BR102015030332A2

BR102015030332A2 - processo para a preparação de uma vacina tetravalente atenuada de dengue, método para produzir uma resposta imune, kit, e, uso de uma composição

Info

Publication number: BR102015030332A2
Application number: BR102015030332A
Authority: BR
Inventors: Neuza Maria Frazatti Gallina
Original assignee: Fundação Butantan
Priority date: 2015-09-08
Filing date: 2015-12-03
Publication date: 2016-07-05
Also published as: TW201718008A; JP6968070B2; CN108289945A; CU20180025A7; CN108289945B; US20170065701A1; AU2016318349B2; US10201600B2; MX2018002901A; JP2018527408A; AU2016318349A1; PE20181135A1; AR105966A1; ECSP18026090A; TWI733694B; BR102015030332B1; US10004795B2; EP3347043A1; CU24579B1; CR20180202A

Abstract

a presente invenção refere-se a um processo para a preparação de uma vacina tetravalente atenuada de dengue e ao produto da mesma. a presente invenção adicionalmente refere-se a um processo para a preparação de uma vacina tetravalente de dengue para administração a um indivíduo, a um método para induzir uma resposta imune aos sorotipos 1, 2, 3 e 4 do vírus da dengue em um paciente e a um kit de vacina tetravalente de dengue.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA VACINA TETRAVALENTE ATENUADA DE DENGUE, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA RESPOSTA IMUNE, KIT, E, USO DE UMA COMPOSIÇÃO" Campo da Invenção [0001] A presente invenção encontra-se no campo da biotecnologia. A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de uma vacina tetravalente atenuada de dengue. A presente invenção também se refere a uma vacina tetravalente atenuada de dengue. A presente invenção também se refere ao uso de uma composição para reconstituir a vacina. A presente invenção adicionalmente se refere a um método para induzir uma resposta imune aos sorotipos 1, 2, 3 e 4 em um paciente. A presente invenção também se refere a um kit de vacina tetravalente de dengue.

Antecedentes da invenção [0002] Atualmente, a dengue é uma doença de grande impacto na saúde pública no Brasil. Ela afeta metade da população mundial que vive em regiões endêmicas, principalmente no Sudeste da Ásia (Pacifico) e na América. De acordo com a OMS, em um estudo recente, estima-se que existam cerca de 390 milhões de infecções de dengue por ano (intervalo de confiança de 95%, de 284 milhões a 528 milhões), das quais 96 milhões (de 67 milhões a 136 milhões) manifestam clinicamente a doença (com qualquer gravidade) [1]. Em outro estudo sobre a prevalência de dengue, estimou- se que 3.900 milhões de pessoas, em 128 paises, estão em risco de infecção com o virus da dengue [2].

[0003] No Brasil, no ano de 2000, a incidência foi de 200.000 casos de dengue e em 2010 houve um milhão de ocorrências. Em 2015, houve 460.502 casos de dengue no Brasil relatados até março. A região sudeste teve o maior número de casos notificados (304.251 casos, 66,1%) em relação ao pais, seguido pelo centro-Oeste (59.855 casos; 13,0%), nordeste (51.221 casos; 11,1%), norte (19.402 casos; 4,2%) e sul (25.773 casos, 5,6% [3].

[0004] A dengue (DF, na sigla em inglês) e sua forma grave, a dengue hemorrágica (DHF, na sigla em inglês) / sindrome de choque da dengue (DSS, na sigla em inglês) pode ser causada pela infecção com qualquer um dos sorotipos DEN1, DEN2, DEN3 e DEN4 de dengue.

[0005] Uma vez que atualmente não existe um fármaco antiviral que trate esta doença e as estratégias de controle do mosquito vetor (Aedes aegypti) têm se revelado ineficazes, a única maneira de controlar o avanço da dengue é através da prevenção, com a utilização de uma vacina contra os quatro tipos de virus da dengue. Até o momento, nenhuma vacina contra a dengue foi licenciada para utilização humana. Estudos epidemiológicos indicam que a infecção primária com um sorotipo de dengue geralmente provoca a DF, e a possibilidade de uma segunda infecção provocar a DHF é de 15 a 80 vezes mais elevada do que a da infecção primária.

Portanto, uma vacina eficaz contra a dengue deve ser composta pelos quatro sorotipos do virus da dengue [4] . No entanto, o desenvolvimento de uma vacina tetravalente de dengue é muito difícil, uma vez que o produto precisa fornecer uma proteção a longo prazo contra todos os sorotipos do vírus da dengue [5].

[0006] O Pedido de Patente Norte-Americano US 13/305.639, continuação do Pedido no. 12/398.043, depositado em 4 de março de 2009, atual Patente no. 8.075.903, que é uma continuação do Pedido no. 10/970.640, depositado em 21 de Outubro, 2004, atual Patente Norte-Americana US no. 7.517.531, continuação do Pedido no. PCT/US03/13279, depositado em 25 de abril de 2003, por parte do governo dos Estados Unidos da América, representado pela Secretaria do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, é intitulado "Vacina Tetravalente de Dengue Contendo uma Deleção Comum de 30 Nucleotídeos em 3 '-UTR dos tipos 1, 2, 3 e 4 de dengue, ou antigênicos quiméricos 1, 2, 3 e 4 do vírus da dengue". A patente acima refere-se a um produto obtido a partir de um processo que inclui uma mistura de quatro sorotipos do vírus da dengue com uma deleção de 30 nucleotídeos ou antigênicos quiméricos do vírus da dengue.

[0007] O Pedido de Patente Norte-americano US 11/982.488, depositado em 02 de novembro de 2007, publicado em 31 de maio de 2012 e concedido em 14 de Agosto de 2012, de Monika Simmons et al., intitulado "Indução de uma resposta imune contra o vírus da dengue utilizando a abordagem prime-boost", descreve métodos para a indução de uma resposta imune ao virus do dengue. O método de indução de uma resposta imune contra o virus da dengue compreende a administração de um imunógeno não replicante seguido por um reforço com uma vacina viva tetravalente atenuada viral. Outro aspecto, é um método de indução de uma resposta imune ao virus da dengue utilizando um regime de prime-boost heterólogo com o imunógeno primário compreendendo um sistema de expressão de DNA, um vetor de expressão de adenovirus ou um sistema de replicão do virus da encefalite equina venezuelana e o reforço imunógeno compreendendo o mesmo, sem o sistema de expressão de DNA. Cada sistema de expressão compreende sequências de DNA que codificam proteínas virais da dengue. A Patente acima descreve um sistema imune para a vacina da dengue. Neste esquema, na primeira imunização, é utilizado um imunógeno não replicante e depois uma vacina viva tetravalente atenuada da dengue. O objeto do presente pedido de patente é um processo para obter uma vacina atenuado viva de dengue.

[0008] A presente invenção ensina o desenvolvimento de uma vacina contra os quatro tipos de vírus da dengue, utilizando as cepas de vírus atenuado rDENlA30-1545 (SEQ ID NO: 1) e variantes do mesmo; rDEN2/4A30(ME)-1495, 7163 (SEQ ID NO:2) e variantes do mesmo; rDEN3A30/31-7164 (SEQ ID NO:3) e variantes do mesmo, e rDEN4A30-7132,7163,8308 (SEQ ID NO:4) e variantes do mesmo. Certos vírus atenuados recombinantes de dengue rDENlA30, rDEN2/4A30, rDEN3A30, e rDEN4A30 são descritos nas Patentes Norte-Americanas US no. 7.517.531, no. 7.226.602 e no. 8.337.860, que são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[0009] A vacina da presente invenção, denominada vacina de dengue 1,2,3,4 (atenuada), é apresentada na forma liofilizada em frascos com 10 doses. No desenvolvimento desta vacina, foi estabelecido o processo que se segue: produção de células Vero e sorotipos 1, 2, 3 e 4 do vírus da dengue para obter os bancos de células e de vírus; produção de suspensões virais com células e vírus provenientes destes bancos; concentração destas suspensões e preparação de volumes ("bulks"); formulação de vacinas monovalentes e tetravalentes; envase; liofilização e selagem do produto.

[0010] Como pode ser visto, nenhum dos documentos do estado da técnica divulga ou sugere um processo para a preparação de uma vacina tetravalente atenuada de dengue, que permita a produção de vacinas de dengue em grande escala. BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] Com o intuito de solucionar os problemas acima mencionados, a presente invenção irá fornecer vantagens significativas sobre os processos existentes para a preparação de vacinas tetravalentes de dengue. Inicialmente, certas modalidades da presente invenção usam cepas de células Vero com baixa passagem (passagem 123) , o que permite um número maior de subcultivos desta linhagem celular, ou seja, um alto rendimento. Além disso, bancos de células Vero mestre e trabalho foram preparados com células mantidas em meio de cultura livre de soro, foram subcultivadas com tripsina de origem não animal e estabilizadas com 5% de DMSO. A utilização de um meio livre de soro leva a uma maior reprodutibilidade, sem mencionar que a utilização de tripsina não animal nos subcultivos de manutenção e amplificação das células Vero torna o processo mais seguro e livre da possibilidade de contaminação do produto final com circovirus de origem suina. Além disso, as células Vero podem ser cultivadas em frascos TC de 225 cm2 (Frascos de Cultura de Tecidos) ou Nunc™ Cell Factory System™ com bandejas de 10 camadas (Thermo Fisher Scientific Inc. Pittsburgh, PA, EUA; área de cultura de cerca de 6,320 cm2), permitindo uma elevada produção de células por frasco TC, de até cerca de 2xl09 células/CFS. A replicação adicional de virus da dengue em células Vero, a partir do qual foram preparados bancos de virus trabalho, aumentaram a produtividade do processo. O volume final da suspensão viral obtida em um ciclo de produção com CFS foi de 14 L (um volume elevado). Em certas modalidades da presente invenção, até cerca de sete coletas podem ser obtidas em um único ciclo de produção do virus. As suspensões de virus da dengue são coletadas a partir de células infectadas através da remoção do meio contendo virus a partir da cultura, substituindo os meios removidos com meios frescos, incubando as células infectadas com os novos meios, e coletando o meio que contém virus após incubação, o que também aumenta a produtividade do processo aqui fornecido. A presente divulgação adicionalmente ensina o tempo ótimo para a coleta de sobrenadantes de suspensões virais através de estudos das curvas de replicação do virus da dengue sorotipos 1, 2, 3 e 4 em células Vero cultivadas em frascos TC e Cell Factory System™, permitindo o aumento do número de coletas. Em certas modalidades, a vacina tetravalente da presente divulgação é preparada com vacinas monovalentes contendo diferentes titulos de virus de dengue de acordo com cada sorotipo (5,7 ± 0,2, 5,6 ± 0,2, 6,1 ± 0,2 e 5,8 ± 0,2 Logio PFU/mL para DENV1, DENV2, DENV3, e DENV4, respectivamente), o que permite uma maior homogeneidade de partículas virais de cada sorotipo na vacina tetravalente. Finalmente, as etapas de envase e liofilização do processo reivindicado fornecem uma vacina que é estável durante 1 ano a 2-8°C.

[0012] Em resumo, o processo para a preparação de uma vacina tetravalente atenuada de dengue o presente pedido de patente apresenta um rendimento elevado e é muito reprodutivel. A vacina, produto do referido processo, é altamente estável e sem contaminantes de origem animal (no soro e tripsina), geralmente utilizada na fabricação de vacinas. As referidas características permitem a produção de vacina de dengue em grande escala. Além disso, a vacina da dengue da presente divulgação tem sido testada em seres humanos no Brasil desde novembro de 2013 (fase II de ensaios clínicos). Os dados preliminares deste estudo demonstraram que este produto é seguro e imunogênico.

[0013] Em um aspecto, a presente invenção refere-se ao processo para a preparação de uma vacina tetravalente atenuada de dengue caracterizada pelo fato de compreender qualquer subconjunto ou a totalidade das seguintes etapas: adaptação de células Vero ao crescimento em meio livre de soro e utilização de uma tripsina de origem não animal para obter os subcultivos de células; amplificação de células Vero em frascos TC de 225 cm2 e posteriormente em Cell Factory System™ (CFS); produção de Banco de Células Mestre (MCB, na sigla em inglês) e Banco de Células Trabalho (WCB, na sigla em inglês) de células Vero e Banco Semente e o Banco de Semente de Trabalho com sorotipos 1, 2, 3 e 4 do vírus da dengue; infecção das células Vero em frascos TC de 225 cm2 ou CFS a partir do banco de células trabalho com sorotipos 1, 2, 3 e 4 do vírus da dengue a partir dos bancos sementes de trabalho do vírus; incubação dos frascos TC ou Cell Factory System™ contendo a suspensão de vírus da dengue / células Vero a 36,5°C (± 1°C) durante 10 dias a 20 dias; coleta dos sobrenadantes, filtragem (membrana de 0,2 pm de porosidade) e armazenagem a -80°C (± 5°C); preparação de volumes ("bulks") de sorotipos 1, 2, 3 e 4 de vírus da dengue; formulação das vacinas monovalentes com estes volumes ("bulks"); formulação de vacina tetravalente com quatro vacinas monovalentes; envase; liofilização; selagem; rotulagem e armazenamento do produto a 2-8°C.

[0014] Em certa modalidades as cepas de células Vero utilizadas são ATCC CCL-81,4 (cGMPVero, rim de macaco verde africano - Cercopithecus aeothiops) . Em uma modalidade adicional, as cepas de virus de dengue utilizadas são rDENlA30-1545; rDEN2/4Δ30 (ME)-1495,7163; rDEN3A3 0/31-7164 e rDEN4A30-7132,7163,8308 do National Institute of Health (NIH) dos Estados Unidos. Em outra modalidade adicional, a MOI das cepas de virus de dengue de cada sorotipo de dengue pode ser de cerca de 0,01 a 0,03 para DENV1 e DENV4, de 0,02 a 0,04 para DENV2, e de 0,05 a 0,08 para DENV3 . Em outra modalidade adicional, as vacinas monovalentes são misturadas na mesma proporção de volume para obter a vacina tetravalente de sorotipos 1, 2, 3 e 4 da dengue (atenuada) . Em uma modalidade adicional, os parâmetros utilizados no processo de secagem por congelamento (liofilização) são: congelamento (de -30°C a -50°C), vácuo (de 20 pbar a 100 pbar) , secagem primária de -30°C a -50°C (de 36 horas a 42 horas) e secagem secundária de -5 a -10°C (de 18 horas a 24 horas) e de 25°C a 29°C (de 8 horas a 15 horas).

[0015] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma vacina tetravalente atenuada de dengue produzida pelo processo, tal como descrito acima.

[0016] Em um outro aspecto, a invenção se refere ao uso de uma composição que compreende 0,2 M de fosfato de sódio monobásico di-hidratado, 0,2 M de fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado, e água WFI (isto é, água para injeção, WFI na sigla em inglês) para reconstituição da vacina produzida pelo processo tal como descrito acima. Em uma modalidade, utilizou-se 5 mL da referida composição para reconstituir a vacina seca.

[0017] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para induzir uma resposta imune aos sorotipos 1, 2, 3 e 4 de virus da dengue em um indivíduo, através da administração da vacina ao referido indivíduo. Em certas modalidades, o indivíduo é um ser humano.

[0018] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um kit de vacina tetravalente de dengue que compreende a vacina tetravalente liofilizada, tal como já referido, uma composição de reconstituição compreendendo 0,2 M de fosfato de sódio monobásico di-hidratado, 0,2 M de fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado, e água WFI.

[0019] Em certas modalidades, são fornecidos processos para a preparação de uma vacina tetravalente atenuada de dengue que compreende: (i) amplificação de células Vero em cultura para produzir bancos mestre e trabalho de células Vero, em que as células Vero são adaptadas para crescimento em meio livre de soro, são cultivadas em meio livre de soro, e são sub-cultivadas com tripsina de origem não-animal desta célula em Frascos de Cultura de Tecidos (TC) de 225 cm2 e depois em um Cell Factory System™ (CFS); (ii) infecção de células Vero a partir do banco mestre ou trabalho com os sorotipos 1, 2, 3 e 4 do virus da dengue a partir de um banco semente ou trabalho de cada virus, em que as células Vero são infectadas de forma independente com sorotipos 1, 2, 3, e 4 do virus da dengue em culturas separadas com meio livre de soro; (iii) incubação dos frascos TC de 225 cm2 ou Cell Factory System™ (CFS) contendo as células Vero infectadas com cada um dos virus de dengue a 36,5°C (± 1°C) durante 10 dias a 20 dias; (iv) coleta dos sobrenadantes de cada cultura; (v) filtração de cada suspensão de virus do dengue da etapa (iv) através de uma membrana com 0,2 pm de porosidade e armazenagem do virus da dengue filtrado a -80°C (± 5°C); (vi) preparação de volumes ("bulks") dos sorotipos 1, 2, 3 e 4 do virus de dengue; (vii) formulação de vacinas monovalentes; (viii) formulação da vacina tetravalente através da mistura das vacinas monovalentes; (ix) envase da vacina tetravalente; (x) liofilização da vacina tetravalente nos frascos; (xi) selagem da vacina tetravalente liofilizada em frascos; e (xii) armazenamento do produto liofilizado e selado a 2-8°C, preparando-se assim uma vacina tetravalente atenuada de dengue.

[0020] Em certas modalidades, é fornecido um processo para a preparação de uma vacina atenuada de dengue tetravalente que compreende: (i) amplificação de células Vero em cultura para produzir bancos mestre e trabalho de células Vero, em que as células Vero são adaptadas para crescimento em meio livre de soro, são cultivadas em meio livre de soro, e são sub-cultivadas com tripsina de origem não animal; (ii) infecção de células Vero do banco Mestre ou Trabalho com sorotipos 1, 2, 3 e 4 do virus da dengue a partir de um banco semente ou trabalho de cada virus; em que as células Vero são infectadas de forma independente com sorotipos 1, 2, 3 e 4 do virus da dengue em culturas separadas com meio livre de soro; (iii) incubação das células Vero infectadas com cada virus da dengue a 36,5°C (± 1°C) durante 10 dias a 20 dias em um frasco de cultura de tecido ou Cell Factory System™; (iv) coleta dos sobrenadantes de cada cultura; (v) filtração de cada suspensão de virus de dengue da etapa (iv) através de uma membrana com 0,2 pm de porosidade e armazenagem do virus filtrado da dengue a -80°C (± 5°C); (vi) preparação de volumes ("bulks") dos sorotipos 1, 2, 3 e 4 de virus de dengue; (vii) formulação de vacinas monovalentes; e (viii) formulação da vacina tetravalente através da mistura das vacinas monovalentes.

[0021] Em certas modalidades, é fornecida uma vacina tetravalente atenuada de dengue que é produzida por qualquer dos processos acima mencionados.

[0022] Em certas modalidades, é fornecido um processo para a preparação de uma vacina tetravalente de dengue para administração a um indivíduo que compreende a etapa de reconstituição da vacina tetravalente liofilizada e selada de dengue produzida por qualquer um dos métodos acima mencionados em uma composição que compreende 0,2 M de fosfato de sódio monobásico di-hidratado, 0,2 M de fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado, e água.

[0023] Também são fornecidos métodos para a indução de uma resposta imune aos sorotipos 1, 2, 3 e 4 do virus da dengue em um individuo, que compreendem a administração da vacina acima mencionada ao individuo.

[0024] Também são fornecidos kits de vacina tetravalente de dengue que compreendem a vacina acima mencionada, uma composição de reconstituição que compreende 0,2 M de fosfato de sódio monobásico di-hidratado, 0,2 M de fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado, e água.

[0025] Em certas modalidades de qualquer um dos processos, vacinas, métodos, ou kits acima mencionados, as cepas de virus de dengue utilizadas são rDENlA30-1545 (SEQ ID NO: 1) ou variantes do mesmo; rDEN2/4A30(ME)-1495,7163 (SEQ ID NO:2) ou variantes do mesmo; rDEN3A30/31-7164 (SEQ ID NO:3) ou variantes do mesmo, e rDEN4A30-7132,7163,8308 (SEQ ID NO:4) ou variantes do mesmo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0026] O propósito da descrição, em conjunto com outras vantagens da mesma, pode ser melhor compreendida por referência às figuras em anexo e as descrições seguintes: [0027] A FIG. 1 é um resumo da descrição, descrevendo todas as etapas do processo para a preparação de uma vacina tetravalente atenuada de dengue.

DESCRIÇÃO

[0028] Embora a presente invenção possa ser susceptível a diferentes modalidades, certas modalidades são mostradas nas figuras e na discussão detalhada que se seguem, com o entendimento de que a presente divulgação pode ser considerada uma exemplificação dos principios da invenção e não se pretende limitar o escopo da invenção ao que está ilustrado e descrito na presente descrição. Processo para a preparação de uma vacina tetravalente atenuada de dengue [0029] Em uma primeira modalidade, a presente invenção refere-se a um processo para a preparação de uma vacina tetravalente atenuada de dengue compreendendo qualquer subconjunto ou todas as seguintes etapas: adaptação de células Vero para crescimento em meio livre de soro e tripsina de origem não animal; amplificação de células Vero na cultura destas células em frascos TC de 225 cm2 e mais tarde em Cell Factory System™ (CFS); produção de bancos mestre e trabalho de células Vero e bancos semente e trabalho de sorotipos 1, 2, 3 e 4 de virus da dengue; infecção de células Vero contidas em frascos TC de 225 cm2 ou CFS com sorotipos 1, 2, 3 e 4 de virus de dengue dos bancos; incubação dos frascos TC de 225 cm2 ou CFS contendo a suspensão de virus da dengue / células Vero a 36,5°C (± 1°C) durante 10 dias a 20 dias; coleta dos sobrenadantes destas culturas, filtragem destas suspensões de virus de dengue na membrana com 0,2 μπι de porosidade e armazenagem a -80°C (± 5°C); preparação dos volumes ("bulks") do virus da dengue, sorotipos 1, 2, 3 e 4; formulação de vacinas monovalentes com estes volumes {"bulks"); formulação de vacina tetravalente através da mistura das vacinas monovalentes; envase, liofilização; selagem e armazenagem do produto a 2-8°C. Em uma modalidade adicional a cepa de células Vero utilizada é ATCC CCL-81,4 (cGMPVero, rim de macaco verde africano -Cercopithecus aeothiops ; disponível no ATCC, Manassas, VA, EUA) . Em uma outra modalidade as cepas de virus de dengue utilizadas são rDENlA30-1545 (SEQ ID NO:1) ou variantes do mesmo; rDEN2/4Δ30(ΜΕ)-1495,7163 (SEQ ID NO:2) ou variantes do mesmo; rDEN3A30/31-7164 (SEQ ID NO:3) ou variantes do mesmo; e rDEN4A30-7132,7163,8308 (SEQ ID NO:4) ou variantes do mesmo. As variantes de cepas de virus de dengue acima mencionadas que podem ser utilizadas incluem, mas não estão limitados a: (1) variantes de rDEN!A30-1545 (SEQ ID NO: 1) que possui um genoma com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5% de identidade de sequência ao longo de todo o comprimento da SEQ ID NO: 1 e variantes com os percentuais de identidades de sequências acima referidas que codificam uma poliproteina viral com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a poliproteina viral codificada pela SEQ ID NO: 1; (2) variantes de rDEN2/4A30(ME)-1495, 7163 (SEQ ID NO:2) que possui um genoma com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5% de identidade de sequência ao longo de todo o comprimento da SEQ ID NO: 2 e variantes com os percentuais de identidades de sequência acima referidas que codificam uma poliproteina viral com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a poliproteina viral codificada pela SEQ ID NO: 2; (3) variantes de rDEN3A30/31-7164 (SEQ ID NO: 3) que possui um genoma com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5% de identidade de sequência ao longo de todo o comprimento da SEQ ID NO: 3 e variantes com os percentuais de identidade de sequência acima referidas que codificam uma poliproteina viral com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a poliproteina viral codificada pela SEQ ID NO : 3; e (4) as variantes de rDEN4A30-7132,7163,8308 (SEQ ID NO:4) que possui um genoma com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5% de identidade de sequência ao longo do todo o comprimento da SEQ ID NO: 3 e variantes com aos percentuais de identidade de sequência acima referidas que codificam uma poliproteina viral com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a poliproteina viral codificada pela SEQ ID NO: 4.

[0030] rDENlA30 (número de acesso do GenBank: AY145123) é um virus vivo atenuado derivado da cepa DEN1 Western Pacific (WP) de tipo selvagem por meio de uma deleção de 30 nucleotideos (Δ30) na região 3' não traduzida (3'UTR). A cepa rDENlA30-1545 (SEQ ID NO.: 1) aqui utilizada codifica para uma única mutação Lys -> Arg no resíduo de aminoácido de número 484 (mutação A1545G) na poliproteína viral.

[0031] Para o desenvolvimento do vírus DEN2, a região ME do DEN2 foi substituída pelos genes correspondentes de rDEN4A30 para criar a vacina candidata rDEN2/4A30 (ME) . A cepa rDEN2/4A30 (ME)-1495,7163 (SEQ ID NO: 2) aqui utilizada codifica uma mutação Ser -» Phe no resíduo de aminoácido número 186 (mutação C1495T) e uma mutação Leu -» Phe no resíduo de aminoácido número 112 (mutação A7163C) na poliproteína viral.

[0032] rDEN3A30/31 é um vírus vivo atenuado derivado da cepa rDEN3A3. Inicialmente foi construída uma cópia de cDNA completa da cepa DEN3 Sleman/78, criando uma deleção de 30 nucleotideos (Δ30) na 3'UTR. A partir do vírus rDEN3A30 resultante, uma deleção adicional de cerca de 31 nucleotideos foi realizada na 3'UTR [2] . Portanto, rDEN3A30/31 inclui a deleção Δ30 original e uma deleção não contígua de 31 nt que remove ambas as estruturas TL-2 e TL-3 originais . A cepa rDEN3ú30/31-7164 resultante (SEQ ID NO.: 3) aqui utilizada codifica uma mutação Vai — Ala no resíduo de aminoácido número 115 (mutação T7164C) na poliproteína viral.

[0033] rDEN4A30 é um vírus vivo atenuado derivado de DEN4 Dominica/81 tipo selvagem utilizando tecnologia de DNA recombinante. Uma estrutura haste-alça (stem-loop structure), identificada como TL2 na estrutura secundária da 3'UTR, foi previamente removida por deleção de 30 nucleotideos a partir do genoma de DEN4 (3'd 172-143) e foi subsequentemente designada como mutação Δ30. A cepa rDEN4A30-7132,7163,8308 (SEQ ID NO: 4) aqui utilizada codifica uma mutação Thr -> Ile no residuo de aa n° 102 (mutação C7132T) , uma mutação Leu Phe no residuo de aminoácido número 112 (mutação A7163C) e uma mutação Lys -* Arg no residuo de aminoácido número 249 (mutação A8308G) na poliproteina viral.

[0034] Em uma modalidade adicional a MOI de cepas de virus de dengue varia para cada sorotipo de dengue: de 0,01 a 0,03 para DENV1 e DENV 4, de 0,02 a 0,04 para DENV2 e de 0,05 a 0,08 para DENV3 . Em outra modalidade, as vacinas monovalentes são misturadas na mesma proporção de volume para obter a vacina tetravalente de sorotipos 1, 2, 3 e 4 de dengue (atenuada). Em outra modalidade, os parâmetros utilizados no processo de secagem por congelamento são: congelamento (de -30°C a -50°C), vácuo (de 20 pbar a 100 pbar) , secagem de -30°C a -50°C (de 36 horas a 40 horas), de -5 a — 10 °C (de 18 horas a 24 horas) e de 25°C a 29°C (de 8 horas a 15 horas) . Em certas modalidades, a adaptação de células Vero para meio livre de soro foi realizada com a passagem 123; o banco de células trabalho foi realizado com a passagem 134; e, o processo para a produção de virus de dengue utilizou células Vero com a passagem de 138 a 149.

[0035] Em certas modalidades, um estabilizador é utilizado antes da etapa (vii) de formulação de vacinas monovalentes. Os estabilizadores adequados para certas modalidades da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, trealose, sacarose, maltose, lactose, galactose, AS04 (um sistema estabilizador incluindo uma mistura estável de hidróxido de alumínio e monofosforil-lípido A) , albumina de soro humano (HSA) , copolímeros em bloco F127 Pluronic®, F68 (BASF), P85 (BASF) e P123 (BASF), polissacarídeo quitosano, e HSA recombinante (rHSA) [8, 9].

Vacina tetravalente atenuada de dengue [0036] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma vacina tetravalente atenuada de dengue produzida pelo processo, tal como descrito acima.

Uso de uma composição para reconstituição de vacina seca [0037] Em outra modalidade, uma composição compreendendo 0,2 M de fosfato de sódio monobásico di- hidratado, 0,2 M de fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado, e água WFI é utilizada para reconstituir a vacina, tal como descrito acima. Em outra modalidade, 5 mL da composição é utilizada para reconstituir a vacina seca. Método para induzir uma resposta imune aos sorotipos 1, 2, 3 e 4 de vírus da dengue em um paciente [0038] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para induzir uma resposta imune aos sorotipos 1, 2, 3 e 4 de vírus da dengue em um indivíduo através da administração da vacina, tal como descrito acima.

[0039] Para o tratamento profilático contra a infecção pelo vírus da dengue, é pretendido que a vacina da presente invenção possa ser administrada antes da exposição de um indivíduo aos sorotipos de 1 a 4 do vírus da dengue e que a resposta imune resultante possa inibir ou reduzir a gravidade da infecção pelo vírus da dengue.

Kit de vacina tetravalente de dengue [0040] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um kit de vacina tetravalente de dengue compreendendo a vacina, tal como descrito acima, uma composição de reconstituição que compreende 0,2 M de fosfato de sódio monobásico di-hidratado, 0,2 M de fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado, e água WFI.

EXEMPLOS

Exemplo 1. DESCRIÇÃO DO PROCESSO DE PRODUÇÃO

[0041] O processo de produção da vacina de dengue 1, 2, 3 e 4 (atenuada) compreende as seguintes etapas: [0042] ETAPA 1. Preparação de meios de cultura e soluções utilizadas no processo de produção da vacina.

[0043] O meio de cultura livre de soro para a manutenção de células Vero, preparação de volumes ("bulks") e formulação da vacina são preparadas como se segue: [0044] Meios livres de soro VP-SFM AGT ou AGT

OptiPRO® (GIBCO): frasco de meio de cultura em pó é diluído em água WFI, e L-Glutamina é então adiciona, de modo que, no final, o meio de cultura apresente 200mM deste reagente. O meio é esterilizado por filtração em membrana de 0,2 pm e amostras são tomadas para a medição do pH e para o teste de esterilidade.

[0045] Meios de cultura Leibovitz (L-15) sem vermelho de fenol: frascos contendo o meio de cultura em pó são diluidos em água WFI. Então, o meio é filtrado em membrana de 0,2 pm. As amostras são tomadas para testes de esterilidade, endotoxina bacteriana, pH e aparência.

[0046] Os meios de cultura filtrados são embalados em frascos de policarbonato e armazenados a 2-8°C.

[0047] Solução salina tamponada com fosfato 0,02 M é composta por cloreto de sódio, fosfato de sódio dibásico, fosfato de potássio monobásico, e água WFI. Esta solução é utilizada para a lavagem das culturas celulares durante o processo de amplificação celular e na concentração das suspensões de virus da dengue.

[0048] ETAPA 2. Preparação de bancos mestre e trabalho de células Vero [0049] Os bancos de células Vero foram obtidos a partir de adaptação da linhagem de células Vero ATCC CCL-81,4 (por exemplo cGMPVero, rim de macaco verde africano - Cercopithecus aeothiops, página 123, lote 7388125) para a cultura em meio livre de soro e tripsina de origem não animal. Esta adaptação foi realizada por subcultivos sucessivos desta célula em cultura celular, em frascos T de 225 cm2 para cultura celular utilizando meio livre de soro (VP-SFM AGT ® - GIBCO) e tripsina recombinante (TrypLE Select® - Gibco) . Após a adaptação das células que crescem apenas em meio com soro para o crescimento em meio livre de soro, as culturas que cresceram em meio livre de soro são utilizadas para preparar os bancos de células.

[0050] Na preparação dos bancos de células mestre e trabalho, células Vero adaptadas contidas em frascos de cultura com uma confluência de 90% a 100% são separadas com tripsina, suspensas em meio OptiPRO AGT (Gibco), centrifugadas e o pellet é re-suspenso no mesmo meio contendo 5% de DMSO. A suspensão de células é homogeneizada e distribuída em criotubos contendo de 4 células/mL a 10xl06 células/mL. Os criotubos são colocados em um congelador a 80°C (± 5°C), durante 48 horas e depois armazenados em nitrogênio liquido. As amostras são coletadas para a certificação de banco através dos seguintes testes de controle de qualidade: Esterilidade, Cariotipagem, Identidade Celular, Agentes Adventicios em Células e Animais, Virus Hemadsorvente e Micoplasmas.

[0051] ETAPA 3. Amplificação das células Vero utilizadas como substrato celular na produção do virus da dengue [0052] O processo de amplificação celular inclui o descongelamento de um criotubo contendo as células Vero a partir de uma célula origem (ATCC-CCL81.4) ou a partir de bancos de células mestre ou trabalho em um banho marra a 37°C (± 1°C). Após o descongelamento, a suspensão de células Vero é colocada em frasco T com meio livre de soro e incubado a 36,5°C (± 1°C) até atingir uma confluência celular de 90% a 100% da área do frasco. Os frascos são removidos da incubadora e as células são submetidas a um novo subcultivo. Neste processo, o tapete celular é lavado com solução salina tamponada com 0,02 M de fosfato e as células são descoladas com tripsina recombinante (TrypLE Select® - GIBCO). As células são suspensas em um meio livre de soro e divididas em frascos TC contendo o mesmo meio. Os frascos TC são incubados novamente a 36,5°C (± 1°C) até atingir uma confluência de 90% a 100% e, posteriormente, ser realizado outro subcultivo. A amplificação das células é inicialmente, feita em frascos TC de 225 cm2 e depois, em Cell Factory System™ (CFS) com bandeja de 10 camadas.

[0053] ETAPA 4. Preparação dos Banco de Virus Dengue Trabalho de DENl, DEN2, DEN3 e DEN4 [0054] Frascos TC com 225 cm2 da área da cultura contendo células Vero amplificadas são infectados com as cepas de virus de dengue rDEN!A30-1545 (SEQ ID NO: 1); rDEN2/4Δ3 0 (ME)-1495,7163 (SEQ ID NO: 2); rDEN3A30/31-7164 (SEQ ID NO: 3); e rDEN4A30-7132,7163 , 8308 (SEQ ID NO: 4), separadamente. A MOI (multiplicidade de infecção) utilizada para a infecção viral é diferente para cada sorotipo: de 0,01 a 0,03 para DENV1 e DENV4, de 0,02 a 0,04 para DENV2 e de 0,05 a 0,08 para DENV3. As culturas infectadas foram incubadas a 36,5°C (± 1°C). Após 8 dias de incubação, os sobrenadantes das culturas infectadas com DEN1A30, DEN2/4A30(ME)-1495,7163, DEN3A30/31-7164 e DEN4A30-7132,7163,8308 são coletados separadamente, filtrados através de uma membrana de esterilização e armazenados em um congelador a -80°C (± 5°C). O meio de cultura dos frascos é substituído, e os frascos são novamente incubados a 36,5°C (± 1°C) . Este procedimento é repetido durante três dias consecutivos para produzir, no final, quatro amostras dos sobrenadantes. Para cultivos infectados com DEN3, este procedimento começa no décimo dia de incubação. As amostras de cada coleta de sobrenadante dos cultivos são retiradas para testes de esterilidade e de titulação de vírus.

[0055] Na preparação de bancos trabalho, as coletas aprovadas em testes de esterilidade, com títulos mais elevados do que 105'0 PFU/mL são misturadas, distribuídas em criotubos com 2 mL a 4 mL e mantidas em nitrogênio líquido. O banco é utilizado após ter sido aprovado nos seguintes testes: Identidade Viral, Esterilidade, Titulação, Agentes Adventícios em Células e Animais, Pesquisa de Vírus Hemadsorvente e Micoplasmas.

[0056] ETAPA 5. Produção de Vírus Dengue sorotipos 1, 2, 3 e 4 para a formulação de vacina da dengue [0057] Após amplificação, as células Vero contidas em frascos TC ou Cell Factory System obtidas a partir do processo de amplificação, tal como descrito na etapa 3, são tripsinizadas e suspensas em meio livre de soro (OptiPRO® AGT - GIBCO). A suspensão de células Vero obtida é inoculada com cepas de virus da dengue rDENlA30-1545, rDEN2/4A30 (ME)-1.495,7163, rDEN3A30/31-7164 e rDEN4A30- 7132,7163,8308, provenientes dos bancos de virus da dengue preparados na etapa 4 do processo para a produção de vacina dengue. Para a inoculação, as diferentes MOI (multiplicidade de infecção) são utilizadas para cada sorotipo: de 0,01 a 0,03 para DENV1 e DENV 4, de 0,02 a 0,04 para DENV2 e de 0,05 a 0,08 para DENV3. Após a inoculação, a suspensão de virus / célula é mantida em agitação à 32°C (± 1°C) durante 30 minutos a 60 minutos e, em seguida, distribuída em frascos TC de 225 cm2 ou CFS com bandeja de 10 camadas. Os meios de cultura livres de soro são adicionados a culturas até atingir o volume de 100 ml a 150 ml no frasco TC e de 1.200 mL a 1.800 ml para CFS. Para CFS com diferentes números de camadas na bandeja, calcula-se o volume do meio de cultura a ser acrescentado, através de uma regra de três. As culturas são incubadas a 36,5°C (± 1°C). No dia 8 ou dia 10 de incubação, de 50% a 60% do meio é removido, e o mesmo volume de meio livre de soro é adicionado às culturas. As culturas são incubadas de novo a 36,5°C (± 1°C) . A coleta dos sobrenadantes de culturas de células Vero infectadas ocorre de 10 dias a 20 dias após a inoculação do virus da dengue.

[0058] O processo de coleta inclui a remoção dos sobrenadantes das culturas infectadas dos frascos TC ou CFS, mistura dos sobrenadantes coletados, filtração esterilizante desta mistura, distribuição da suspensão de virus de dengue filtrada em frascos de polipropileno / policarbonato e armazenamento em um congelador a -80°C (± 5°C). As amostras são tomadas para os testes de esterilidade e titulação viral. Após a aprovação nos testes, os frascos com a suspensão de virus de dengue são removidos do congelador e encaminhados para o processo de concentração.

[0059] As suspensões de virus da dengue coletadas são descongeladas e concentradas pelo processo de filtração tangencial utilizando um sistema Pellicon® (Millipore) com uma membrana de 30 kDa a 50 kDa de porosidade. Amostras são coletadas para testes de controle de qualidade: Titulação viral e Esterilidade. O concentrado viral (Cl) de rDENlA30-1545, rDEN2/4A30(ME)-1495, 7163, rDEN3A30/31-7164, ou rDEN4A30-7132,7163,8308 foi armazenado a -80°C (+ 5°C).

[0060] ETAPA 6. Preparação de Volumes ("bulks") de Virus da Dengue [0061] Os concentrados de virus da dengue Cl (rDENlA30-1545, rDEN2/4Δ30(ME)-1495,7163, rDEN3A30/31-7164, ou rDEN4A30-7132,7163,8308) são retirados do congelador a -80°C (± 5°C), descongelados e submetidos ao seguinte processo: o virus concentrado é diluído com meio Leibovitz sem vermelho de fenol e o fator de diluição utilizado é 5 a 10 vezes o seu volume inicial. O concentrado diluído é concentrado de novo, através de filtração tangencial (sistema Pellicon) até um volume de 2,5 a 3 vezes o seu volume inicial. Este concentrado é denominado C2.

[0062] O concentrado C2 é filtrado em membrana com 0,2 pm de porosidade, distribuído em tubos / frascos e armazenado em um congelador a -80°C (± 5°C) . Amostra são coletadas para testes de controle de qualidade (Esterilidade e endotoxina bacteriana, Micoplasmas, agentes adventícios nas células, Vírus Hemadsorvente, Identidade e titulação viral). Após a aprovação no testes de controle de qualidade, o volume ("bulk") é liberado para a formulação da vacina monovalente.

[0063] Os lotes de volumes de vírus da dengue produzidos em 2013 e 2014 encontram-se na tabela 1.

Tabela 1. Volumes de vírus da dengue de rDENlA30-1545, rDEN2/4A30 (ME)-1495, 7163, rDEN3A3 0/31-7164, e rDEN4A30- 7132,7163,8308 produzidos em 2013 e 2014.

Testes de controle Número Titulação de qualidade Volumes de Viral Endotoxina Lotes frascos Logio PFü/mL bacteriana Outros . testes ______________________________________________(UE/mL)_____ 01/13 18 6,8 <1,25 Aprovado 02/13 40 5,8 < 1,25 Aprovado IB- 01/14 43 6,4 < 0,50 Aprovado DEN1A30/Vero/M 02/14 16 6,9 < 0,73 Aprovado 03/14 24 6,1 <0,51 Aprovado 04/14 26 6,8 <0,50 Aprovado IB- 01/13 19 5,7 < 1,25 Aprovado DEN2/4A30/Vero/M 02/13 32 5, 9 < 1,25 Aprovado 01/14 39 6,4 <0,50 Aprovado 02/14 21 7,0 4,43 Aprovado 03/14 21 7,0 <0,50 Aprovado 04/14 40 6,5 < 0,50 Aprovado 01/13 17 6,1 <1,25 Aprovado IB- 02/13 45 6, 1 < 1,25 Aprovado DEN3A30/31Vero/M 02/14 22 6, 8 < 0,50 Aprovado 03/14 23 6,6 < 0,50 Aprovado 01/13 50 5,9 <1,25 Aprovado 02/13 35 6,3 < 1,25 Aprovado T R — _λ '—j 01/14 23 6, 9 0, 68 Aprovado DEN4A30/Vero/M ^ 02/14 19 6,0 < 0,50 Aprovado 03/14 30 6,8 0,68 Aprovado PS. O valor para endotoxina de até 50 UE/mL é considerado satisfatório, uma vez que o produto final deve ser menor ou igual a 10 UE/mL.

[0064] ETAPA 7. Formulações de vacinas monovalentes de r DEN1Δ30-1545, rDEN2/4Δ30 (ΜΕ)-1495,7163, rDEN3A30/31- 7164, e rDEN4A30-7132,7163,8308 e vacina de sorotipos 1, 2, 3 e 4 de dengue (atenuada) [0065] Quatro vacinas monovalentes de dengue são formuladas, um para cada tipo de virus da dengue (rDENlA30-1545, r DEN 2/4 Δ 3 0 (ME)-1495,7163, rDEN3ã30/31-7164, e rDEN4A30-7132,7163,8308) . Os cálculos para a formulação consistem na determinação de um fator de diluição de modo que as vacinas monovalentes, de acordo com cada sorotipo, são fornecidas nas seguintes quantidades: 5,7 ± 0,2, 5,6 ± 0,2, 6,1 ± 0,2 e 5,8 ± 0,2 Logio PFU/mL para DENV1, DENV2, DENV3, e DENV4, respectivamente.

[0066] A fórmula para determinar o fator de diluição é: antilogaritmo do volume ("bulk") do titulo (Logio PFU/mL) dividido pelo antilogaritmo de titulo viral (Logio PFU/mL) desejado para cada tipo de monovalente. As formulações de rDENlA30-1545, rDEN2/4Δ30(ΜΕ)-1495,7163, rDEN3A30/31-7164, e rDEN4A30-7132, 7163,8308 monovalentes são feitas com meio Leibovitz (L-15) sem vermelho de fenol, concentrado duas vezes, ou seja, mantém-se a forma com os seus componentes originais duas vezes concentrada.

[0067] Para preparar a formulação de vacina de sorotipos da dengue (atenuada), as vacinas monovalentes 1, 2, 3 e 4 são misturadas na mesma proporção de volume. Após homogeneização da vacina tetravalente formulada, o produto é submetido a uma filtração (membrana com 0,2 pm de porosidade) e amostras são retiradas para os testes de controle de qualidade contínuos: Esterilidade e endotoxina bacteriana, Titulação viral, pH, e aspecto do produto.

[0068] ETAPA 8. Envase, liofilização e selagem da vacina tetravalente de dengue.

[0069] Após a formulação da vacina tetravalente de dengue, o produto é encaminhado para o envase em frascos com 3 mL de vacina. Amostras envasadas são tomadas para testes de controle de qualidade (esterilidade, endotoxina bacteriana, titulação viral, aparência e pH).

[0070] Após o envasarnento, elas são transportadas para a liofilizador e inicia-se o processo de liofilização. Neste processo, os seguintes parâmetros são estabelecidos: congelamento (de -30°C a -50°C), vácuo (de 20 pbar a 100 pbar), secagem de -30°C a -50°C (de 36 horas a 40 horas) , de -5°C a -10°C (de 18 horas a 24 horas) e de 25°C a 29°C (de 8 horas a 15 horas).

[0071] No final do processo de liofilização, os frascos com a vacina liofilizada são submetidos a um processo de selagem. O produto final, vacina de dengue 1,2,3,4 (atenuada), é armazenado a 2-8°C. Amostras do lote de vacina são testadas para esterilidade, endotoxina bacteriana, titulação viral, aparência do produto antes e depois da reconstituição com o diluente, pH, DNA residual e testes de umidade residual.

[0072] O produto pode ser denominado vacina de sorotipos 1, 2, 3 e 4 de dengue (atenuada), quando segue as normas brasileiras para a designação de vacinas.

[0073] 0 produto pode ser reconstituido com 5,0 mL de diluente especifico para esta vacina (mistura de fosfatos de sódio), o que corresponde a 10 doses/0,5 mL/frasco. Cada dose contém de 102'7 a 103'7 PFU/dose de cada um dos virus da dengue utilizado nas formulações de vacina de dengue 1, 2, 3 e 4 (atenuadas). Os resultados dos testes de controle de qualidade obtidos de seis lotes produzidos em 2014, são mostrados na tabela 2.

Tabela 2. Lotes de sorotipos 1, 2, 3 e 4 de vacina da dengue (atenuada) produzidos em 2014.

Resultados dos testes de controle de qualidade Os valores para aprovação do lote: endotoxina bacteriana = 10 UE/rnL; Titulação viral = de 102'7 a 103'7 PFU/dose; pH = de 6,8 a 7,2; Resíduo de DNA celular d lOOpg/dose; Umidade residual d 3%; Aparência do produto antes da reconstituição: ligeiramente amarelado (bolo homogêneo (SYHC) e aparência do produto após a reconstituição: líquido transparente ligeiramente amarelado (SYCL). III - DILUENTE PARA A RECONSTITUIÇÃO DA VACINA DE DENGUE 1, 2, 3 e 4 (ATENUADA) Composição: Para a preparação de 1.000 mL

Solução 1 (0,2 M de fosfato de sódio monobásico di-hidratado) ........................................ 195 mL

Solução 2 (0,2 M de fosfato de sódio dibásico hepta- hidratado) ................................. 05 mL

Água WFI q.s.p..................................... 1,000 mL

[0074] Apresentação: frascos ou ampolas com 5,0 mL IV - ESTUDOS DE ESTABILIDADE DA VACINA DE DENGUE 1, 2, 3 e 4 (ATENUADA) ESTUDOS DE ESTABILIDADE A 2-8°C

[0075] Os resultados dos testes efetuados em amostras dos três lotes de vacina de dengue 1, 2, 3 e 4 (atenuada), armazenada a 2-8°C são apresentados nas Tabelas 3 e 4 .

Tabela 3 Resultados dos testes de esterilidade e fisico-quimicos encontrados nos lotes de vacina de dengue 1, 2, 3 e 4 (atenuada) armazenado a 2-8°C SYHC: massa seca homogênea ligeiramente amarelada. SYCL: liquido transparente ligeiramente amarelado. III - DILUENTE PARA A RECONSTITUIÇÃO DA VACINA DE DENGUE 1, 2, 3 e 4 (ATENUADA) Composição: [0076] A análise dos resultados da Tabela 3 indicam que, para até pelo menos um ano de armazenagem, os titulos de virus de sorotipos 1, 2, 3 e 4 da dengue mantiveram-se satisfatórios. Após 18 meses de armazenamento a 2-8°C, os titulos de DENV3 e DENV4 caíram para abaixo do mínimo exigido (102'7 PFU/dose da vacina) .

Tabela 4 - Resultados dos componentes de títulos de vírus de dengue de vacina de dengue 1, 2, 3 e 4 (atenuada) , armazenado a 2-8 °C.

Lotes de _ . . Titulos de virus da dengue Vacina Sorotxpos__________________(Log.,, PFg/dosa)_________ Meses de armazenamento a 2-8°C ______________________0 3 6 9 12 18 DEN1 3,1 3,2 3,3 3,3 3,1 3,0 DEN2 3,1 3,2 3,3 3,3 3,1 3,0 01/10 DEN3 3,2 3,3 3,1 3,1 3,2 2,0 ___________DEN4_______3,3 3,4 3,4 3,4 3,3 2,8 DEN1 3,1 3,1 3,6 3,3 3,1 3,2 DEN2 3,2 3,2 3,3 3,3 3,2 3,0 02/10 DEN3 3,2 3,2 3,1 3,1 3,1 2,2 ___________DEN4_______3,2 3,2 3,4 3,4 3,2 2,2 DEN1 3,1 3,4 3,1 3,1 3,1 3,0 , DEN2 3,2 3,3 3,1 3,0 3,0 3,0 01/11 DEN3 3,2 3,1 3,1 3,1 3,0 2,4 DEN4________3,1 3,1 3,1 3,0 3,0 1,7 Referências [1] Bhatt S, Gething PW, Brady OJ, Messina JP, Farlow AW, Moyes CL et.al 2013. The global distribution and burden of dengue. Nature;496:504-507.

[2] Brady OJ, Gething PW, Bhatt S, Messina JP, Brownstein JS, Hoen AG et al . Refining the global spatial limits of dengue virus transmission by evidence-based consensus. PLoS Negl Trop Dis. 2012;6:el760. doi:10.1371/ j ournal.pntd.0001760.

[3] Ministério da Saúde Brazil. Boletim Epidemiológico. Monitoramento de casos de dengue. Vol . N° 11.2015 in htt//portalsaude.gov.br/index.php/s ituação.e [4] Ishikawa, T.; Yamanaka, A.; Konishi E. 2014. A review of successful flavivirus vaccines and the problems with those flaviviruses for which vaccines are not yet available. Vaccine. 32: 1326-1337.

[5] OMS (Organização Mundial da Saúde). Vacinas contra a dengue. No sitio "who.ínt/immunization/research/development/dengue_vaccines/ en/" [acessado em 30 de abril de 2015].

[6] Durbin AP, Karron RA, Sun W, Vaughn DW, Reynolds MJ, Perreault JR, Thumar B, Men R, Lai CJ, Elkins WR, Chanock RM, Murphy BR, Whitehead SS. Attenuation and immunogenicity in humans of a live dengue virus type-4 vaccine candidate with a 30 nucleotide deletion in its 3’ -untranslated region. AM. J. Trop. Med. Hyg. (2001) Nov 65(5):405-13.

[7] Whitehead SS, Falgout B, Hanley KA, Blaney Jr JE Jr, Markoff L, Murphy BR. A live, attenuated dengue virus type 1 vaccine candidate with a 30-nucleotide deletion in the 3' untranslated region is highly attenuated and immunogenic in monkeys. J. Virol. (2003) Jan 77(2): 1653-7.

[8] Wiggan 0'Neil, Livengood JA, Silengo SJ, Kinney RM , Osorio JE, Huang CYH, Stinchcomb DT. Novel formulations enhance the thermal stability of live-attenuated flavivirus vaccines. Vaccine 29 (2011) 7456- 7462.

[9] Burke CJ,Hsu T-A, Volkin DB. Formulation, Stability and Delivery of Live Attenuated Vaccines for Human Use. Criticai Review in Therapeutic Drug Carrier Systems (1999) 16(1):1-8 .

[0077] Tendo descrito certas modalidades da invenção, um técnico no assunto irá apreciar nas reivindicações anexas que muitas modificações e variações da presente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos anteriores. É, por conseguinte, para ser entendido que, dentro do escopo das reivindicações anexas e a divulgação aqui fornecidas, a invenção pode ser praticada de outro modo que não o especificamente descrito em certas modalidades.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Processo para a preparação de uma vacina tetravalente atenuada de dengue caracterizado pelo fato de que compreende: (i) amplificação de células Vero em cultura para produzir bancos mestre e trabalho de células Vero, em que as células Vero são adaptadas para crescimento em meio livre de soro, são cultivadas em meio livre de soro, e são sub-cultivadas com tripsina de origem não animal desta célula em Frascos de Cultura de Tecidos (TC) de 225 cm2 e depois em Cell Factory System™ (CFS); (ii) infecção de células Vero do banco mestre ou trabalho com virus da dengue sorotipos 1, 2, 3 e 4 a partir de um banco semente ou trabalho de cada um dos virus, em que as células Vero são infectadas de forma independente com virus da dengue sorotipos 1, 2, 3, e 4 em culturas separadas com meio livre de soro; (iii) incubação das células Vero infectadas com cada virus da dengue a 36,5°C (+ 1°C) durante 10 a 20 dias em frascos TC de 225 cm2 ou Cell Factory System™ (CFS) ; (iv) coleta dos sobrenadantes de cada cultura; (v) filtragem de cada suspensão de virus de dengue da etapa (iv) através de uma membrana com 0,2 pm de porosidade e armazenagem do virus da dengue filtrado a -80°C (± 5°C); (vi) preparação de volumes ("bulks") de virus da dengue sorotipos 1, 2, 3 e 4; (vii) formulação de vacinas monovalentes; (viii) formulação da vacina tetravalente através da mistura das vacinas monovalentes; (ix) envase da vacina tetravalente; (x) liofilização da vacina tetravalente nos frascos; (xi) vedação da vacina tetravalente liofilizada nos frascos; e (xii) armazenamento do produto liofilizado e selado a 2-8°C, preparando-se assim uma vacina tetravalente atenuada de dengue.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sobrenadante é coletado na etapa (iv), um volume igual de meio livre de soro é adicionado à cultura, e as etapas (iii) e (iv) são repetidas.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as etapas (iii) e (iv) são repetidas de cerca de uma a sete vezes.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as cepas de virus da dengue utilizadas são rDENlA30-1545 (SEQ ID NO: 1) ou variantes do mesmo; rDEN2/4Δ30(ΜΕ)-1495,7163 (SEQ ID NO:2) ou variantes do mesmo; rDEN3A30/31-7164 (SEQ ID N0:3) ou variantes do mesmo, e rDEN4A30-7132,7163,8308 (SEQ ID NO:4) ou variantes do mesmo.

5. Processo para a preparação de uma vacina tetravalente atenuada de dengue caracterizado pelo fato de que compreende: (i) amplificação de células Vero em cultura para produzir bancos mestres e trabalho de células Vero, em que as células Vero são adaptadas para crescimento em meio livre de soro, são cultivadas em meio livre de soro, e são sub-cultivadas com tripsina de origem não animal; (ii) infecção de células Vero do banco mestre ou banco trabalho com virus da dengue sorotipos 1, 2, 3 e 4 a partir de um banco semente ou trabalho de cada um dos virus, em que as células Vero são infectadas de forma independente com virus da dengue sorotipos 1, 2, 3, e 4 em culturas separadas com meio livre de soro; (iii) incubação das células Vero infectadas com cada virus da dengue a 36,5°C (± 1°C) durante 10 dias a 20 dias em um frasco de cultura de tecidos ou Cell Factory System™; (iv) coleta dos sobrenadantes de cada cultura; (v) filtragem de cada suspensão de virus da dengue da etapa (iv) através de uma membrana com 0,2 pm de porosidade e armazenagem do virus da dengue filtrado a -80°C (+ 5°C); (vi) preparação de volumes ("bulks") de virus da dengue sorotipos 1, 2, 3 e 4; (vii) formulação de vacinas monovalentes; e (viii) formulação da vacina tetravalente a partir da mistura das vacinas monovalentes.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a linhagem celular de células Vero utilizada é ATCC CCL-81.4.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o sobrenadante é coletado na etapa (iv), um volume igual de meio livre de soro é adicionado à cultura, e as etapas (iii) e (iv) são repetidas.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as etapas (iii) e (iv) são repetidas cerca de uma a sete vezes.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo fato de que as linhagens de virus de dengue utilizadas são rDENlA30-1545 (SEQ ID NO: 1) ou variantes do mesmo; rDEN2/4A30 (ME)- 1495,7163 (SEQ ID NO:2) ou variantes do mesmo; rDEN3A30/31-7164 (SEQ ID NO:3) ou variantes do mesmo, e rDEN4A30-7132,7163,8308 (SEQ ID NO:4) ou variantes do mesmo.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a multiplicidade de infecção (MOI) de linhagens de virus da dengue para cada sorotipo de dengue é: de 0,01 a 0,03 para DENV1 e DENV4, de 0,02 a 0,04 para DENV2, e de 0,05 a 0,08 para DENV3.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 5, caracterizado pelo fato de que as vacinas monovalentes são misturadas na mesma proporção de volume para se obter a vacina tetravalente de dengue 1, 2, 3 e 4 (atenuada).

12. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende as etapas de envase da vacina tetravalente; liofilização da vacina tetravalente nos frascos; selagem da vacina tetravalente liofilizada nos frascos; e o armazenamento do produto liofilizado e selado a 2-8°C.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 12, caracterizado pelo fato de que os parâmetros utilizados no processo de liofilização são: congelamento (de -30°C a -50°C), vácuo (de 20 pbar a 100 pbar), secagem primária de -30°C a -50°C (de 36 horas a 42 horas), e secagem secundária de -5°C a -10°C (de 18 horas a 24 horas) e de 25°C a 29°C (8 horas a 15 horas).

14 . Processo para a preparação de uma vacina tetravalente de dengue para administração a um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de reconstituição da vacina tetravalente liofilizada e selada de dengue, produzida pelo processo como definido na reivindicação 1 ou 12, em uma composição que compreende 0,2M de fosfato de sódio monobásico dihidratado, 0,2M de fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado, e água.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a vacina liofilizada e selada é reconstituída em 5 mL da composição.

16. Método para induzir uma resposta imune aos virus da dengue sorotipos 1, 2, 3 e 4 em um individuo caracterizado pelo fato de que compreende a administração da vacina produzida pelo processo como definido na reivindicação 1 ou 12 ao individuo.

17. Kit de vacina tetravalente de dengue caracterizado pelo fato de que compreende a vacina produzida pelo processo como definido na reivindicação 1 ou 12 e uma composição de reconstituição, que compreende 0,2M de fosfato de sódio di-hidrato monobásico, 0,2M de fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado, e água.

18. Uso de uma composição compreendendo 0,2M de fostato de sódio monobásico dehidratado, 0,2M de fosfato de sódio dibásico heptahidratado e água caracterizado pelo fato de ser para a reconstituição da vacina produzida pelo processo como definido na reivindicação 1 ou 12.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que é usado 5 mL para reconstituir a vacina seca.