CN103463640A

CN103463640A - 犬瘟热病毒活疫苗耐热冻干保护剂及制备方法

Info

Publication number: CN103463640A
Application number: CN2013104221297A
Authority: CN
Inventors: 谭斌; 温永俊; 孙娜; 张淑琴; 王凤雪; 杨勇
Original assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Current assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Priority date: 2013-09-17
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2013-12-25

Abstract

本发明涉及犬瘟热病毒活疫苗耐热冻干保护剂及制备方法，其特征在于按质量份数由以下物质混配而成：蔗糖10-30、L-谷氨酸钠0.01-5、聚乙烯吡咯烷酮1-2、水解乳蛋白10-30、蜂胶0.1-10，余量为蒸馏水。其制备方法：将上述物质溶解混合后，经高压灭菌后制得耐热冻干保护剂，使用时按保护剂与病毒抗原液比为1∶2混合，分装后再进行冷冻干燥。冻干过程病毒损失率低，冻干产品在2～8℃保存期不少于18个月。

Description

犬瘟热病毒活疫苗耐热冻干保护剂及制备方法

技术领域

本发明涉及一种犬瘟热病毒活疫苗耐热冻干保护剂及制备方法，属于兽用生物制品疫苗制造领域。

背景技术

目前，疫苗是预防畜禽病毒性传染病的主要手段之一，在我国动物用疫苗中，弱毒活疫苗占很大比例。国内疫苗企业常用的保护剂主要是蔗糖、脱脂乳粉等，配方单一，保护效果差，如果在2 ～ 8℃条件下，保存期只有6 个月左右，通常需要在-15℃以下条件储运。疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制，加上基层防疫部门缺乏必要的冷冻和冷藏设施，容易造成因冷链系统不完善而导致疫苗免疫失败。近年来，国外不断将现代生物技术运用到动物生物制品生产技术的研制上，如利用耐热保护剂降低疫苗的储运条件，新技术的使用将大幅提升产品质量。而目前国内企业普遍沿用传统的动物疫苗生产技术，这些传统的冻干工艺技术存在能耗高、劳动强度大、产品稳定性差、技术含量低等问题，产品质量与国外同类产品相比差距明显。

发明内容

本发明的目的在于提供一种犬瘟热病毒活疫苗耐热冻干保护剂，其是通过对多种冻干保护剂基质与犬瘟热病毒进行相容性研究，筛选出与病毒相容性良好且能大幅度提高疫苗病毒热稳定性的基质配成耐热保护剂，并由此设计一种新型个性化冻干配方，并用与此相适应的冻干曲线对病毒进行冻干。

本发明的另一目的在于提供一种犬瘟热病毒活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其将该保护剂与犬瘟热病毒按1:2混合，冻干后所成的活疫苗可在2 ～ 8℃条件下可长期保存，其工艺方法可操作性强，冻干前后病毒损失率低。

本发明的技术方案是这样实现的：一种犬瘟热病毒活疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于按质量份数由以下物质混配而成：蔗糖10-30、L- 谷氨酸钠0.01-5、聚乙烯吡咯烷酮1- 2、水解乳蛋白10-30、蜂胶0.1-10，余量为蒸馏水。

犬瘟热病毒活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法具体步骤如下：将10-30蔗糖、0.01-5 L- 谷氨酸钠、1- 2聚乙烯吡咯烷酮、10-30水解乳蛋白、0.1-10蜂胶在120℃下灭菌30 分钟，制得耐热冻干保护剂；按耐热冻干保护剂与病毒抗原液比为1 ∶ 2 充分混匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。

上述冷冻干燥的步骤如下：1）首先将冻干机预冷至-10℃，将分装好的疫苗装入冻干机箱体内；2）再以1℃ /min 的速度降温至-45℃，在此温度下维持3 ～ 4 个小时后，抽真空至1Pa 后，再开始缓慢升温，14 ～ 18 小时内升至0℃；3）之后以每小时5 ～ 8℃的速度升温至25℃，维持4 ～6 小时加塞出箱；冻干全程为28 ～ 32 小时。

本发明的积极效果是冻干前后病毒损失率低，损失率仅为0.2 个滴度，冻干产品耐老化程度高，冻干的产品在37℃条件下保存7d，病毒损失率为1.2 个滴度之内，产品在2 ～ 8℃保存至少18个月。因此，本研究针对犬瘟热病毒的理化特性、病毒与耐热保护剂基质的相容性，筛选出与病毒相容性良好且能大幅度提高疫苗病毒热稳定性的基质配成耐热保护剂，并根据病毒抗原结构与病毒保护机制的关系、病毒抗原对热的敏感性建立适用于不同病毒的新型个性化冻干配方，既对病毒有保护作用，又能在冷冻、干燥的条件下形成耐热性构架，使病毒免受热源损伤而失活；由此制备出耐热冻干犬瘟热活疫苗，2～8℃保存有效期达24个月或37℃保存有效期达7日。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述：

实施例1

1、疫苗抗原的制备

生产用毒种为犬瘟热病毒疫苗株，由中国农业科学院特产研究所鉴定、保管和提供。选取所需数量的细胞( 已长成单层的细胞转瓶)，弃去生长液，按1％ (V/V) 接种生产用毒种病毒，加入含2％胎牛血清的DMEM 细胞培养液，37℃旋转(9 ～12 转/ 小时) 培养。在显微镜下观察由病毒引起的CPE，当CPE 达到80％以上时收获细胞培养物，冻融1 次，经离心或过滤除去细胞碎片，冻存-25℃以下。按《中国兽药典》附录对疫苗抗原进行无菌支原体及外源病毒检验，应符合规定。

2、冻干保护剂的配制

犬瘟热病毒活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，按以下步骤进行：蔗糖15g、L- 谷氨酸钠1g、聚乙烯吡咯烷酮1g、水解乳蛋白15g、蜂胶1g,溶于100ml蒸馏水中，在120℃灭菌30 分钟，制得耐热冻干保护剂。

3、配苗：将检验合格的犬瘟热病毒，按1 ∶ 2 的比例加入本发明所设计和制备的冻干保护剂，充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。

4、冻干：首先将冻干机预冷至-10℃，将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，再以

1℃ /min 的速度降温至-45℃，在此温度下维持3 个小时后，开始抽真空至1Pa 后，再开始缓慢升温，18 小时内升至0℃，之后以每小时6℃的速度升温至25℃，维持5 小时加塞出箱；冻干全程为30 小时，冻干后疫苗每头份病毒含量应≥ 10^4.7TCID50 /ml。

实施例2

按将蔗糖10g、L- 谷氨酸钠0.01g、聚乙烯吡咯烷酮1g、水解乳白蛋白10g、蜂胶0.1g,溶于100ml蒸馏水中，在120℃下灭菌30 分钟，制得耐热冻干保护剂；按耐热冻干保护剂与病毒抗原液比为1 ∶ 2 充分混匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。

上述冷冻干燥的步骤如下：1）首先将冻干机预冷至-10℃，将分装好的疫苗装入冻干机箱体内；2）再以1℃ /min 的速度降温至-45℃，在此温度下维持3 .5个小时后，抽真空至1Pa 后，再开始缓慢升温，14 小时内升至0℃；3）之后以每小时5℃的速度升温至25℃，维持4小时加塞出箱；冻干全程为29小时。

实施例3

将蔗糖30g、L- 谷氨酸钠5g、聚乙烯吡咯烷酮2g、水解乳白蛋白30g、蜂胶0.5g,溶于100ml蒸馏水中，在120℃下灭菌30 分钟，制得耐热冻干保护剂；按耐热冻干保护剂与病毒抗原液比为1 ∶ 2 充分混匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。

上述冷冻干燥的步骤如下：1）首先将冻干机预冷至-15℃，将分装好的疫苗装入冻干机箱体内；2）再以1℃ /min 的速度降温至-45℃，在此温度下维持4 个小时后，抽真空至1Pa 后，再开始缓慢升温，14 ～ 18 小时内升至0℃；3）之后以每小时8℃的速度升温至25℃，维持6 小时加塞出箱；冻干全程为32 小时。

对上述实施例冻干后产品做以下的技术参数及检测：

1、产品的物理性状、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、剩余水分测定和真空度测定按《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。

2、冻干周期不超过35 小时。

3、产品的安全性试验该疫苗按产品使用剂量的10倍剂量，对5 只60 日龄健康断乳犬瘟热病毒抗原抗体双阴仔貂进行皮下注射，每日测温并观察21 日，无体温反应和临床症状。

4、病毒含量测定及标准

测定方法：

按瓶签注明的头份，用无血清DMEM 细胞培养液作10 倍系列稀释，取适宜的稀释度，分别接种于已生长良好单层，弃去细胞培养液的96 孔Vero细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照。置37℃、含5％ CO2 培养箱中吸附1 小时后，每孔补加含4％胎牛血清的DMEM 培养液0.1ml。置37℃、含5％ CO2 培养箱中培养观察5日，根据Reed-Muench 法计算TCID50。

标准

A. 冻干病毒损失率为0.5 个滴度以下。

B. 冻干后TCID50 均≥ 10^5.3TCID50/ml。

C. 产品在37℃条件下保存7d，病毒损失率为1.2 个滴度之内。

D. 产品在2 ～ 8℃条件下保存18个月,测定病毒含量每头份均≥ 0^4.0TCID50/ml。

5、效力测定

病毒含量测定将疫苗用无血清DMEM 细胞培养液稀释为1 头份/ml，再作10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-64 个稀释度，分别接种于已生长良好单层，弃去细胞培养液的96 孔Vero细胞培养板，每个稀释度接种6 孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照。置37℃、含5％ CO2 小时后，每孔补加含4％胎牛血清的DMEM 培养液0.1ml。置37℃、含5％CO2 培养箱中培养观察5 日，根据Reed-Muench 法计算TCID50。每头份病毒含量应不低于10^4.0TCID50/ml。

Claims

1.一种犬瘟热病毒活疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于按质量份数由以下物质混配而成：蔗糖10-30、L- 谷氨酸钠0.01-5、聚乙烯吡咯烷酮1- 2、水解乳蛋白10-30、蜂胶0.1-10，余量为蒸馏水。

2.犬瘟热病毒活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征在于具体步骤如下：将10-30蔗糖、0.01-5 L- 谷氨酸钠、1- 2聚乙烯吡咯烷酮、10-30水解乳蛋白、0.1-10蜂胶在120℃下灭菌30 分钟，制得耐热冻干保护剂；按耐热冻干保护剂与病毒抗原液比为1 ∶ 2 充分混匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。

3. 根据权利要求1犬瘟热病毒活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征在于所述的冷冻干燥的步骤如下：1）首先将冻干机预冷至-10℃，将分装好的疫苗装入冻干机箱体内；2）再以1℃ /min 的速度降温至-45℃，在此温度下维持3 ～ 4 个小时后，抽真空至1Pa 后，再开始缓慢升温，14 ～ 18 小时内升至0℃；3）之后以每小时5 ～ 8℃的速度升温至25℃，维持4 ～6 小时加塞出箱；冻干全程为28 ～ 32 小时。