority: CN
Inventors: 赖�志; 高俊锋; 龚建培
Original assignee: Biotechnology Co Ltd Shanghai Chuanghong
Current assignee: Biotechnology Co Ltd Shanghai Chuanghong
Priority date: 2010-06-17
Filing date: 2010-06-17
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2030-06-17
Also published as: CN102284061B

Abstract

本发明涉及一种耐热型家畜用疫苗的制备方法，该方法先配制好伪狂犬活疫苗或PRRS活移苗耐热保护剂，然后将伪狂犬活疫苗耐热保护剂或PRRS活移苗耐热保护剂)与伪狂犬病毒培养液或PRRS病毒培养液混合，将得到的混合溶液装入冻干机中，再经冻干操作得到耐热型家畜用疫苗。与现有技术相比，本发明采用的原料成本较低，操作简单，可以大规模生产，制备得到的耐热伪狂犬活疫苗或PRRS活移苗可在2～8℃条件下保存24个月，疫苗效价均保持在每头份≥10^6.0TCID₅₀。

Description

一种耐热型家畜用疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及一种疫苗的制备方法，尤其是涉及一种耐热型家畜用疫苗的制备方法。

背景技术

伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)是一种a-疱疹病毒，可引起多种家畜和野生动物的伪狂犬病。除猪以外的其它动物表现为致死性感染，猪是PRV的天然宿主和贮存宿主，呈流行性感染。成年猪常常表现为隐性感染和呼吸道症状，母猪流产、产死胎和木乃伊胎，公猪表现为睾丸炎。仔猪表现出发热、昏迷和神经症状，死亡率很高。因此，伪狂犬病是养猪业的一种重要繁殖障碍性传染病。

PRRS可引起猪群多系统病症，繁殖母猪感染可导致流产、早产、死胎、木乃伊胎等严重的繁殖障碍，死胎率可达20％～60％；初生及断乳前仔猪呼吸困难及高死亡率(可高达80％)；仔猪发生呼吸系统疾病，并易继发细菌或病毒感染如猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流感病毒(CPN)、猪圆环病毒2型(PCV 2)、猪呼吸道冠状病毒、胸膜肺炎放线杆菌(APP)、猪链球菌(SS)、多发性巴氏杆菌((PM)、副猪嗜血杆菌(HP＞等，死亡率增加，生长缓慢；育肥猪感染多数发病较为温和，但可造成饲料报酬降低，生产性能下降；公猪感染可造成精液品质下降；猪只一旦感染PRRSV，常可导致长期的病毒血症/持续感染而不断向外排毒，引起本病在猪群中反复爆发而难以根除。目前PRRS已遍及全球主要养猪国家与地区，给养猪业带来惨重的经济损失。PRRS目前已成为危害养猪业最严重的猪传染病之一。OIE及我国已将该病列为B类/乙类/二类传染病”(List B disease)。

目前，弱毒活疫苗是预防畜禽传染病的主要疫苗之一，在我国动物用疫苗中，活疫苗占相当大的比例。国内疫苗企业常用的保护剂主要是蔗糖、牛奶、明胶等，组方简单，保护性能差。如果在2℃～8℃条件下，保存期只有3～6个月，多需要在-15℃以下保存。而国内传统的动物用疫苗保护剂的研制相对滞后，使疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制，加上基层防疫部门缺乏必要的冷冻和冷藏设施，容易因免疫失败而造成疫病流行。所以，耐热保护剂的研究非常急需，发达国家在二十世纪八十年代就已开始进行耐热保护剂的研究，目前已经基本采用耐热冻干保护剂生产冻干疫苗，但由于保护剂的研究和应用属于专利资料，处于保密状况中。

当前，进入中国市场的伪狂犬疫苗均是采用耐热保护剂冷冻的而成，存放温度在2～8℃，存放时间甚至长达30个月，很好的保证了疫苗的使用效果。而我国的伪狂犬活疫苗存放温度仍然是-15℃，进口疫苗对国产疫苗造成了巨大的市场冲击，影响国内生物制品企业的发展。技术的落后也限制了国产疫苗海外市场的拓展，因此，耐热型疫苗的研发势在必行。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种操作简单，可以在2～8℃条件下保存，疫苗效价较好的耐热型家畜用疫苗的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种耐热型家畜用疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)按照以下组分及含量(wt％)准备耐热保护剂原料：

明胶 1～3，

蔗糖 6～8，

牛血清白蛋白 1～3，

胰蛋白胨 2～3，

EDTA 1～3，

谷氨酸单钠 1～3，

磷酸氢二钾 1～2，

磷酸二氢钾 0.5～0.6，

双蒸水余量；

(2)将明胶、蔗糖、EDTA、胰蛋白胨按比例溶于双蒸水中，控制温度为108～121℃，灭菌15～30min，得到耐热组份；

(3)将牛血清白蛋白、谷氨酸单钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾按比例溶于剩余的双蒸水中，经0.22μm的滤膜除菌得到不耐热组份，然后将不耐热组份与耐热组份混合，得到疫苗耐热保护剂；

(4)将上述步骤得到的伪狂犬活疫苗耐热保护剂与伪狂犬病毒培养液或猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒培养液按重量比为1∶(1～1.2)混合，将得到的混合溶液装入冻干机中，在2～3h内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持5～6h，开始抽真空至10^-4Pa，然后控制升温，在14～16h内升至-20℃，再以2～5℃/h的升温速度将温度升至20℃，控温保持5～6h将其取出，即得到耐热型家畜用疫苗。

所述步骤(1)中磷酸二氢钾的含量优选0.52wt％。

所述步骤(2)中的伪狂犬病毒培养液按常规方法获得。

所述步骤(3)中的PRRS病毒培养液按常规方法获得。

与现有技术相比，本发明采用的原料成本较低，操作简单，可以大规模生产，制备得到的耐热伪狂犬活疫苗或耐热PRRS活移苗可在2～8℃条件下保存24个月，疫苗效价均保持在每头份≥10^6.0TCID₅₀。

附图说明

图1为实施例2中的冻干曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

耐热型伪狂犬病毒活疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)冻干保护剂的配方及配制方法

耐热成份：明胶1wt％、蔗糖8wt％、EDTA 1wt％，然后用双蒸水定溶到合适的刻度。121℃高压灭菌30min，不耐热成份：谷氨酸单钠1wt％、磷酸氢二钾2wt％、磷酸二氢钾0.52wt％，牛血清白蛋白1wt％、胰蛋白胨2wt％用双蒸水定溶到合适的刻度，用0.22μm的滤膜除菌，然后将耐热组分及不耐热组分按1∶1混合，得到疫苗耐热保护剂；

(2)伪狂犬病毒培养液的获取

a、Vero细胞的复苏、培养：从液氮中取出冻存的Vero细胞2～3个安瓶，在37℃水浴中迅速解冻。将每个安瓶用1000r/min离心5～10min，弃去上清液，用2～3mL含有100IU/mL青霉素、80μg/mL链霉素、6％犊牛血清和0.5％水解乳蛋白的DMEM重新悬浮细胞，然后吸入装有10mL培养液的培养瓶中摇匀，置37℃、5％CO2的培养箱中静止培养，48～72h后待其形成良好单层细胞后，弃生长液，用PBS反复洗涤3次后，加入细胞消化液，待细胞消化好后，倾去细胞消化液，并用吸管吸取生长液轻轻吹打细胞，使细胞充分散成单个细胞，分装至96孔细胞培养板后置37℃恒温培养，逐日观察细胞形态，选择生长良好的细胞备用；

b、病毒的增殖：当细胞铺满单层时，将PRV接种到细胞单层上，37℃感作40min或1h，每20min摇匀1次，使病毒充分接触细胞，加适量维持液，置37℃、5％CO₂培养箱培养。每天在显微镜下观察CPE。细胞出现70％～80％CPE时，收取伪狂犬病毒培养液，-20℃冰箱保存备用；

(3)伪狂犬病毒经过培养后，进行无菌检验和病毒含量的测定，将合格的伪狂犬病毒培养液和配制好的冻干保护剂1∶1混合后，充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥；

(4)将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，在3h内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持6h后，开始抽真空至10^-4Pa后，再开始升温，14h内升至-20℃，之后以2℃/h的速度升温至20℃，维持6h加塞出箱，冻干全程为42h，得到耐热型伪狂犬活疫苗。

实施例2

(1)冻干保护剂的配方及配制方法

耐热成份：明胶3wt％、蔗糖6wt％、EDTA 1wt％，然后用双蒸水定溶到合适的刻度，121℃高压灭菌30min，不耐热成份：谷氨酸单钠3wt％、磷酸氢二钾1wt％、磷酸二氢钾0.52wt％，牛血清白蛋白3wt％、胰蛋白胨2wt％用双蒸水定溶到合适的刻度，用0.22μm的滤膜除菌，然后将耐热组分及不耐热组分按1∶1混合，得到疫苗耐热保护剂；

(2)伪狂犬病毒经过培养后，进行无菌检验和病毒含量的测定，将合格的病毒液和配制好的冻干保护剂1∶1混合后，充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥；

(3)将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，冻干曲线如图1所示，在2h内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持5h后，抽真空至10^-4Pa，开始升温，16h内升至-20℃，之后以2℃/h的速度升温至20℃，维持5h加塞出箱，冻干全程为46h，得到耐热型伪狂犬活疫苗。

冻干产品的测试

将不同实施案例冻干的产品，置于100℃、37℃、2～8℃条件下保存，不同时间取样，测定病毒含量及其物理性状。

表1冻干制品置于100℃间接煮沸10分钟后的物理性状和TCID50的测定结果

组别	干后	物理性状	100℃10分钟	TCID₅₀
					实施例1	10^-7.25	疏松海绵状	未收缩	10^-5.20
实施例2	10^-7.20	疏松海绵状	未收缩	10^-5.20
					普通冻干	10^-7.10	疏松海绵状	收缩成胶状	0

表2冻干前后疫苗于37℃保存不同时间的TCID50

表3冻干前后疫苗于2～8℃保存不同时间TCID50

实施例3

耐热型PRRS活疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)冻干保护剂的配方及配制方法

(2)PRRS病毒培养液的获取

a、Marc145细胞的培养：DMEM(高糖型，含4500mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠)+5％～10％新生牛血清+1％双抗(青霉素和链霉素)的培养液。按1∶3传代，细胞接种密度为1～1.5×10⁵cells/ml，48hr后长成单层。细胞传代时消化液用0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA，消化过程应尽量缩短在1～2分钟内完成；

b、病毒感染、维持和收获：转瓶中细胞长成单层后，弃瓶内细胞生长液，接种PRRS病毒。37℃吸附1hr，加入维持液，置37℃恒温室转瓶机上旋转培养3～5天。维持液：DMEM+4～5％新生牛血清，细胞病变时间出现在接毒后48小时，72～96小时细胞病变达80％左右，当细胞出现80％以上病变(CPE)时，即可开始收毒，获得PRRS病毒培养液；

(3)PRRS病毒经过培养后，进行无菌检验和病毒含量的测定，将合格的病毒液和配制好的冻干保护剂1∶1混合后，充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥；

(4)将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，在3h内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持6h后，开始抽真空至10^-4Pa后，再开始升温，14h内升至-20℃，之后以2℃/h的速度升温至20℃，维持6h加塞出箱，冻干全程为42h，得到耐热型PRRS活疫苗。

实施例4

耐热型PRRS活疫苗制备工艺

(1)冻干保护剂的配方及配制方法

(2)PRRS病毒经过培养后，进行无菌检验和病毒含量的测定，将合格的病毒液和配制好的冻干保护剂1∶1混合后，充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥；

(3)将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，在2h内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持5h后，抽真空至10^-4Pa，开始升温，16h内升至-20℃，之后以2℃/h的速度升温至20℃，维持6h加塞出箱，冻干全程为46h，得到耐热型PRRS活疫苗。

冻干产品的测试

表4冻干制品置于100℃间接煮沸10分钟后的物理性状和TCID50的测定结果

组别	干后	物理性状	100℃10分钟	TCID₅₀
					实施例1	10^-6.80	疏松海绵状	未收缩	10^-4.90
实施例2	10^-6.85	疏松海绵状	未收缩	10^-5.00
					普通冻干	10^-6.85	疏松海绵状	收缩成胶状	0

表5冻干前后PRRS疫苗于37℃保存不同时间TCID50

表6冻干前后PRRS疫苗于2～8℃保存不同时间TCID50

实施例5

一种耐热型家畜用疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)冻干保护剂的配方及配制方法

耐热成份：明胶3wt％、蔗糖6wt％、EDTA 1wt％，然后用50wt％的双蒸水定溶，108℃高压灭菌15min，不耐热成份：谷氨酸单钠3wt％、磷酸氢二钾1wt％、磷酸二氢钾0.5wt％，牛血清白蛋白3wt％、胰蛋白胨2wt％用剩余的50wt％双蒸水定溶，用0.22μm的滤膜除菌，然后将耐热组分及不耐热组分混合，得到疫苗耐热保护剂；

(2)伪狂犬病毒经过培养后，进行无菌检验和病毒含量的测定，将合格的病毒液和配制好的冻干保护剂1∶1.2混合后，充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥；

(3)将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，在3h内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持5h后，抽真空至10^-4Pa，开始升温，14h内升至-20℃，之后以2℃/h的速度升温至20℃，维持5h加塞出箱，冻干全程为46h，得到耐热型伪狂犬活疫苗。

实施例6

(1)冻干保护剂的配方及配制方法

耐热成份：明胶3wt％、蔗糖6wt％、EDTA 1wt％，然后用双蒸水定溶，121℃高压灭菌30min，不耐热成份：谷氨酸单钠3wt％、磷酸氢二钾1wt％、磷酸二氢钾0.6wt％，牛血清白蛋白3wt％、胰蛋白胨2wt％用双蒸水定溶，用0.22μm的滤膜除菌，然后将耐热组分及不耐热组分按1∶1混合，得到疫苗耐热保护剂；

(2)PRRS病毒经过培养后，进行无菌检验和病毒含量的测定，将合格的病毒液和配制好的冻干保护剂1∶1.2混合后，充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥；

(3)将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，在3h内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持6h后，抽真空至10^-4Pa，开始升温，16h内升至-20℃，之后以5℃/h的速度升温至20℃，维持6h加塞出箱，冻干全程为46h，得到耐热型PRRS活疫苗。

Claims

1.一种耐热型家畜用疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)按照以下组分及含量(wt％)准备耐热保护剂原料：

明胶 1～3，

蔗糖 6～8，

牛血清白蛋白 1～3，

胰蛋白胨 2～3，

EDTA 1～3，

谷氨酸单钠 1～3，

磷酸氢二钾 1～2，

磷酸二氢钾 0.5～0.6，

双蒸水余量；

(4)将上述步骤得到的伪狂犬活疫苗耐热保护剂与伪狂犬病毒的培养液或猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒的培养液按重量比为1∶(1～1.2)混合，将得到的混合溶液装入冻干机中，在2～3h内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持5～6h，开始抽真空至10^-4Pa，然后控制升温，在14～16h内升至-20℃，再以2～5℃/h的升温速度将温度升至20℃，控温保持5～6h将其取出，即得到耐热型家畜用疫苗。

2.根据权利要求1所述的一种耐热型家畜用疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中磷酸二氢钾的含量优选0.52wt％。

3.根据权利要求1所述的一种耐热型家畜用疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的伪狂犬病毒培养液按常规方法获得。

4.根据权利要求1所述的一种耐热型家畜用疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的PRRS病毒培养液按常规方法获得。