CN109758427A - 一种伪狂犬病活疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种伪狂犬病活疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种伪狂犬病活疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用,所述耐热保护剂由等体积的A液和B液组成,所述A液由以下重量百分比的物质制成:水解乳蛋白4‑15%,葡聚糖5‑10%,余量为水;所述B液由以下重量百分比的物质制成:牛血清白蛋白6‑12%,蔗糖4‑16%,精氨酸0.01‑1.5%,余量为水。将伪狂犬病活疫苗抗原溶液与耐热保护剂按体积比1∶4‑4.5混匀,然后分装,冷冻干燥,即得伪狂犬病活疫苗。本发明耐热剂的使用降低了伪狂犬病活疫苗产品的储运要求,提高了产品在保存和使用中的稳定性。

Description

一种伪狂犬病活疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种伪狂犬病活疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用。
背景技术
目前,伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)冻干产品,在制备工程中,一般是采用5%蔗糖与10%奶粉溶解于注射用水中,经过高压蒸汽灭菌后作为伪狂犬病活疫苗抗原的保护剂(以下简称蔗糖牛奶保护剂)。使用这种保护剂存在以下不足:1、蔗糖牛奶保护剂的配方简单,加入抗原冻干后制备的伪狂犬病活疫苗冻干产品的保护效果受环境影响大,对储存、运输的环境要求较高,需在-20℃的条件下保存才能保证疫苗的效价,保持良好的免疫效果。产品在炎热的夏天中运输,无法或难以保持原有的保存条件,一般使用疫苗箱中添加冰矾降温,但只能保持在5-15℃之间,而且时间达到24-48小时,疫苗的效价在此温度下降明显,大大降低产品的免疫效果。2、该蔗糖牛奶保护剂为通用型疫苗抗原保护剂,不能针对伪狂犬病活疫苗抗原提供专一性的高效保护力。3、该保护剂需要通过高压蒸汽灭菌进行除菌,配方中生物活性成分在高压灭菌条件下容易散失活性,降低保护剂的保护效果。3、蔗糖牛奶保护剂的pH值与抗原pH值相差较大,会导致伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)在配制过程与冷冻干燥过程中产生较大的效价损失,降低产品效价。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种伪狂犬病活疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种伪狂犬病活疫苗耐热保护剂,其由等体积的A液和B液组成,所述A液由以下重量百分比的物质制成:水解乳蛋白4-15%,葡聚糖5-10%,余量为水;所述B液由以下重量百分比的物质制成:牛血清白蛋白6-12%,蔗糖4-16%,精氨酸0.01-1.5%,余量为水。
所述水为注射用水。
所述伪狂犬病活疫苗耐热保护剂的制备方法,包括以下步骤:1)将水解乳蛋白、葡聚糖溶解于注射用水中,116℃灭菌30min得到A液;2)将牛血清白蛋白、蔗糖、精氨酸溶解于注射用水中,采用0.22μm的除菌过滤器过滤除菌得到B液;3)将A液和B液混匀,得到所述耐热保护剂,储存于2-8℃环境下。
本发明的伪狂犬病活疫苗耐热保护剂应用于制备伪狂犬病活疫苗中,其中所述的活疫苗为Bathar-K61弱毒株活疫苗。
利用本发明的耐热保护剂的伪狂犬病活疫苗的制备方法:将伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)抗原溶液与耐热保护剂按体积比1∶4-4.5混均,然后分装,冷冻干燥,即得。
本发明选取多种对伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)抗原有特异性耐热保护作用的成分,通过合理的试验设计与配方优化,筛选出对伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)抗原有耐热保护效果的复合配方,而后将伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)抗原与耐热保护剂混合,冷冻干燥,制成伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)耐热保护剂活疫苗。本发明具有以下有益效果:1、本发明在筛选出基础配方组分的基础上,再加入精氨酸,使得耐热保护剂B液中的pH值稳定在PH=6.5-6.9之间,使得A液与B液混合得到的耐热剂pH值与抗原pH值接近,从而减少伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)在配制过程与冷冻干燥过程中的效价损失。2、该保护剂在配制过程中,考虑到组分中灭菌方式的选择,分别配制A液和B液,B液由于存在牛血清白蛋白,高温灭菌会变性成凝胶状,因此采用过滤除菌;而A液中的葡聚糖,若采用除菌过滤,存在过滤速度慢或无法过滤的难题,因此采用高温灭菌。3、将B液与A液分开配制,也便于在B液配制过程中通过加入精氨酸的方式来调节pH值到合适的范围,同时也可以检测pH是否达标。4、采用本发明耐热保护剂制备的伪狂犬病活疫苗冻干产品对储存、运输的环境要求较低,在2-8℃下保存2年后,效价损失较低,提高了产品在保存和使用中的稳定性。
具体实施方式
实施例1耐热保护剂配方中的大分子组分的筛选
1、将具有潜在耐热效果的大分子组分取代蔗糖牛奶保护剂中的大分子成分奶粉,在冷冻干燥后,发现水解乳蛋白、牛血清白蛋白、葡聚糖等对伪狂犬病毒活疫苗(Bathar-K61弱毒株)的保护作用与蔗糖牛奶保护剂相近似。
抗原冻前效价为:106.25TCID50/0.2ml,同批次抗原分别各配6批苗,按抗原:保护剂=1:4比例配制成疫苗,其中一批为使用5%蔗糖+10%奶粉的蔗糖牛奶保护剂的对照品。其余5批保护剂分别为蔗糖与水解乳蛋白,蔗糖与牛血清白蛋白,蔗糖与葡聚糖,蔗糖与聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖与水解酪蛋白配制而成的保护剂,其中蔗糖含量为5%不变,其余待考察组分按3%、7%、10%浓度配制,每批的配苗总量为900ml。冻后效价如下:
表1
表2
表3
表4
表5
表6
2、将筛选出的保护剂,按抗原:保护剂=1:4的比例配制成疫苗,冷冻干燥后在37℃下保存10天,发现水解乳蛋白、牛血清白蛋白、葡聚糖对伪狂犬病毒活疫苗(Bathar-K61弱毒株)的保护作用优于蔗糖牛奶保护剂。
抗原冻前效价为:106.25TCID50/0.2ml,同批次抗原分别各配5批苗,其中一批为使用5%蔗糖+10%奶粉的蔗糖牛奶保护剂的对照品。其余5批保护剂分别为蔗糖与水解乳蛋白,蔗糖与牛血清白蛋白,蔗糖与葡聚糖,蔗糖与聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖与水解酪蛋白配制而成的保护剂,其中蔗糖含量为5%不变,其余待考察组分按3%、7%、10%浓度配制,每批的配苗总量为900ml。在37℃下保存10天的效价损失对比如下:
表7
表8
由实验结果可知,使用蔗糖-水解乳蛋白体系的保护剂配制的疫苗耐热后效价优于使用蔗糖牛奶保护剂配制的疫苗。
表9
由实验结果可知,使用蔗糖-牛血清白蛋白体系的保护剂配制的疫苗耐热后效价优于使用蔗糖牛奶保护剂配制的疫苗。
表10
由实验结果可知,使用蔗糖-葡聚糖体系的保护剂配制的疫苗耐热后效价优于使用蔗糖牛奶保护剂配制的疫苗。
表11
由实验结果可知,使用蔗糖-聚乙烯吡咯烷酮体系的保护剂配制的疫苗耐热后效价与使用蔗糖牛奶保护剂配制的疫苗效价相近。
表12
由实验结果可知,使用蔗糖-水解酪蛋白体系的保护剂配制的疫苗耐热后效价与使用蔗糖牛奶保护剂配制的疫苗效价相近。
通过以上实验,本发明从多种对伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)抗原有特异性耐热保护作用的大分子组分中,筛选出对伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)抗原有耐热保护效果的优选大分子为水解乳蛋白、牛血清白蛋白以及葡聚糖,然后再加入精氨酸,使得最终制成的耐热保护剂的pH值与抗原pH值接近,减少伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)在配制过程与冷冻干燥过程中的效价损失。
实施例2
伪狂犬病活疫苗耐热保护剂的制备:1)将水解乳蛋白、葡聚糖溶解于注射用水中,116℃、30min灭菌得到A液,A液中水解乳蛋白的重量百分比为10%,葡聚糖的重量百分比为7.5%;2)将牛血清白蛋白、蔗糖、精氨酸溶解于注射用水中,采用0.22μm的除菌过滤器过滤除菌得到B液,B液中牛血清白蛋白的重量百分比为9%,蔗糖的重量百分比为8%,精氨酸的重量百分比为0.75%;3)将A液和B液等体积混匀,得到所述耐热保护剂,储存于2-8℃环境下。
伪狂犬病活疫苗的制备方法:将伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)抗原溶液与耐热保护剂按体积比1∶4混匀,然后分装,冷冻干燥,即得。
实施例3
伪狂犬病活疫苗耐热保护剂的制备:1)将水解乳蛋白、葡聚糖溶解于注射用水中,采用0.22μm的除菌过滤器过滤除菌得到A液,A液中水解乳蛋白的重量百分比为4%,葡聚糖的重量百分比为10%;2)将牛血清白蛋白、蔗糖、精氨酸溶解于注射用水中,采用0.22μm的除菌过滤器过滤除菌得到B液,B液中牛血清白蛋白的重量百分比为6%,蔗糖的重量百分比为16%,精氨酸的重量百分比为0.01%;3)将A液和B液等体积混匀,得到所述耐热保护剂,储存于2-8℃环境下。
伪狂犬病活疫苗的制备方法:将伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)抗原溶液与耐热保护剂按体积比1∶4混匀,然后分装,冷冻干燥,即得。
实施例4
伪狂犬病活疫苗耐热保护剂的制备:1)将水解乳蛋白、葡聚糖溶解于注射用水中,采用0.22μm的除菌过滤器过滤除菌得到A液,A液中水解乳蛋白的重量百分比为15%,葡聚糖的重量百分比为5%;2)将牛血清白蛋白、蔗糖、精氨酸溶解于注射用水中,采用0.22μm的除菌过滤器过滤除菌得到B液,B液中牛血清白蛋白的重量百分比为12%,蔗糖的重量百分比为4%,精氨酸的重量百分比为1.5%;3)将A液和B液等体积混匀,得到所述耐热保护剂,储存于2-8℃环境下。
伪狂犬病活疫苗的制备方法:将伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)抗原溶液与耐热保护剂按体积比1∶4.5混匀,然后分装,冷冻干燥,即得。
实施例5
伪狂犬病活疫苗耐热保护剂的制备:1)将水解乳蛋白、葡聚糖溶解于注射用水中,采用0.22μm的除菌过滤器过滤除菌得到A液,A液中水解乳蛋白的重量百分比为14%,葡聚糖的重量百分比为8%;2)将牛血清白蛋白、蔗糖、精氨酸溶解于注射用水中,采用0.22μm的除菌过滤器过滤除菌得到B液,B液中牛血清白蛋白的重量百分比为10%,蔗糖的重量百分比为10%,精氨酸的重量百分比为0.13%;3)将A液和B液等体积混匀,得到所述耐热保护剂,储存于2-8℃环境下。
伪狂犬病活疫苗的制备方法:将伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)抗原溶液与耐热保护剂按体积比1∶4混匀,然后分装,冷冻干燥,即得。
实施例6
伪狂犬病活疫苗耐热保护剂的制备:1)将水解乳蛋白、葡聚糖溶解于注射用水中,采用0.22μm的除菌过滤器过滤除菌得到A液,A液中水解乳蛋白的重量百分比为6%,葡聚糖的重量百分比为10%;2)将牛血清白蛋白、蔗糖、精氨酸溶解于注射用水中,采用0.22μm的除菌过滤器过滤除菌得到B液,B液中牛血清白蛋白的重量百分比为8%,蔗糖的重量百分比为14%,精氨酸的重量百分比为1.0%;3)将A液和B液等体积混匀,得到所述耐热保护剂,储存于2-8℃环境下。
伪狂犬病活疫苗的制备方法:将伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)抗原溶液与耐热保护剂按体积比1∶4混匀,然后分装,冷冻干燥,即得。
实施例7
使用实施例1的耐热保护剂与使用蔗糖牛奶耐热保护剂的效果比较
蔗糖牛奶保护剂:重量百分比为5%蔗糖与10%奶粉溶解于注射用水中,经过高压蒸汽灭菌后制得。
1、同批次伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)抗原用蔗糖牛奶保护剂和本发明耐热保护剂配制成疫苗后,在37℃下保存10天,用本发明耐热保护剂配方疫苗的效价损失低于使用%蔗糖牛奶保护剂的疫苗。
抗原冻前效价为:106.25TCID50/0.2ml,同批次抗原分别用两种保护剂各配6批苗,每批的配苗总量为3000ml。冻干两种保护剂的疫苗各6批,冻后效价如下:
表13
可见,两种保护剂配制的疫苗冻后效价相近。
在37℃下保存10天的效价损失对比如下:
表14
可见,在37℃下保存10天后,本发明保护剂对疫苗有显著的保护作用。
2、同批次伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)抗原用蔗糖牛奶保护剂和本发明耐热保护剂配制成疫苗后,在25℃下分别存储10天,用本发明耐热保护剂的疫苗效价损失低于使用蔗糖牛奶保护剂的疫苗。
抗原冻前效价为:106.25TCID50/0.2ml,同批次抗原分别用两种保护剂各配6批苗,每批的配苗总量为3000ml。冻干两种保护剂的疫苗各6批,冻后效价如下:
表15
可见,两种保护剂配制的疫苗冻后效价相近。
25℃下保存10天后对所有两种保护剂产品进行检测对比,对比结果如下:
表16
可见,在25℃下保存10天后,本发明保护剂较蔗糖牛奶保护剂对疫苗有显著的保护作用。
3.同批次伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61弱毒株)抗原用蔗糖牛奶保护剂和本发明耐热保护剂配制成疫苗后,在2-8℃下分别存储2年,用本发明耐热保护剂配方疫苗的效价损失低于使用蔗糖牛奶保护剂的疫苗。
抗原冻前效价为:106.25TCID50/0.2ml,用同批次抗原分别用两种保护剂各配6批苗,每批的配苗总量为3000ml。冻干两种保护剂的产品各6批,冻后效价如下:
表17
可见,两种保护剂配制的疫苗冻后效价相近。
在2-8℃下保存2年后对所有两种保护剂产品进行检测对比,对比结果如下:
表18
可见,在2-8℃下保存2年后,本发明耐热保护剂较蔗糖牛奶保护剂对疫苗有显著的保护作用。

Claims (9)

1.一种伪狂犬病活疫苗耐热保护剂,其特征在于:其由等体积的A液和B液组成,所述A液由以下重量百分比的物质制成:水解乳蛋白4-15%,葡聚糖5-10%,余量为水;所述B液由以下重量百分比的物质制成:牛血清白蛋白6-12%,蔗糖4-16%,精氨酸0.01-1.5%,余量为水。
2.根据权利要求1所述的一种伪狂犬病活疫苗耐热保护剂,其特征在于:所述水为注射用水。
3.如权利要求1或2所述的伪狂犬病活疫苗耐热保护剂的制备方法,其特征在于:1)将水解乳蛋白、葡聚糖溶解于注射用水中,灭菌得到A液;2)将牛血清白蛋白、蔗糖、精氨酸溶解于注射用水中,过滤除菌得到B液;3)将A液和B液混匀,得到所述耐热保护剂。
4.根据权利要求3所述的伪狂犬病活疫苗耐热保护剂的制备方法,其特征在于:所述灭菌是在116℃灭菌30min,所述过滤除菌是采用0.22μm的除菌过滤器。
5.根据权利要求3所述的伪狂犬病活疫苗耐热保护剂的制备方法,其特征在于:所得到的耐热保护剂储存于2-8℃环境下。
6.如权利要求1或2所述的伪狂犬病活疫苗耐热保护剂在制备伪狂犬病活疫苗中的应用。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于:所述伪狂犬病活疫苗为Bathar-K61弱毒株活疫苗。
8.一种利用权利要求1所述的耐热保护剂的伪狂犬病活疫苗的制备方法,其特征在于:将伪狂犬病活疫苗抗原溶液与耐热保护剂按体积比1∶4-4.5混匀,然后分装,冷冻干燥,即得。
9.根据权利要求1所述的伪狂犬病活疫苗的制备方法,其特征在于:所述伪狂犬病活疫苗为Bathar-K61弱毒株活疫苗。
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Applicant after: Zhaofenghua Biotechnology (Fuzhou) Co.,Ltd.

Address before: No.110 Yuanzhong village, Gushan Town, Jin'an District, Fuzhou City, Fujian Province

Applicant before: FUZHOU DA BEI NONG BIOTECH Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
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Effective date of registration: 20211012

Address after: No. 110, Yuanzhong village, Gushan Town, Jin'an District, Fuzhou City, Fujian Province 350014

Applicant after: Zhaofenghua Biotechnology (Fuzhou) Co.,Ltd.

Applicant after: Zhaofenghua Biotechnology (Nanjing) Co.,Ltd.

Applicant after: Beijing Biomedical Technology Center of zhaofenghua Biotechnology (Nanjing) Co.,Ltd.

Applicant after: BEIJING KEMUFENG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Address before: No.110 Yuanzhong village, Gushan Town, Jin'an District, Fuzhou City, Fujian Province

Applicant before: Zhaofenghua Biotechnology (Fuzhou) Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
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