CN106729731A - 一种疫苗耐热保护剂、疫苗以及疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种疫苗耐热保护剂，包括明胶6%~12%；海藻糖1%~8%；蔗糖20%~30%；胰蛋白胨6%~15%；水解乳蛋白1%~8%；酶解酪蛋白5%~20%；硫脲1%~5%；甘氨酸0.1%~3%；右旋糖酐0.1%~2%；甘露醇0.1%~2%。此外，本发明还公开了疫苗以及疫苗的制备方法。本发明通过优化疫苗耐热保护剂的组分，能够提高疫苗在冻干时对温度的耐受性，减少疫苗效力在冻干过程中的损失。同时本发明的耐热保护剂，配套本发明公开的冻干方法，可以有效降低病毒冻干损失，可以提高病毒对温度的耐受能力，产品在长时间保存后依然能维持良好的物理性状不萎缩。

Description

一种疫苗耐热保护剂、疫苗以及疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及细胞免疫生物制品技术领域，具体涉及到一种疫苗耐热保护剂，以及利用这种疫苗耐热保护剂制备的疫苗疫苗的制备方法。
背景技术
病毒等生物活性物质及其相关制品的热敏感性一直是活疫苗长期保存的瓶颈。我国幅员辽阔，经济水平差异较大，运输、使用过程中疫苗短期暴露高温环境(甚至45℃以上)的现象依然存在，所以对活疫苗的耐热性能提出了更高的要求。
耐热冻干保护剂考虑了活疫苗在较高温度和较长保存时间的情况下，冻干物质可能产生的物理和化学变化对活疫苗存活的影响。但是，现有耐热冻干保护剂仅能使活疫苗在2～8℃条件下保存24个月，37℃条件下保存30天。
活疫苗的冷冻干燥工艺对其保存期也有很大的影响。常规冷冻干燥工艺中，活疫苗首先被超低温冻结(-40℃以下)，形成的冰结晶对病毒的囊膜或者细胞壁造成不同程度的伤害，进而影响干燥产品水合后的活性。因此，常规冷冻干燥工艺中，制品的耐热性能还是有限的，室温甚至更高温度的稳定性是不高的。
猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒引起的一种急性胃肠道传染病，临床上以发热、呕吐、严重腹泻、脱水和两周龄以下子猪高死亡率为特征。猪流行性腹泻是猪流行性腹泻病毒引起的一种高度接触性肠道传染疾病，临床上以呕吐、腹泻、食欲下降为主要特征。这两种病毒是引起仔猪腹泻和死亡的主要病因之一，在猪场流行十分普遍，常呈混合感染，给养猪业造成重大经济损失。
在食品、药品以及生物体的冷冻干燥和贮藏过程中，很多因素，例如化学成分、冻结速率、冻结和脱水应力、玻璃化转变温度、干燥固体中剩余水分、贮藏环境的温度和湿度等都会影响其中活性组分的稳定性甚至会导致失活。为了防止生物制品活性组分的变性，需要添加合适冷冻干燥保护剂和添加剂，配制成混合液后，才能进行有效的冷冻干燥和贮藏。
另外，近年来随着我国畜牧业的飞速发展，养殖密度加大，疫病种类增多且暴发频繁，与之相适应的动物防疫模式也发生了根本性的变化。防疫质量成为制约这一变化的瓶颈之一，疫苗质量更是其中的关键问题。众所周知，疫苗特别是活疫苗对于冷链运输以及储存温度要求非常高，而这一环节控制不好将直接影响疫苗质量，因此，对于耐热保护剂的开发显得尤为重要。
TGEV猪传染性胃肠炎疫苗和PEDV流行性腹泻病毒不耐热，60℃30分钟可使病毒丧失感染力，因此在开发一种适宜TGEV和PEDV的耐热保护剂非常重要。而实际生产中，耐热保护剂的开发难度很大，而且保护效果不明显。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种疫苗耐热保护剂。
为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种疫苗耐热保护剂，包括以下按重量配比的组分：
明胶6％～12％；海藻糖1％～8％；
蔗糖20％～30％；胰蛋白胨6％～15％；
水解乳蛋白1％～8％；酶解酪蛋白5％～20％；
硫脲1％～5％；甘氨酸0.1％～3％；
右旋糖酐0.1％～2％；甘露醇0.1％～2％。
本发明的优选方案之一，疫苗耐热保护剂包括以下按重量配比的组分：
明胶10％；海藻糖5％；
蔗糖20％；胰蛋白胨8％；
水解乳蛋白3％；酶解酪蛋白15％；
硫脲2％；甘氨酸1％；
右旋糖酐0.5％；甘露醇0.5％。
本发明的优选方案之一，疫苗耐热保护剂的溶剂为注射用水。
本发明的优选方案之一，疫苗耐热保护剂包括保护剂A液和保护剂B液；保护剂A液包括海藻糖、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐和甘露醇；保护剂B液包括明胶、蔗糖和胰蛋白胨。
本发明的一个具体方案中还公开了一种用于猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗的疫苗耐热保护剂，包括以下按重量配比的组分：
明胶6％～12％；海藻糖1％～8％；
蔗糖20％～30％；胰蛋白胨6％～15％；
水解乳蛋白1％～8％；酶解酪蛋白5％～20％；
硫脲1％～5％；甘氨酸0.1％～3％；
右旋糖酐0.1％～2％；甘露醇0.1％～2％。
基于本发明的疫苗耐热保护剂，本发明的另一个目的是公开并要求保护利用该疫苗耐热保护剂的疫苗。本发明要求保护的疫苗可以是疫苗制品，也可以是准备进行冻干的疫苗原液，即包括抗原和疫苗耐热保护剂的试剂。
本发明的一种疫苗，在疫苗配制过程中加入了疫苗耐热保护剂，疫苗耐热保护剂包括以下按重量配比的组分：
明胶6％～12％；海藻糖1％～8％；
蔗糖20％～30％；胰蛋白胨6％～15％；
水解乳蛋白1％～8％；酶解酪蛋白5％～20％；
硫脲1％～5％；甘氨酸0.1％～3％；
右旋糖酐0.1％～2％；甘露醇0.1％～2％。
本发明的一个具体方案中公开了一种用于猪传染性胃肠炎、流行性腹泻的二联疫苗，在疫苗配制过程中加入了疫苗耐热保护剂，疫苗耐热保护剂包括以下按重量配比的组分：
明胶6％～12％；海藻糖1％～8％；
蔗糖20％～30％；胰蛋白胨6％～15％；
水解乳蛋白1％～8％；酶解酪蛋白5％～20％；
硫脲1％～5％；甘氨酸0.1％～3％；
右旋糖酐0.1％～2％；甘露醇0.1％～2％。
为了实施上述发明内容，本发明公开了一种疫苗耐热保护剂的制备方法，包括以下步骤：
1)配料：称取配方量的明胶、海藻糖、蔗糖、胰蛋白胨、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐和甘露醇；
2)制备保护剂A液：将海藻糖、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐和甘露醇加入适量注射用水中，过滤除菌备用；
3)制备保护剂B液：将明胶、蔗糖和胰蛋白胨溶解于注射用水中经高温高压灭菌处理后备用；
4)将保护剂A液和保护剂B液按照1:1比例配置成混合液，该混合液即为疫苗耐热保护剂。
为了进一步实施上述发明的内容，使用本发明的疫苗耐热保护剂制备生产出疫苗，本发明的一个方案中公开了一种疫苗的冻干制备方法，包括以下步骤：
1)将疫苗耐热保护剂与抗原混合培苗，得到冻干液；
2)将冻干液使用冷冻干燥机冻干；
疫苗耐热保护剂包括以下按重量配比的组分：
明胶6％～12％；海藻糖1％～8％；
蔗糖20％～30％；胰蛋白胨6％～15％；
水解乳蛋白1％～8％；酶解酪蛋白5％～20％；
硫脲1％～5％；甘氨酸0.1％～3％；
右旋糖酐0.1％～2％；甘露醇0.1％～2％。
本发明的一个优化方案中，冻干制备方法的步骤1)中疫苗耐热保护剂与抗原的混合比例为1:4；
冻干工艺包括：
冻干液在7小时内缓慢降到-48℃下保持3～5小时；逐渐升温至-25℃后保持30～40小时；升温至-20℃保持1～3小时，升温至-15℃保持1～3小时，升温至-10℃保持1～3小时，升温至0℃保持1～3小时；升温至5℃保持1～3小时；升温至26℃保持7～11小时。
综上所述，本发明具有以下优点：
本发明通过优化疫苗耐热保护剂的组分，能够提高疫苗在冻干时对温度的耐受性，减少疫苗效力在冻干过程中的损失。同时本发明的耐热保护剂，配套本发明公开的冻干方法，可以有效降低病毒冻干损失，可以提高病毒对温度的耐受能力，产品在长时间保存后依然能维持良好的物理性状和毒价。
具体实施方式
1、疫苗耐热保护剂的制备
保护剂a的组成：
明胶10％；海藻糖3％；
蔗糖20％；胰蛋白胨8％；
水解乳蛋白2％；酶解酪蛋白12％；
硫脲2％；甘氨酸0.3％；
右旋糖酐0.5％；甘露醇1％；余量为注射用水。
保护剂b的组成：
明胶10％；海藻糖5％；
蔗糖20％；胰蛋白胨8％；
水解乳蛋白3％；酶解酪蛋白15％；
硫脲2％；甘氨酸1％；
右旋糖酐0.5％；甘露醇0.5％；余量为注射用水。
保护剂c的组成：
明胶10％；海藻糖3％；
蔗糖20％；胰蛋白胨8％；
水解乳蛋白2％；酶解酪蛋白12％；
硫脲2％；甘氨酸0.3％；
右旋糖酐0.5％；甘露醇1％；
叶酸0.5％；乙基香兰素0.1％；
丹参酚酸B0.2％；余量为注射用水。
保护剂d的组成：
明胶10％；海藻糖3％；
蔗糖20％；胰蛋白胨8％；
水解乳蛋白2％；酶解酪蛋白12％；
硫脲2％；甘氨酸0.3％；
右旋糖酐0.5％；甘露醇1％；
丹参酚酸B0.2％；余量为注射用水。
2、疫苗耐热保护剂制备方法
本发明的疫苗耐热保护剂可以采用现有的方法来制备，也可以使用本发明中公开的方法制备。本发明的制备方法为：
1)配料：称取配方量的明胶、海藻糖、蔗糖、胰蛋白胨、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐和甘露醇；
2)制备保护剂A液：将海藻糖、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐和甘露醇加入适量注射用水中，过滤除菌备用；
3)制备保护剂B液：将明胶、蔗糖和胰蛋白胨溶解于注射用水中经高温高压灭菌处理后备用；
4)将保护剂A液和保护剂B液按照1:1比例配置成混合液，该混合液即为疫苗耐热保护剂。
本发明的制备方法还可以为：
1)配料：称取配方量的明胶、海藻糖、蔗糖、胰蛋白胨、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐、甘露醇、叶酸、丹参酚酸B和乙基香兰素；
2)制备保护剂A液：将海藻糖、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐和甘露醇加入适量注射用水中，使用0.22μm膜过滤除菌备用；
3)制备保护剂B液：将明胶、蔗糖、胰蛋白胨、叶酸、乙基香兰素和/或丹参酚酸B溶解于注射用水中经116℃高温高压灭菌处理20分钟后备用；
4)将保护剂A液和保护剂B液按照1:1比例配置成混合液，该混合液即为疫苗耐热保护剂。
3、疫苗制备方法
在配置完成疫苗耐热保护剂后，需要将其与疫苗原液进行混合，经过无菌处理后冻干制备成冻干疫苗。本发明中疫苗的冻干制备方法，包括以下步骤：
1)将疫苗耐热保护剂与抗原按照1:4的体积比混合培苗，得到冻干液；每瓶中含有溶液2.6ml；
2)将冻干液进行冻干，所述冻干工艺包括：
冻干液在7小时内缓慢降到-48℃下保持4小时；逐渐升温至-25℃后保持30小时；升温至-20℃保持2小时，升温至-15℃保持2小时，升温至-10℃保持2小时，升温至0℃保持2小时；升温至5℃保持2小时；升温至26℃保持9小时。
4、冻干疫苗的检验
使用本发明或者与其相适应冻干工艺均可以将本发明的疫苗耐热保护剂与疫苗进行冻干处理成冻干粉剂。将本发明4组的疫苗保护剂与猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗混合后制备得到的疫苗冻干粉进行成品检测，检测结果如下：
4.1性状：海绵疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
4.2无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
4.3支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无支原体生长。
4.4外源病毒检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无外源病毒污染。
4.5安全检验用1～3日龄仔猪5头，各经颈部肌肉接种疫苗10头份，连续观察14日。试验猪均无不良反应。
4.6鉴别检验用MEM营养液将1头份疫苗(1.0ml)作1000倍稀释，与等量的两种特异性血清混合液(1:1)混合，置37℃中和1小时后，分别接种生长良好的ST和Vero细胞单层，同时设病毒和正常细胞对照，观察120小时。疫苗中和组、正常细胞组均不产生CPE，病毒对照组产生CPE。
4.7效力检验
4.71猪传染性胃肠炎病毒含量测定
用MEM营养液将疫苗稀释至1头份/ml，并用MEM营养液作1000倍稀释。取稀释后的疫苗液加入等量PEDV的特异性血清，置37℃水浴中和1小时后。用MEM营养液将中和后疫苗液作10倍系列稀释，取最终稀释度为10-3、10-4、10-5、10-6的中和后疫苗液，接种于已生长良好的ST细胞单层的96孔培养板，每个滴度接种8孔，37℃、5％CO2培养120小时，观察CPE，按Reed-Muench法计算TCID50。每头份疫苗中猪传染性胃肠炎病毒的含量≥105.5TCID50。
4.7.2猪流行性腹泻病毒含量测定
用MEM营养液将疫苗稀释至1头份/ml，并用MEM营养液作1000倍稀释。取稀释后的疫苗液加入等量TGEV的特异性血清，置37℃水浴中和1小时后。用MEM营养液将中和后疫苗液作10倍系列稀释，取最终稀释度为成10-3、10-4、10-5、10-6的中和后疫苗液，接种于已生长良好的Vero细胞单层的96孔培养板，每个滴度接种8孔，37℃、5％CO2培养120小时，观察CPE，按Reed-Muench法计算TCID50。每头份疫苗中猪流行性腹泻病毒的含量≥105.3TCID50。
4.8剩余水分测定按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合规定。
4.9真空度测定按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合规定。
经过上述检验可以得知，本发明的疫苗保护剂是符合国家要求的。
5、疫苗耐热性保护剂的效力分析
5.1实验疫苗：本发明保护剂a作为实验组；另选现有技术中一种常用的普通保护剂作为对照组。
5.3实验疫苗：
TGEV猪传染性胃肠炎和PEDV流行性腹泻组成的二价活疫苗。
5.3实验方法：
将二价活疫苗与疫苗保护剂混合后采用下列方法制备出成品：
1)将保护剂与抗原按照1:4的体积比混合培苗，得到冻干液；每瓶中含有溶液2.6ml；
2)将冻干液进行冻干，所述冻干工艺包括：
冻干液在7小时内缓慢降到-48℃下保持4小时；逐渐升温至-25℃后保持30小时；升温至-20℃保持2小时，升温至-15℃保持2小时，升温至-10℃保持2小时，升温至0℃保持2小时；升温至5℃保持2小时；升温至26℃保持9小时。
5.4实验结果：
本实施方案的实验结果如表1所示，(单位：TCID50/头份)。
表1：普通保护剂和耐热保护剂冻干数据比较
用普通保护剂病毒在冻干过程中损失0.5～1个滴度；在37℃温度下存放7天后测病毒含量，病毒损失相当大，在2.5～3.5个滴度。本发明的耐热保护剂不仅可以减少病毒在冻干过程中的损失(几乎无损失)，同时大大提高了病毒的耐老化能力，即在7℃放7天后病毒含量损失在1个滴度以内；具体的数据如下表1所示。
本发明还公开了一种用于猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗的疫苗耐热保护剂，包括以下按重量配比的组分：
明胶6％～12％；海藻糖1％～8％；
蔗糖20％～30％；胰蛋白胨6％～15％；
水解乳蛋白1％～8％；酶解酪蛋白5％～20％；
硫脲1％～5％；甘氨酸0.1％～3％；
右旋糖酐0.1％～2％；甘露醇0.1％～2％。
本发明还公开了一种用于猪传染性胃肠炎、流行性腹泻的二联疫苗，疫苗在冻干过程中加入了疫苗耐热保护剂，疫苗耐热保护剂包括以下按重量配比的组分：
明胶6％～12％；海藻糖1％～8％；
蔗糖20％～30％；胰蛋白胨6％～15％；
水解乳蛋白1％～8％；酶解酪蛋白5％～20％；
硫脲1％～5％；甘氨酸0.1％～3％；
右旋糖酐0.1％～2％；甘露醇0.1％～2％。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可做出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (10)

1.一种疫苗耐热保护剂，其特征在于，包括以下按重量配比的组分：
明胶6%~12%；海藻糖1%~8%；
蔗糖20%~30%；胰蛋白胨6%~15%；
水解乳蛋白1%~8%；酶解酪蛋白5%~20%；
硫脲1%~5%；甘氨酸0.1%~3%；
右旋糖酐0.1%~2%；甘露醇0.1%~2%。
2.如权利要求1所述的疫苗耐热保护剂，其特征在于，包括以下按重量配比的组分：
明胶10%；海藻糖5%；
蔗糖20%；胰蛋白胨8%；
水解乳蛋白3%；酶解酪蛋白15%；
硫脲2%；甘氨酸1%；
右旋糖酐0.5%；甘露醇0.5%。
3.如权利要求1或2所述的疫苗耐热保护剂，其特征在于：所述疫苗耐热保护剂的溶剂为注射用水。
4.如权利要求1或2所述的疫苗耐热保护剂，其特征在于：所述疫苗耐热保护剂包括保护剂A液和保护剂B液；所述保护剂A液包括海藻糖、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐和甘露醇；所述保护剂B液包括明胶、蔗糖和胰蛋白胨。
5.一种用于猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗的疫苗耐热保护剂，其特征在于，包括以下按重量配比的组分：
明胶6%~12%；海藻糖1%~8%；
蔗糖20%~30%；胰蛋白胨6%~15%；
水解乳蛋白1%~8%；酶解酪蛋白5%~20%；
硫脲1%~5%；甘氨酸0.1%~3%；
右旋糖酐0.1%~2%；甘露醇0.1%~2%。
6.一种疫苗，所述疫苗在冻干过程中加入了疫苗耐热保护剂，其特征在于：所述疫苗耐热保护剂包括以下按重量配比的组分：
明胶6%~12%；海藻糖1%~8%；
蔗糖20%~30%；胰蛋白胨6%~15%；
水解乳蛋白1%~8%；酶解酪蛋白5%~20%；
硫脲1%~5%；甘氨酸0.1%~3%；
右旋糖酐0.1%~2%；甘露醇0.1%~2%。
7.一种用于猪传染性胃肠炎、流行性腹泻的二联疫苗，所述疫苗在冻干过程中加入了疫苗耐热保护剂，其特征在于：所述疫苗耐热保护剂包括以下按重量配比的组分：
明胶6%~12%；海藻糖1%~8%；
蔗糖20%~30%；胰蛋白胨6%~15%；
水解乳蛋白1%~8%；酶解酪蛋白5%~20%；
硫脲1%~5%；甘氨酸0.1%~3%；
右旋糖酐0.1%~2%；甘露醇0.1%~2%。
8.一种疫苗耐热保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）配料：称取配方量的明胶、海藻糖、蔗糖、胰蛋白胨、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐和甘露醇；
2）制备保护剂A液：将海藻糖、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐和甘露醇加入适量注射用水中，过滤除菌备用；
3）制备保护剂B液：将明胶、蔗糖和胰蛋白胨溶解于注射用水中经高温高压灭菌处理后备用；
4）将保护剂A液和保护剂B液按照1:1比例配置成混合液，该混合液即为疫苗耐热保护剂。
9.一种疫苗的冻干制备方法，包括以下步骤：
1）将疫苗耐热保护剂与抗原混合培苗，得到冻干液；
2）将冻干液使用冷冻干燥机冻干；
所述疫苗耐热保护剂包括以下按重量配比的组分：
明胶6%~12%；海藻糖1%~8%；
蔗糖20%~30%；胰蛋白胨6%~15%；
水解乳蛋白1%~8%；酶解酪蛋白5%~20%；
硫脲1%~5%；甘氨酸0.1%~3%；
右旋糖酐0.1%~2%；甘露醇0.1%~2%。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：
所述步骤1）中疫苗耐热保护剂与抗原的混合比例为1:4；
所述冻干的工艺包括：
冻干液在7小时内缓慢降到-48℃下保持3~5小时；逐渐升温至-25℃后保持30~40小时；升温至-20℃保持1~3小时，升温至-15℃保持1~3小时，升温至-10℃保持1~3小时，升温至0℃保持1~3小时；升温至5℃保持1~3小时；升温至26℃保持7~11小时。
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