CN111317723A - 一种畜禽活疫苗冻干保护剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种畜禽活疫苗冻干保护剂，所述疫苗冻干保护剂的活性成分按照重量分数计，包括蛋白水解物1～20重量份，蔗糖3～15重量份，明胶0.5～4重量份，海藻糖0.5％～15重量份和左旋咪唑1～5重量份。使用本发明的冻干保护剂的畜禽活疫苗可以在2～8℃长期保存，具有良好的耐热能力，且使用该冻干保护剂冻干的畜禽活疫苗在稀释液稀释后在常温保存4h，活疫苗抗原含量无显著变化。

Description

一种畜禽活疫苗冻干保护剂
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种畜禽活疫苗冻干保护剂。
背景技术
畜禽活疫苗广泛运用于动物疫病的防控，在生产过程中活疫苗通常以真空冷冻干燥的方法进行冻干处理，因此在生产过程中需要使用冻干保护剂。普遍使用的保护剂有牛奶蔗糖保护剂、蔗糖明胶保护剂等常规保护剂以及一些具备一定耐热能力的耐热保护剂，传统的冻干保护剂冻干后需要在-15℃保存，而耐热保护剂可以在2～8℃保存。耐热保护剂的出现虽然解决了一定的问题，使得保存条件更方便，运输更便捷，但很多耐热保护剂在稀释后疫苗含量显著下降，严重影响了疫苗的质量。基于耐热保护剂的现有技术缺陷，需要寻求一种新的畜禽活疫苗冻干保护剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有的耐热保护剂在稀释后疫苗含量严重下降的问题。
为解决这一问题，本发明提供一种疫苗冻干保护剂，所述疫苗冻干保护剂的活性成分按照重量分数计，包括蛋白水解物11重量份，蔗糖6重量份，盐酸左旋咪唑1.2重量份，明胶0.95重量份和海藻糖1.5重量份。
其中，所述蛋白水解物为酶解酪蛋白、胰蛋白胨和水解乳蛋白中至少一种。
其中，所述蛋白水解物为酶解酪蛋白和胰蛋白胨。
其中，所述疫苗冻干保护剂的活性成分中的蛋白水解物按照重量份计，包括所述解酪蛋白4.5重量份，胰蛋白胨6.5重量份。
其中，所述疫苗冻干保护剂的溶剂为水。
当溶剂为水时，所述溶液中各成分的质量百分含量分别为，蛋白水解物1％～20％，蔗糖3～15％，明胶0.5～4％，海藻糖0.5％～15％，盐酸左旋咪唑1～5％，其余为水。所述溶液的pH值为7.0～7.4。
上述的疫苗冻干保护剂在活菌疫苗冻干和保存中的应用也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供一种活菌疫苗的冻干方法，包括如下步骤：将活菌疫苗与上述的冻干保护剂混合，将得到的菌悬液冻干。
其中，所述冻干按照如下程序进行：
(1)常压下2小时内下降至-40℃以下，并维持3小时；
(2)抽真空并使真空度维持在10pa以内，按照1℃/h的速度升温至-15℃，-15℃维持至水线消失；
(3)按照5℃/h的速度升温至20℃，20℃维持3小时；取出并压盖。
本发明的有益效果在于，使用本发明的冻干保护剂的畜禽活疫苗可以在2～8度长期保存，具有良好的耐热能力，且使用该冻干保护剂冻干的畜禽活疫苗在稀释液稀释后在常温保存4h，活疫苗抗原含量无显著变化。相较于现有的耐热保护剂的技术缺陷，本发明的畜禽活疫苗冻干保护剂，使用该耐热保护剂制备的疫苗不仅具备良好的耐热能力，而且在使用时具备良好的稳定性，与常规疫苗相比较其免疫原性更好，更适宜广泛的推广和使用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1冻干保护剂的制备
(1)冻干保护剂1的制备
分别称量酶解酪蛋白8.5g(Sigma-Aldrich)，胰蛋白胨60g(Thermo FisherScientific)，水解乳蛋白15g(Sigma-Aldrich)，蔗糖80g(成都市科龙化工试剂厂)，盐酸左旋咪唑10g(生工生物工程(上海)股份有限公司)，明胶10g(北京博益通达科技有限公司)，海藻糖12g(生工生物工程(上海)股份有限公司)加入到800ml注射用水中，测定PH值并调整至7.0～7.4之间，加注射用水定容至1000ml，高压灭菌或使用滤膜过滤除菌，然后置2～8℃保存不超过30天。
(2)冻干保护剂2的制备
分别称量酶解酪蛋白45g，胰蛋白胨65g，蔗糖60g，盐酸左旋咪唑12g，明胶9.5g，海藻糖15g加入到800ml注射用水中，测定PH值并调整至7.0～7.4之间，加注射用水定容至1000ml，高压灭菌或使用滤膜过滤除菌，然后置2～8℃保存不超过30天。
(3)冻干保护剂3的制备
分别称量酶解酪蛋白25g，水解乳蛋白70g，蔗糖60g，盐酸左旋咪唑9g，明胶9g，海藻糖15g加入到800ml注射用水中，测定PH值并调整至7.0～7.4之间，加注射用水定容至1000ml，高压灭菌或使用滤膜过滤除菌，然后置2～8℃保存不超过30天。
(4)对照保护剂的配置
分别称量脱脂乳100g(中山市正好贸易有限公司)，蔗糖50g加入到800ml注射用水中，测定PH值并调整至7.0～7.4之间，加注射用水定容至1000ml，高压灭菌30分钟，冷却后2～8℃保存不超过30天。
实施例2冻干保护剂的安全性试验
购买20头4～6周龄仔猪，随机分为4组，每组5头；分别向4组仔猪的颈部肌肉注射实施例1中制备的冻干剂保护1-3和对照保护剂10ml，连续观察21日，4组(共20头)仔猪均无不良反应。
另外购买20只健康豚鼠，随机分为4组，每组5只；分别四组豚鼠的腹腔注射实施例1中制备的冻干剂保护1-3和对照保护剂2ml，连续观察14日，4组(共20只)豚鼠无不良反应。
上述实验证明，本发明实施例1中的冻干保护剂和对照保护剂均无毒性。
实施例3使用耐热保护剂冻干猪伪狂犬病活疫苗
1.猪伪狂犬病活疫苗冻干品的制备
猪伪狂犬病活疫苗SA215株病毒液(畜科生物工程有限公司)，其中病毒含量为108.0TCID50/ml。
分别将猪伪狂犬病活疫苗SA215株病毒液与实施例1中制备的冻干保护剂1、冻干保护剂2、冻干保护剂3和对照保护剂按1：1的体积比例混合并按照2ml/瓶进行分装。分装后放置到冻干机内。按照如下程序进行冻干：2小时内下降至-40℃以下，并维持3小时；抽真空并使真空度维持在10pa以内，按照1℃/h的速度升温至-15℃，-15℃维持至水线消失；按照5℃/h的速度升温至20℃，20℃维持3小时；取出并压盖，分别得到猪伪狂犬病活疫苗冻干品1-4。
2.冻干样品的检测
2.1性状观测：上述制备的猪伪狂犬病活疫苗冻干品1-4，均为海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加入稀释液后迅速溶解。
2.2无菌检验：按照现行《中国兽药典》附录方法进行检验，结果表明，上述制备的猪伪狂犬病活疫苗冻干品1-4，均无细菌、霉菌生长。
2.3支原体检验：按照现行《中国兽药典》附录方法进行检验，结果表明，上述制备的猪伪狂犬病活疫苗冻干品1-4，均无支原体生长。
2.4安全检验：分别使用猪伪狂犬病活疫苗冻干品1、2、3、4颈部肌肉注射21日龄猪伪狂犬病毒抗体阴性健康仔猪，每种猪伪狂犬病活疫苗冻干品注射5头仔猪，每头仔猪注射1瓶猪伪狂犬病活疫苗冻干品(使用2ml磷酸盐缓冲液稀释后颈部肌肉注射)，连续观察21日，无不良反应，表明本发明实施例3步骤1中制备的猪伪狂犬病活疫苗冻干品1-4均对仔猪具有良好的安全性。
2.5病毒含量测定
使用血清DMEM分别将步骤1中制备的猪伪狂犬病活疫苗冻干品1-4稀释至2ml/瓶，取100ul进行10×倍比稀释，然后取104、105、106、107、108稀释度接种MDBK细胞，每个稀释度接种8孔，每孔0.1ml。37℃5％CO2环境培养96小时，观察各稀释度细胞病变情况。按照Reed-Muench法计算TCID50。结果见表1所示。使用本发明所配置的3种冻干保护剂冻干前后病毒含量下降值低于对照组。
2.6耐热性试验
分别将步骤1中制备的猪伪狂犬病活疫苗冻干品1-4，置37℃保存2周，然后按照2.5的方法进行病毒含量测定。结果见表1所示。使用本发明所配置冻干保护剂2冻干后得到的猪伪狂犬病活疫苗冻干品2放置于37℃保存病毒含量几乎不下降。
表1耐热保护剂冻干伪狂犬病活疫苗后的病毒含量测定结果(TCID50/ml)
Figure BDA0002408749400000041
2.7稀释稳定性测试
分别取步骤1中制备的猪伪狂犬病活疫苗冻干品1-4各1瓶，使用10ml磷酸盐缓冲液稀释，分别在稀释后1、2、3、4小时取100ul进行10×倍比稀释，然后取104、105、106、107、108稀释度接种MDBK细胞，每个稀释度接种8孔，每孔0.1ml。37℃5％CO2环境培养96小时，观察各稀释度细胞病变情况。按照Reed-Muench法计算TCID50。结果显示步骤1中制备的猪伪狂犬病活疫苗冻干品1-3在4小时内稳定，病毒含量只有轻微的降低；表明使用本发明的冻干保护剂制备得到的猪伪狂犬病活疫苗冻干品有着更好的稀释稳定性。
表2猪伪狂犬病活疫苗冻干品稀释后不同时间病毒含量测定结果(TCID50/ml)
Figure BDA0002408749400000051
2.8动物试验
将20头21日龄猪伪狂犬病毒抗体阴性健康仔猪随机分为5组，每组4头，分别分别使用猪伪狂犬病活疫苗冻干品1、2、3、4以及对照磷酸盐缓冲液使用颈部肌肉注射免疫。每瓶疫苗使用20ml磷酸盐缓冲液稀释，稀释后每种疫苗注射4头猪，1、2、3号疫苗以及磷酸盐缓冲液组每头猪颈部肌肉注射2ml，4号疫苗每头猪注射6ml,最终每头试验组猪免疫猪注射伪狂犬病毒约106.5TCID50。注射后28天，采集所有猪血清按照现行《中国兽药典》附录方法测定猪伪狂犬病毒中和抗体。测定得到猪伪狂犬病活疫苗冻干品1、2、3、4和对照磷酸盐缓冲液组的中和抗体分别为：145.0±13.7、136.9±29.6、111.0±25.6、67.2±8.2和<4。通过中和抗体测定发现使用本发明的畜禽活疫苗冻干保护剂冻干的猪伪狂犬病活疫苗免疫后仔猪中抗体显著高于常规保护剂。
实施例4.使用耐热保护剂冻干鸭瘟活疫苗
1.鸭瘟活疫苗冻干品的制备
鸭瘟活疫苗病毒液(中国兽医微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CVCCAV1222)，其中病毒含量为107.43TCID50/ml。
分别将鸭瘟病毒液与实施例1中制备的冻干保护剂1、冻干保护剂2、冻干保护剂3和对照保护剂按1：1的体积比例混合并按照2ml/瓶进行分装。分装后放置到冻干机内。按照如下程序进行冻干：2小时内下降至-40℃以下，并维持3小时；抽真空并使真空度维持在10pa以内，按照1℃/h的速度升温至-20℃，-20℃维持至水线消失；按照5℃/h的速度升温至20℃，20℃维持2小时；取出并压盖。分别得到鸭瘟活疫苗冻干品1-4。
2.冻干样品的检测
2.1性状观测：上述制备的鸭瘟活疫苗冻干品1-4，均为海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加入稀释液后迅速溶解。
2.2无菌检验：按照现行《中国兽药典》附录方法进行检验，结果表明，上述制备的鸭瘟活疫苗冻干品1-4，均无细菌、霉菌生长。
2.3支原体检验：按照现行《中国兽药典》附录方法进行检验，结果表明，上述制备的鸭瘟活疫苗冻干品1-4，均无支原体生长。
2.4安全检验：分别使用步骤1中的鸭瘟活疫苗冻干品1、2、3、4颈部皮下注射7日龄雏鸭，每种鸭瘟活疫苗冻干品注射10只雏鸭，每只雏鸭注射1瓶鸭瘟活疫苗冻干品(使用1ml磷酸盐缓冲液稀释后颈部皮下注射)连续观察14日，无不良反应，表明本发明实施例4步骤1中制备的鸭瘟活疫苗冻干品1-4具有良好的安全性。
2.5病毒含量测定
使用血清DMEM分别将步骤1中制备的鸭瘟活疫苗冻干品1-4稀释至2ml/瓶，取100ul进行10×倍比稀释，然后取102、103、104、105、106、107稀释度接种鸭胚成纤维细胞，每个稀释度接种8孔，每孔0.1ml。37℃5％CO2环境培养96小时，观察各稀释度细胞病变并记录病变孔数。按照Reed-Muench法计算TCID50。结果见表3所示。本发明所使用的冻干保护剂冻干前后病毒含量下降值显著低于对照冻干保护剂。
2.6耐热性试验
分别将步骤1中制备的鸭瘟活疫苗冻干品1-4，置37℃保存2周，然后按照3.2.5的方法进行病毒含量测定。结果见表3所示。本发明所使用的冻干保护剂得到的鸭瘟活疫苗冻干品1-3的耐热性能显著优于使用对照冻干保护剂得到的鸭瘟活疫苗冻干品4。
表3冻干鸭瘟活疫苗后的病毒含量测定结果
Figure BDA0002408749400000061
Figure BDA0002408749400000071
结合上述实施例可以看出，使用本发明的冻干保护剂的畜禽活疫苗可以在2～8℃长期保存，具有良好的耐热能力，且使用该冻干保护剂冻干的畜禽活疫苗在稀释液稀释后在常温保存4h，活疫苗抗原含量无显著变化，本发明的冻干保护剂有着良好的应用前景。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (8)

1.一种疫苗冻干保护剂，其特征在于，所述疫苗冻干保护剂的活性成分按照重量分数计，包括蛋白水解物11重量份，蔗糖6重量份，盐酸左旋咪唑1.2重量份，明胶0.95重量份，海藻糖1.5重量份。
2.根据权利要求书1所述的疫苗冻干保护剂，其特征在于，所述蛋白水解物为酶解酪蛋白、胰蛋白胨和水解乳蛋白中至少一种。
3.根据权利要求书2所述的疫苗冻干保护剂，其特征在于，所述蛋白水解物为酶解酪蛋白和胰蛋白胨。
4.根据权利要求书1-3任一所述的疫苗冻干保护剂，其特征在于，所述疫苗冻干保护剂的活性成分中的蛋白水解物按照重量份计，包括所述解酪蛋白4.5重量份，胰蛋白胨6.5重量份。
5.根据权利要求书1-4任一所述的疫苗冻干保护剂，其特征在于，所述疫苗冻干保护剂的溶剂为水。
6.权利要求1至5任一所述的疫苗保护剂在活菌疫苗冻干和保存中的应用。
7.一种活菌疫苗的冻干方法，包括如下步骤：将活菌疫苗与权利要求1至5任一所述的冻干保护剂混合，将得到的菌悬液冻干。
8.根据权利要求6所述的冻干方法，其特征在于，所述冻干按照如下程序进行：
(1)常压下2小时内下降至-40℃以下，并维持3小时；
(2)抽真空并使真空度维持在10pa以内，按照1℃/h的速度升温至-15℃，-15℃维持至水线消失；
(3)按照5℃/h的速度升温至20℃，20℃维持3小时；取出并压盖。
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