TWI733694B - 製備減毒四價登革熱疫苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及製備減毒四價登革熱疫苗的方法及其製品。本發明亦涉及製備用於施用於受試者的四價登革熱疫苗的方法、涉及在一患者體內誘導對登革熱病毒血清型第1、2、3、4型之免疫反應的方法，以及涉及一種四價登革熱疫苗套組。

Description

製備減毒四價登革熱疫苗的方法 【併入序列表】
包含在本文件中名為「60135_146578_ST25.txt」的序列表，其為56,450個位元組(於操作系統MS-Windows中測量)，建於2015年8月31日，在此通過電子方式提交申請並透過參考其全文的方式併入本文。
本發明屬於生物技術領域。本發明是指一種製備減毒四價登革熱疫苗的方法。本發明還涉及一種減毒四價登革熱疫苗。本發明亦涉及用於重構該疫苗之組合物的用途。本發明還涉及在患者體內誘導對血清型第1、2、3和4型之免疫反應的方法。本發明亦涉及一種四價登革熱疫苗套組。
目前，登革熱在巴西是一種對公眾健康產生重大影響的疾病。它影響了居住在流行地區一半的世界人口，主要在東南亞地區(亞太地區)以及美洲。根據世界衛生組織，在最近的一項研究中，據估計每年有大約3.9億個登革熱感染的案例(95%可信區間為2.84~5.28億)，其中9600萬(6700萬~1.36億)顯示出臨床症狀(具疾病的不同嚴重程度)[1]。在有關於登革熱流行的另一項研究中，估計在128個國家中有39億人，是處在感染登革熱病毒的危險之中[2]。
在巴西，2000年時的登革熱發病案例為200,000例，而2010年則有100萬個案例。截至2015年三月為止，在巴西共有460,502個通報案例。相較於巴西整個國家，東南部具有最高數量的通報案例(304,251件，66.1%)，其次是中西部(59,855件；13%)、東北部(51,221件；11.1%)、北部(19,402件；4.2%)以及南部(25,773件，5.6%)[3]。
透過感染DEN1、DEN2、DEN3和DEN4中任何登革熱血清型，可造成登革熱(dengue fever，DF)和它的嚴重形式，登革出血熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)/登革熱休克症候群(dengue shock syndrome，DSS)。
由於目前還沒有該治療該疾病的抗病毒藥物，且病媒蚊(埃及斑蚊，Aedes aegypti)的控制策略已被證明無效，控制登革熱發展的唯一途徑是透過使用對抗該四型登革熱病毒的疫苗來預防。目前，尚無登革熱疫苗被授權可用於人類。流行病學研究顯示，首次感染一種登革熱血清型通常導致登革熱(DF)，且二次感染引起登革出血熱的機率比首次感染者高出15-80倍。因此，一種有效的登革熱疫苗必須由登革熱病毒的4種血清型所組成[4]。然而，四價登革熱疫苗的開發是非常困難的，因為這種產品必須提供對所有登革熱病毒血清型的長期保護[5]。
專利申請號US 13/305,639，為專利申請號12/398,043的連續案，專利申請號12/398,043係於2009年3月4日提出申請，現為專利號8,075,903，其係為專利申請號10/970,640的連續案，專利申請號10/970,640係於2004年10月21日提出申請，現為專利號7,517,531，其係為PCT申請案PCT/US03/13279的連續案，PCT申請案PCT/US03/13279係於2003年4月25日由衛生與公眾服務部部長所代表之美國政府提出申請，題目為「在登革熱 病毒第1、2、3和4型的3’-非編碼區(3’-UTR)內含有共同的30個核苷酸缺失的登革熱四價病毒，或抗原嵌合登革熱病毒第1、2、3和4型」。上述該專利是指從一個自包括帶有30個核苷酸缺失或抗原嵌合登革熱病毒的四種登革熱病毒血清型的混合物所獲得的產物。
美國專利申請號US 11/982,488，於2007年11月2日提出申請，於2012年5月31日公開，並於2012年8月14日授權，來自Monika Simmons等人，題目為「以初次免疫-加強免疫的方法誘導對登革熱病毒的免疫反應」，描述了誘導對登革熱病毒免疫反應的方法。該對誘導登革熱病毒免疫反應的方法包含施用一非複製的免疫原，接著以一四價減毒活病毒疫苗加強免疫。另一個方面是使用異源的初次免疫-加強免疫方式誘導對登革熱病毒免疫反應的方法，使用的初次免疫原包含DNA表現系統、腺病毒表現載體或委內瑞拉馬腦炎病毒複製子系統，且該加強免疫原包含除了該DNA表現系統以外之其他免疫原。每個表現系統包含編碼登革熱病毒蛋白質的DNA序列。上述專利描述了一種登革熱疫苗的免疫方案。在這個方案中，第一次免疫使用非複製免疫原，然後是一種四價減毒活病毒登革熱疫苗。本專利申請的目的是一種獲得減毒活病毒登革熱疫苗的方法。
本發明教導了一種抗四種血清型登革熱病毒的疫苗的開發，其使用減毒病毒株rDEN1△30-1545(SEQ ID NO：1)及其變異體；rDEN2/4△30(ME)-1495,7163(SEQ ID NO：2)及其變異體；rDEN3△30/31-7164(SEQ ID NO：3)及其變異體；以及rDEN4△30-7132,7163,8308(SEQ ID NO：4)及其變異體。在美國專利號7,517,531、7,226,602以及8,337,860中描述了某些rDEN1△30、rDEN2/4△30、 rDEN3△30，以及rDEN4△30重組減毒登革熱病毒，其通過引用方式將其整體併入本文。
本發明的疫苗，稱為登革熱疫苗1、2、3、4(減毒)，係以凍乾形式以10劑量儲存在小瓶中。這種疫苗的開發中，建立了以下流程：生產Vero細胞和登革熱病毒血清型第1、2、3和4型，以獲得細胞庫及病毒庫；以來自這些細胞庫及病毒庫的細胞及病毒生產病毒懸浮液；濃縮這些懸浮液並且製備批量；配製單價及四價疫苗；充填；凍乾並密封該產品。
可以看出沒有現有技術文獻公開或建議一種可大規模生產登革熱疫苗的製備減毒四價登革熱疫苗的方法。
為了解決上述問題，本發明將提供比現有方法顯著更優良的製備四價登革熱疫苗的方法。首先，本發明的某些具體實施例使用較低代數(123代)的Vero細胞株，這可使該細胞株大量的繼代培養，亦即，具有高產率。此外，主Vero細胞庫(Master Vero cell banks)及工作Vero細胞庫(Working Vero cell banks)係以在無血清培養基中維持之細胞製備而成，以非動物來源的胰蛋白酶繼代，以及以5% DMSO穩定細胞。使用無血清培養基導致較高的再現性，更不用說在維持和增殖Vero細胞的繼代培養中使用非動物來源的胰蛋白酶，使得該方法較為安全且使得最終產物免於受到豬環狀病毒污染的可能。此外，Vero細胞可以在225cm2 TC-flasks(組織培養瓶)中或NuncTM公司的細胞工廠系統TM(NuncTM Cell Factory SystemTM，CFS)中生長，使用10-層盤(Thermo Fisher Scientific公司，匹茲堡，賓夕法尼亞州，美國；約6,320cm2的培養面積)，這會使得細胞/組織培養瓶的產率高達約 2x109cells/CFS。在Vero細胞中從工作病毒種庫(Working Virus Seed banks)中製備的登革熱病毒的額外複製，增加了該方法的生產率。以CFS培養一生產循環的病毒懸浮液的最終體積為14公升(高容量)。在本發明的某些具體實施例中，該病毒單一生產週期最多可以收穫約七次。藉由從培養物中移除含有病毒的培養基、以新鮮培養基置換該移除的培養基、以該新鮮的培養基培養將該感染的細胞以及收穫培養後含有病毒的該培養基，以自該受感染的細胞收穫登革熱病毒懸浮液，這也增加了本文所提供的方法的生產率。藉由研究在組織培養瓶(TC-flasks)以及細胞工廠系統TM(Cell Factory SystemTM)中以Vero細胞培養的登革熱病毒血清型第1、2、3和4型的複製曲線，本發明還教示了收穫該病毒懸浮液的上清液的最佳時間，這可以增加收穫的次數。在某些具體實施例中，本發明的四價疫苗係以包含依各種血清型而異的不同登革熱病毒力價(DENV1、DENV2、DENV3，以及DENV4分別為5.7±0.2、5.6±0.2、6.1±0.2以及5.8±0.2 Log10 PFU/ml)的單價疫苗所製備，這使得在該四價疫苗中各種血清型的病毒顆粒具有較高的同質性。最後，所請方法的填充及凍乾步驟使疫苗能在2~8℃穩定保存1年。
總之，用於製備本申請的減毒四價登革熱疫苗的方法呈現高產率且再現性高。為所述方法的產物的該疫苗，是高度穩定且無通常用於製造疫苗的動物來源(血清和胰蛋白酶)的污染。該特徵允許可以大規模生產登革熱疫苗。此外，本發明的登革熱疫苗自2013年11月起，已在巴西進行人體試驗(第II期臨床試驗)。這項研究的初步數據顯示，該產品是安全且具有免疫原性的。
於一方面，本發明涉及製備減毒四價登革熱疫苗的方法，其 特徵在於，它包含任何以下步驟的部份或全部：使Vero細胞適應在無血清培養基中生長，並使用非動物來源的胰蛋白酶以獲得細胞的繼代培養；在225cm2的組織培養瓶，以及隨後在細胞工廠系統TM(CFS)中增殖Vero細胞；生產Vero細胞主細胞庫(Master Cell Bank，MCB)和工作細胞庫(Working Cell Bank，WCB)以及登革熱病毒血清型第1、2、3和4型的病毒種庫和工作病毒種庫；在225cm2組織培養瓶或CFS中將來自工作細胞庫的Vero細胞感染來自工作病毒種庫的登革熱病毒血清型第1、2、3和4型；將含有該Vero細胞/登革熱病毒懸浮液的組織培養瓶或細胞工廠系統TM置於36.5℃(±1℃)下培養10至20天；收穫上清液、過濾(膜的孔隙度為0.2μm)，並儲存於-80℃(±5℃)；製備登革熱病毒血清型第1、2、3和4型的病毒原液；以這些病毒原液配製單價疫苗；以四種單價疫苗配製四價疫苗；充填；冷凍乾燥；密封；貼標籤並將產品儲存於2-8℃。
在某些具體實施例中使用的Vero細胞株是ATCC CCL-81.4(cGMPVero，非洲綠猴(Cercopithecus aeothiops)腎細胞)。在進一步的具體實施例中使用的登革熱病毒株為來自美國國家衛生研究院(National Institutes of Health，NIH)的rDEN1△30-1545；rDEN2/4△30(ME)-1495,7163；rDEN3△30/31-7164和rDEN4△30-7132,7163,8308。在進一步的具體實施例中，每種登革熱血清型的登革熱病毒株的MOI可以大約為：DENV 1和4為0.01至0.03，DENV 2為0.02至0.04，以及DENV 3為0.05至0.08。在進一步的具體實施例中，該單價疫苗以相同的體積比例混合，以獲得四價登革熱疫苗血清型第1、2、3、4型(減毒)。在進一步的具體實施例中，該冷凍乾燥(凍乾)步驟的參數為：冷凍(-30至-50℃)，真空度(20至100μbar)，初次乾燥在-30 至-50℃(36至42小時)以及-5至-10℃(18至24小時)，二次乾燥在25至29℃(8至15小時)。
於另一方面，本發明涉及由如上所述的方法製備的減毒四價登革熱疫苗。
於另一方面，本發明涉及包含將含有0.2M磷酸二氫鈉二水合物(sodium phosphate monobasic dihydrate)、0.2M磷酸氫二鈉七水合物(sodium phosphate dibasic heptahydrate)以及WFI水(即，注射用水)的組合物用於重構該由上述方法製得的疫苗的用途。在一具體實施例中，使用5mL的該組合物以重構該乾燥的疫苗。
於另一方面，本發明涉及在一受試者體內誘導對登革熱病毒血清型第1、2、3、4型免疫反應的方法，透過施予如上所述的該疫苗至該受試者來達成。在某些具體實施例中，該受試者為人類。
於另一方面，本發明涉及一種四價登革熱疫苗套組，其包含如上所述的該凍乾的四價疫苗、一包含0.2M磷酸二氫鈉二水合物、0.2M磷酸氫二鈉七水合物以及WFI水的重構組合物。
在某些具體實施例中，提供一種製備減毒四價登革熱疫苗的方法，包含：(i)將Vero細胞在培養基中增殖以產生Vero細胞的主細胞庫及工作細胞庫，其中該Vero細胞適於在無血清培養基中生長，且生長於無血清培養基中，並以非動物來源的胰蛋白酶在225cm2組織培養(TC)瓶中繼代培養該細胞，並於之後在一細胞工廠系統TM(CFS)中繼代培養；(ii)將來自主細胞庫或工作細胞庫的Vero細胞感染來自各病毒的病毒種庫或工作病毒庫的登革熱病毒血清型第1、2、3、4型，其中該Vero細胞在分隔的無血清培養基中 獨立地各自感染登革熱病毒血清型第1、2、3、4型；(iii)將含有各自感染一種登革熱病毒的Vero細胞的225cm2組織培養(TC)瓶或細胞工廠系統TM(CFS)於36.5℃(±1℃)下培養10到20天；(iv)收穫各培養物的上清液；(v)將來自步驟(iv)的各種登革熱病毒懸浮液以通過0.2μm孔隙的膜進行過濾，並將該過濾過的登革熱病毒儲存於-80℃(±5℃)；(vi)製備登革熱病毒血清型第1、2、3、4型的病毒原液；(vii)配製單價疫苗；(viii)透過混合該單價疫苗以配製四價疫苗；(ix)將該四價疫苗充填至小瓶中；(x)將該小瓶中的四價疫苗進行冷凍乾燥；(xi)將在小瓶中冷凍乾燥的四價疫苗密封；以及(xii)將冷凍乾燥且密封的產品儲存於2-8℃，從而製備減毒四價登革熱疫苗。
在某些具體實施例中，提供一種製備減毒四價登革熱疫苗的方法，包含：(i)將Vero細胞在培養基中增殖以產生Vero細胞的主細胞庫及工作細胞庫，其中該Vero細胞適於在無血清培養基中生長，且生長於無血清培養基中，並以非動物來源的胰蛋白酶繼代培養該細胞；(ii)將來自主細胞庫或工作細胞庫的Vero細胞感染來自各病毒的病毒種庫或工作病毒庫的登革熱病毒血清型第1、2、3、4型，其中該Vero細胞在分隔的無血清培養基中獨立地各自感染登革熱病毒血清型第1、2、3、4型；(iii)將各自感染一種登革熱病毒的Vero細胞在一組織培養瓶或細胞工廠系統TM中於36.5℃(±1℃)下培養10到20天；(iv)收穫各培養物的上清液；(v)將來自步驟(iv)的各種登革熱病毒懸浮液以通過0.2μm孔隙的膜進行過濾，並將該過濾過的登革熱病毒儲存於-80℃(±5℃)；(vi)製備登革熱病毒血清型第1、2、3、4型的病毒原液；(vii)配製單價疫苗；以及(viii)透過混合該單價疫苗以配製四價疫苗。
在某些具體實施例中，由上述任何提供的方法生產減毒四價 登革熱疫苗。
在某些具體實施例中，提供一種製備用於施用於受試者的四價登革熱疫苗的方法，其包含將由任何上述的方法生產的密封且冷凍乾燥的四價登革熱疫苗在含有0.2M磷酸二氫鈉二水合物、0.2M磷酸氫二鈉七水合物以及水的組合物中重構的步驟。
還提供了在一受試者體內誘導對登革熱病毒血清型第1、2、3、4型免疫反應的方法，其包含施予上述疫苗至該受試者。
也提供了四價登革熱疫苗套組，其包含上述疫苗、一包含0.2M磷酸二氫鈉二水合物、0.2M磷酸氫二鈉七水合物以及水的重構組合物。
在任何上述製程、疫苗、方法或套組的某些具體實施例中，所使用的登革熱病毒株是rDEN1△30-1545(SEQ ID NO：1)或其變異體；rDEN2/4△30(ME)-1495,7163(SEQ ID NO：2)或其變異體；rDEN3△30/31-7164(SEQ ID NO：3)或其變異體，以及rDEN4△30-7132,7163,8308(SEQ ID NO：4)或其變異體。
本發明的目的及其進一步的優點，可以通過參考附圖和下面的描述而更好地理解：第一圖為本發明的摘要，描述製備減毒四價登革熱疫苗的方法中的所有步驟。
雖然本發明可有不同的具體實施例，某些具體實施例在附圖和下面的詳細討論中被示出，應當理解的是，本發明內容可以被認為是對 本發明的原理的範例，而且並非用於將發明的範圍限制於在本說明書中所示出並揭露的部分。
一種製備減毒四價登革熱疫苗的方法
在第一具體實施例中，本發明是指一種製備減毒四價登革熱疫苗的方法，包含以下步驟的任意部份或全部：使Vero細胞適應在無血清培養基中生長，以及適應非動物來源的胰蛋白酶；在225cm2的組織培養瓶，以及隨後在細胞工廠系統TM(CFS)中在培養基中增殖Vero細胞；生產Vero細胞主細胞庫和工作細胞庫以及登革熱病毒血清型第1、2、3和4型的病毒種庫和工作病毒庫；在225cm2組織培養瓶或CFS中將Vero細胞感染來自病毒庫的登革熱病毒血清型第1、2、3和4型；將含有該Vero細胞/病毒懸浮液的225cm2組織培養瓶或CFS置於36.5℃(±1℃)下培養10至20天；收穫這些培養物的上清液、在孔隙度為0.2μm的膜內過濾這些登革熱病毒懸浮液，並儲存於-80℃(±5℃)；製備登革熱病毒血清型第1、2、3和4型的病毒原液；以這些病毒原液配製單價疫苗；混合該單價疫苗以配製四價疫苗；充填；冷凍乾燥；密封及將產品儲存於2-8℃。在進一步的具體實施例中，使用的Vero細胞株是ATCC CCL-81.4(cGMPVero，非洲綠猴(Cercopithecus aeothiops)腎細胞，可從美國維吉尼亞州馬納薩斯之ATCC得到)。在進一步的具體實施例中，使用的登革熱病毒株是rDEN1△30-1545(SEQ ID NO：1)或其變異體；rDEN2/4△30(ME)-1495,7163(SEQ ID NO：2)或其變異體；rDEN3△30/31-7164(SEQ ID NO：3)或其變異體，以及rDEN4△30-7132,7163,8308(SEQ ID NO：4)或其變異體。可以使用的上述登革熱病毒株的變異體包括但不限於：(1)rDEN1△30-1545(SEQ ID NO：1)的變異體有一基因組，具有至少橫跨SEQ ID NO：1整個長度95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列相似度，而且具有上述比例的序列相似度的變異體，其編碼至少與SEQ ID NO：1所編碼的病毒多聚蛋白具有95%、96%、97%、98%、99%，或100%序列相似度的病毒多聚蛋白；(2)rDEN2/4△30(ME)-1495,7163(SEQ ID NO：2)的變異體有一基因組，具有至少橫跨SEQ ID NO：2整個長度95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列相似度，而且具有上述比例的序列相似度的變異體，其編碼至少與SEQ ID NO：2所編碼的病毒多聚蛋白具有95%、96%、97%、98%、99%，或100%序列相似度的病毒多聚蛋白；(3)rDEN3△30/31-7164(SEQ ID NO：3)的變異體有一基因組，具有至少橫跨SEQ ID NO：3整個長度95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列相似度，而且具有上述比例的序列相似度的變異體，其編碼至少與SEQ ID NO：3所編碼的病毒多聚蛋白具有95%、96%、97%、98%、99%，或100%序列相似度的病毒多聚蛋白；(4)rDEN4△30-7132,7163,8308(SEQ ID NO：4)的變異體有一基因組，具有至少橫跨SEQ ID NO：3整個長度95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列相似度，而且具有上述比例的序列相似度的變異體，其編碼至少與SEQ ID NO：4所編碼的病毒多聚蛋白具有95%、96%、97%、98%、99%，或100%序列相似度的病毒多聚蛋白。
rDEN1△30(GenBank登錄號：AY145123)是透過刪除在3’-非編碼區(3’-UTR)內的30個核苷酸的方式而衍生自DEN1西太平洋(Western Pacific，WP)野生型病毒株的減毒活病毒。本文所用的該rDEN1△30-1545病毒株(SEQ ID NO：1)在該病毒多聚蛋白的胺基酸殘基第484號上編碼單一離胺酸→精胺酸的突變(A1545G突變)。
針對DEN2病毒的發展，以DEN2的ME區域置換為rDEN4△30的相應基因以創造該候選疫苗rDEN2/4△30(ME)。本文所用的該rDEN2/4△30(ME)-1495,7163病毒株(SEQ ID NO：2)在該病毒多聚蛋白的胺基酸殘基第186號上編碼絲胺酸→苯丙胺酸的突變(C1495T突變)，以及在胺基酸殘基第112號上編碼白胺酸→苯丙胺酸的突變(A7163C突變)。
rDEN3△30/31是從rDEN3△30病毒株衍生而來的減毒活病毒。一開始構建DEN3 Sleman/78病毒株的完整cDNA複製，在3’-非編碼區(3’-UTR)內創造出30個核苷酸的缺失(△30)。如從所得的rDEN3△30病毒，在3’-非編碼區(3’-UTR)內創造約31個核苷酸的額外缺失[2]。因此，rDEN3△30/31包括原始的△30缺失和一個不連續的31個核苷酸的缺失，其去除了兩個原始的TL-2和TL-3的結構。本文所用的所得之rDEN3△30/31-7164病毒株(SEQ ID NO：3)在該病毒多聚蛋白的胺基酸殘基第115號上編碼纈胺酸→丙胺酸的突變(T7164C突變)。
rDEN4△30是使用重組DNA技術自野生型病毒株DEN4 Dominica/81衍生而來的減毒活病毒。在3’-非編碼區(3’-UTR)的二級結構內被認定為TL2的一莖-環結構，先前透過從DEN4基因組中刪除30個核苷酸而移除(3’d 172-143)，且隨後被定為△30突變。本文所用的該rDEN4△30-7132,7163,8308病毒株(SEQ ID NO：4)在該病毒多聚蛋白的胺基酸殘基第102號上編碼蘇胺酸→異白胺酸的突變(C7132T突變)，在胺基酸殘基第112號上編碼白胺酸→苯丙胺酸的突變(A7163C突變)，以及在胺基酸殘基第249號上編碼離胺酸→精胺酸的突變(A8308G突變)。
在進一步的具體實施例中，各種登革熱病毒血清型的登革熱 病毒株的病毒感染倍數(MOI)係分別為：登革熱病毒血清型第1型及第4型(DENV 1及4)為0.01至0.03，登革熱病毒血清型第2型為0.02至0.04，登革熱病毒血清型第3型為0.05至0.08。在進一步的具體實施例中，該單價疫苗係以等體積比例混合，以得到該四價登革熱疫苗血清型第1、2、3、4型(減毒)。在進一步的具體實施例中，用於該冷凍乾燥步驟的參數為：冷凍(-30至-50℃)，真空度(20至100μbar)，乾燥在-30至-50℃(36至40小時)、-5至-10℃(18至24小時)及25至29℃(8至15小時)。在某些具體實施例中，用於使Vero細胞適應無血清培養基的代數為第123代；該工作細胞庫以第134代建立；且，製備登革熱病毒方法中使用的Vero細胞代數為第138至149代。
在某些具體實施例中，在步驟(vii)配製單價疫苗之前使用穩定劑。適合本發明的某些具體實施例的穩定劑包括，但不限於，海藻糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、ASO4(一種穩定劑系統，包括穩定的氫氧化鋁和單磷醯脂質A的混合物)、人類血清白蛋白(human serum albumin，HSA)、Pluronic®嵌段共聚物F127、F68(BASF)、P85(BASF)和P123(BASF)、多醣幾丁聚醣，和重組HSA(recombinant ASA，rHSA)[8,9]。
減毒四價登革熱疫苗
在另一個具體實施例中，本發明涉及由如上所述的方法生產的減毒四價登革熱疫苗。
使用組合物以重構該乾燥的疫苗
在另一具體實施例中，利用含有0.2M磷酸二氫鈉二水合物、0.2M磷酸氫二鈉七水合物以及WFI水的組合物重構上述的疫苗。在進一步的具體實施例中，利用5毫升的該組合物重構該乾燥的疫苗。
一種在一患者體內誘導對登革熱病毒血清型第1、2、3、4型免疫反應的方法
在另一具體實施例中，本發明是指一種在一受試者體內誘導對登革熱病毒血清型第1、2、3、4型免疫反應的方法，係透過施予上述疫苗至該受試者來達成。
為了防止登革熱感染的預防性治療，其用意是，本發明的疫苗可以在一個體暴露於登革熱病毒血清型第1-4型之前施予該個體，以及所得之免疫反應可以抑制或減少登革熱病毒感染的嚴重性。
一種四價登革熱疫苗套組
在另一具體實施例中，本發明涉及一種四價登革熱疫苗套組，包含上述疫苗、一包含0.2M磷酸二氫鈉二水合物、0.2M磷酸氫二鈉七水合物以及WFI水的重構組合物。
實施例 實施例1 製備方法的描述
製備登革熱疫苗1、2、3、4(減毒)的方法，包含以下步驟：
步驟1. 製備在疫苗生產的過程中使用的培養基和溶液
用於維持Vero細胞、製備原液和疫苗製劑的無血清培養基的製備如下：VP-SFM AGT或AGT OptiPRO®(GIBCO公司)無血清培養基：裝於燒瓶的粉狀培養基以WFI水稀釋，並加入L-谷胺醯胺(L-Glutamine)，使其於培養基中的最終濃度為200mM。將培養基以0.2μm的膜過濾、滅菌，取樣以測量pH值及進行無菌測試。
Leibovitz(L-15)無酚紅培養基：裝於燒瓶的粉狀培養基以WFI水稀釋。然後，將培養基以0.2μm的膜過濾。取樣以進行無菌測試、測量細菌內毒素、pH值以及外觀測試。
過濾後的培養基裝在聚碳酸酯瓶中，並儲存於2-8℃下。
帶有0.02M磷酸鹽的緩衝鹽水溶液由氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，和注射用水組成。在增殖細胞的過程中以及在登革熱病毒懸浮液濃縮時，使用該溶液清洗培養物。
步驟2. Vero細胞主細胞庫及工作細胞庫的製備
使Vero細胞株ATCC CCL-81.4(如cGMPVero，非洲綠猴(Cercopithecus aeothiops)腎細胞第123代，批號7388125)適應無血清培養基以及非動物來源的胰蛋白酶以獲得該Vero細胞庫。在225cm2組織培養瓶中以無血清培養基(VP-SFM AGT®-GIBCO公司)以及重組胰蛋白酶(TrypLE Select®-Gibco公司)連續繼代培養該細胞以進行適應化。原本只生長在有血清培養基的該細胞在進行無血清培養基適應化之後，生長於無血清培養基中的培養物被用來製備該細胞庫。
在主細胞庫及工作細胞庫的製備中，適應的Vero細胞生長於組織培養瓶中至90-100%覆蓋率後，以胰蛋白酶將細胞從組織培養瓶壁上分離，懸浮於OptiPRO AGT培養基中(Gibco公司)，離心且將沈澱物以含有5%DMSO的相同培養基重新懸浮。該細胞懸浮液在冷凍管內均勻化和分散至濃度為4至10x106細胞/ml。冷凍管被置於-80℃(±5℃)的凍箱中48小時，之後儲存於液態氮中。取樣並透過下列品質控制測試進行細胞庫認證：無菌性、核型分析、細胞辨識、細胞及動物內的外來病源、血球吸附病毒和黴 漿菌。
步驟3. 作為生產登革熱病毒的細胞基質的Vero細胞的增殖
細胞增殖的方法包括，在37℃(±1℃)水浴中解凍一隻含有來自原始細胞(ATCC-CCL81.4)或來自主細胞庫或工作細胞庫的Vero細胞的冷凍管。解凍後，將Vero細胞的懸浮液置於帶有無血清培養基的組織培養瓶內，並於36.5℃(±1℃)下培養，直到單層細胞的覆蓋率達該組織培養瓶培養面積的90至100%。將該培養瓶移出該培養箱，且該細胞進行新的繼代培養。在此過程中，以帶有0.02M磷酸鹽的緩衝鹽水溶液清洗該細胞單層，並以重組胰蛋白酶(Tryple Select®-GIBCO公司)使細胞分離，不再貼附於培養瓶上。該細胞懸浮於無血清培養基中，並分到含有相同培養基的組織培養瓶中。該組織培養瓶再次置於36.5℃(±1℃)下培養，直至達到90至100%的覆蓋率，然後進一步進行繼代培養。細胞的增殖一開始在225cm2組織培養瓶中進行，之後以帶有10層盤的細胞工廠系統TM(CFS)進行。
步驟4. 工作登革熱病毒庫DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的製備
將置於具有225cm2培養面積的組織培養瓶的增殖的Vero細胞分別感染登革熱病毒株rDEN1△30-1545(SEQ ID NO：1)；rDEN2/4△30(ME)-1495,7163(SEQ ID NO：2)；rDEN3△30/31-7164(SEQ ID NO：3)；以及rDEN4△30-7132,7163,8308(SEQ ID NO：4)。各種血清型所用的MOI(病毒感染倍數)不同：登革熱病毒血清型第1型及第4型(DENV 1及4)為0.01至0.03，登革熱病毒血清型第2型為0.02至0.04，登革熱病毒血清型第3型為0.05至0.08。感染後的培養物置於36.5℃(±1℃)下培養。培養8天後，分 別收穫感染DEN1△30、DEN2/4△30(ME)-1495,7163、DEN3△30/31-7164及DEN4△30-7132,7163,8308的培養物的上清液，通過滅菌膜過濾，並儲存於-80℃(±5℃)的冷凍箱內。置換培養瓶內的培養基，且將該培養瓶再度置於36.5℃(±1℃)下培養。該步驟連續重複三天以在最終產生四個上清液的樣本。針對感染DEN3的培養物，該程序在培養後第10天開始。取樣每次收穫的培養物的上清液，以進行無菌性及病毒力價測試。
在工作庫的製備中，將通過無菌性試驗，且具有高於105.0PFU/ml病毒力價之收穫的培養物混合、分配至2至4mL的冷凍管中，並存放於液態氮中。在通過以下測試後使用該工作庫：病毒辨識、無菌性、力價、在細胞及動物中的外來病源、血球吸附病毒及黴漿菌。
步驟5. 為登革熱疫苗製劑而生產登革熱病毒血清型第1、2、3和4型
增殖後，由增殖過程獲得的包含在組織培養瓶或細胞工廠系統TM的Vero細胞，如在步驟3中所述，以胰蛋白酶作用並懸浮於無血清培養基(OptiPRO® AGT-GIBCO公司)中。將獲得的Vero細胞懸浮液接種登革熱病毒株rDEN1△30-1545、rDEN2/4△30(ME)-1,495.7163、rDEN3△30/31-7164以及rDEN4△30-7132,7163,8308，這些病毒係來自於製備登革熱疫苗之方法的步驟4中所製備的登革熱病毒庫。各種血清型接種的病毒感染倍數(multiplicity-of-infection，MOI)不同：登革熱病毒血清型第1型及第4型(DENV 1及4)為0.01至0.03，登革熱病毒血清型第2型為0.02至0.04，登革熱病毒血清型第3型為0.05至0.08。接種後，將病毒/細胞懸浮液在32℃(±1℃)下攪拌30至60分鐘，然後分配於225cm2組織培養瓶或帶有10層盤的CFS 中。將無血清培養基加入培養物中直到其體積在組織培養瓶中達100到150mL，以及在CFS中達1,200至1,800ml。針對具有不同層盤數的CFS，以三的倍數計算要加入的培養基體積。該培養物在36.5℃(±1℃)中培養。在培養的第8或第10天，移除50%至60%的培養基，並加入相同體積的無血清培養基至該培養物中。該培養物再次於36.5℃(±1℃)中培養。從接種登革熱病毒後第10至第20天起收穫感染的Vero細胞培養物的上清液。
收穫的過程包括移除感染的組織培養瓶或CFS培養物的上清液，混合收集的上清液，滅菌過濾該混合物，將過濾過的登革熱病毒懸浮液分佈於聚丙烯/聚碳酸酯瓶中，並儲存於-80℃(±5℃)的冷凍箱中。取樣進行無菌性和病毒力價測試。在通過測試後，帶有登革熱病毒懸浮液的培養瓶從凍箱中取出，並進行濃縮步驟。
解凍該收穫的登革熱病毒懸浮液，並使用Pellicon®系統(Millipore公司)以及孔徑30至50kDa的膜進行切向過濾濃縮的程序。取樣進行控制品質測試：病毒力價及無菌度。將病毒濃縮物(C1)分別命名為rDEN1△30-1545、rDEN2/4△30(ME)-1495,7163、rDEN3△30/31-7164，或rDEN4△30-7132,7163,8308並儲存於-80℃(±5℃)。
步驟6. 登革熱病毒原液的製備
將登革熱病毒濃縮液C1(rDEN1△30-1545、rDEN2/4△30(ME)-1495,7163、rDEN3△30/31-7164，或rDEN4△30-7132,7163,8308)從-80℃(±5℃)的冷凍庫中移出、解凍並進行以下程序：該病毒濃縮物以不帶有酚紅的Leibovitz培養基稀釋，且所用的稀釋因子是其初始體積的5到10倍。該稀釋的濃縮物以切向過濾(Pellicon系統)再 次濃縮，濃縮至其初始體積的2.5至3倍體積。此濃縮物稱為C2。
將濃縮的C2以孔徑為0.2μm的濾膜過濾，分佈於管/燒瓶內並儲存在-80℃(±5℃)的冰箱中。取樣以進行質量控制測試(無菌性以及細菌內毒素、黴漿菌、細胞中的外來病源、血球吸附病毒、辨識性，以及病毒力價)。在通過質量控制測試後，該原液被釋出以配製為單價疫苗。
在2013年和2014年生產的登革熱病毒原液批次在表1中。
Figure 105129098-A0202-12-0019-1
 註：內毒素值在50UE/mL以下被認為是令人滿意的，因為最終產品的內毒素必須小於或等於10UE/mL。
步驟7. 單價疫苗rDEN1△30-1545、rDEN2/4△30(ME)-1495,7163、rDEN3△30/31-7164，以及rDEN4△30-7132,7163,8308以及登革熱疫苗血清型第1、2、3、4型(減毒)的配製
配製四種登革熱單價疫苗，每個血清型的登革熱病毒配製一個(rDEN1△30-1545、rDEN2/4△30(ME)-1495,7163、rDEN3△30/31-7164，以及rDEN4△30-7132,7163,8308)。計算製劑以確定稀釋因子，使得所提供的根據每種血清型的單價疫苗為以下含量：DENV1、DENV2、DENV3，以及DENV4分別為5.7±0.2、5.6±0.2、6.1±0.2以及5.8±0.2 Log10PFU/ml。
用來確定稀釋因子的公式為：原液力價(Log10 PFU/ml)的逆對數除以各血清型單價疫苗的期望病毒力價的逆對數。rDEN1△30-1545、rDEN2/4△30(ME)-1495,7163、rDEN3△30/31-7164，以及rDEN4△30-7132,7163,8308單價疫苗的配方以不帶酚紅的Leibovitz(L-15)培養基配製濃縮二次，亦即，該培養基維持其二倍濃縮的原始組合物。
為了配製登革熱疫苗血清型第1、2、3、4型(減毒)，以相同比例的體積混合該血清型第1、2、3、4型單價疫苗。將該配置的四價疫苗均質化之後，對該產品進行過濾(以孔徑為0.2μm的膜進行)，且取樣以進行以下質量控制測試：無菌性、細菌內毒素、病毒力價、pH值，以及產品外觀。
步驟8. 填充、凍乾和密封該四價登革熱疫苗
四價登革熱疫苗配製後，該產物被用來填充3ml的疫苗到小瓶中。將填充小瓶的樣品進行質量控制測試(無菌性、細菌內毒素、病毒力價、外觀和pH值)。
在小瓶填充之後將它們傳送到凍乾機並開始冷凍乾燥過程。在此一過程中，建立以下參數：冷凍(-30至-50℃)、真空度(20至100μbar)、在-30至-50℃(36至40小時)、-5至-10℃(18至24小時)，及25至29℃(8至15小時)進行乾燥。
在冷凍乾燥過程結束時，帶有凍乾疫苗的小瓶接著進行密封處理。最終產品，登革熱疫苗1、2、3、4(減毒)，被儲存於2-8℃。將疫苗批次的樣品進行無菌性、細菌內毒素、病毒力價、以稀釋液重構前後的產品外觀、pH值、DNA殘留及殘留水分測試。
當遵循巴西疫苗定名規則時，該產品可被命名為登革熱疫苗血清型第1、2、3、4型(減毒)。
該產品可以用5.0mL的針對此疫苗的特定稀釋劑(磷酸鈉的混合物)進行重構，其對應於10劑量/0.5毫升/小瓶。每劑含有102.7至103.7PFU/劑量的用於配製登革熱疫苗第1、2、3、4型(減毒)的各種登革熱病毒。品質控制測試的結果是由六批在2014年生產的疫苗而來，如表2所示。
Figure 105129098-A0202-12-0021-2
Figure 105129098-A0202-12-0022-3
 批次通過的數值：細菌內毒素=10UE/ml；病毒力價=102.7至103.7PFU/劑；pH=6.8至7.2；殘留細胞DNA
Figure 105129098-A0202-12-0022-37
100pg/劑；殘留水分
Figure 105129098-A0202-12-0022-36
3%；重構前產品外觀：淡黃色(均質餅狀(SYHC))，以及重構後產品外觀：微黃色透明液體(SYCL)。
III重構登革熱疫苗第1、2、3、4型(減毒)用的稀釋液 組成： 製備1,000毫升用
溶液1(0.2M磷酸二氫鈉二水合物)...........195mL
溶液2(0.2M磷酸氫二鈉七水合物)..........05mL
注射水qsp.......................................1,000mL
呈現：5.0毫升小瓶或安瓶
IV登革熱疫苗第1、2、3、4型(減毒)的穩定性研究 在2-8℃下的穩定性研究
存放在2-8℃下的三批次的登革熱疫苗第1、2、3、4型(減毒)樣本所進行的測試結果如表3及4所示。
表3 存放在2-8℃下的登革熱疫苗第1、2、3、4型(減毒)批次中無菌性及物理-化學測驗的結果
Figure 105129098-A0202-12-0023-4
 SYHC：淡黃色均質乾餅。SYCL：淡黃色的澄清液體。
III.重構登革熱疫苗第1、2、3、4型(減毒)的稀釋劑 組成：
表3的分析結果顯示，對於儲存達至少一年的登革熱病毒血清型第1、2、3和4型的病毒力價仍維持在令人滿意的狀態。儲存於2-8℃下18個月後，DENV3和DENV4的病毒力價低於最低要求(102.7PFU/母劑疫苗)。
Figure 105129098-A0202-12-0023-5
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描述了本發明的某些具體實施例，本領域之技術人員將會了解在所附的申請專利範圍中，基於上述的教示，許多本發明的修改和變型是可能的。因此，可以理解的是，在所附的申請專利範圍和本文所提供的揭示的範圍內，本發明可以不同於某些具體實施例中具體描述的方式來實現。
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<213> 登革熱病毒1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> n為a、c、g，或t
<400> 1
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<210> 2
<211> 10618
<212> DNA
<213> 登革熱病毒2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> n為a、c、g，或t
<220>
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<222> (10580)..(10618)
<223> n為a、c、g，或t
<400> 2
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<210> 3
<211> 10645
<212> DNA
<213> 登革熱病毒3
<220>
<221> misc_feature
<222> (10644)..(10645)
<223> n為a、c、g，或t
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<212> DNA
<213> 登革熱病毒4
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<400> 4
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Claims (16)

  1. 一種製備減毒四價登革熱疫苗的方法，包含：(i)將低代數(123代)的非洲綠猴腎(Vero)細胞在培養基中擴增以產生該Vero細胞的主細胞庫及工作細胞庫，其中該Vero細胞被適應在無血清培養基中生長，使用無血清培養基和分離該Vero細胞的非動物來源的胰蛋白酶通過在225cm2組織培養(TC)瓶中繼代培養而生長於無血清培養基中，接著於之後在一細胞工廠系統TM(Cell Factory SystemTM，CFS)中擴增；(ii)將來自主細胞庫或工作細胞庫的該Vero細胞感染來自各病毒的病毒種庫(MVS)或工作病毒庫(WVS)的登革熱病毒血清型第1、2、3、4型，其中該Vero細胞的懸浮液於攪拌下在分隔的無血清培養基中獨立地各自感染該登革熱病毒血清型第1、2、3、4型，以獲得將用於製備病毒原液的培養物；(iii)將含有步驟(ii)中所獲得的各自感染一種登革熱病毒的該Vero細胞的該225cm2組織培養(TC)瓶或該細胞工廠系統TM(CFS)於36.5℃(±1℃)下在培養箱中培養10到20天；(iv)藉由置換培養基以連續收穫感染的培養物的上清液的方式收穫各培養物的上清液；(v)將來自步驟(iv)的各種登革熱病毒懸浮液以通過0.2μm孔隙的膜過濾，並將該過濾過的登革熱病毒儲存於-80℃(±5℃)；(vi)藉由濃縮收穫的病毒懸浮液、通過切向過濾來純化濃縮物且以0.2的膜對其過濾，來製備登革熱病毒血清型第1、2、3、4型的病毒 原液；(vii)配製分別為各登革熱血清型的四種單價疫苗；(viii)透過混合該單價疫苗以配製四價疫苗；(ix)將該四價疫苗充填至小瓶中；(x)將該小瓶中的該四價疫苗進行冷凍乾燥；(xi)將在該小瓶中冷凍乾燥的該四價疫苗密封；以及(xii)將冷凍乾燥且密封的產品儲存於2-8℃，從而製備減毒四價登革熱疫苗，其中所使用的登革熱病毒株是rDEN1Δ30-1545(SEQ ID NO：1)或其變異體；rDEN2/4Δ30(ME)-1495,7163(SEQ ID NO：2)或其變異體；rDEN3Δ30/31-7164(SEQ ID NO：3)或其變異體，以及rDEN4Δ30-7132,7163,8308(SEQ ID NO：4)或其變異體。
  2. 如請求項1之方法，其中在步驟(iv)中收穫該上清液，加入等體積的無血清培養基至該培養物中，且重複步驟(iii)與(iv)。
  3. 如請求項2之方法，其中步驟(iii)和(iv)重複一至約七次。
  4. 一種製備減毒四價登革熱疫苗的方法，包含：(i)將低代數(123代)的Vero細胞在培養基中擴增以產生該Vero細胞的主細胞庫及工作細胞庫，其中該Vero細胞被適應在無血清培養基中生長，使用無血清培養基和分離該Vero細胞的非動物來源的胰蛋白酶通過在225cm2組織培養(TC)瓶中繼代培養而生長於無血清培養基中，接著於之後在多層細胞系統中擴增；(ii)將來自主細胞庫或工作細胞庫的該Vero細胞感染來自各種病 毒的病毒種庫(MVS)或工作病毒庫(WVS)的登革熱病毒血清型第1、2、3、4型，其中該Vero細胞於攪拌下在分隔的該無血清培養基中獨立地各自感染該登革熱病毒血清型第1、2、3、4型，以獲得將用於製備病毒原液的培養物；(iii)將上述步驟(ii)中所獲得的各自感染一種登革熱病毒的該Vero細胞在一組織培養瓶或細胞工廠系統TM中於36.5℃(±1℃)下培養10到20天(DENV1和DENV4為10到15天、DENV2為12到17天及DENV3為13到20天)；(iv)藉由置換培養基以連續收穫感染的培養物的上清液的方式收穫各培養物的上清液；(v)將來自步驟(iv)的各種登革熱病毒懸浮液以通過0.2μm孔隙的膜過濾，並將該過濾過的登革熱病毒儲存於-80℃(±5℃)；(vi)藉由濃縮收穫的病毒懸浮液、通過切向過濾來純化濃縮物且以0.2的膜對其過濾，來製備該登革熱病毒血清型第1、2、3、4型的病毒原液；(vii)以登革熱原液配製單價疫苗；以及(viii)透過混合該單價疫苗以配製四價疫苗，其中所使用的登革熱病毒株是rDEN1Δ30-1545(SEQ ID NO：1)或其變異體；rDEN2/4Δ30(ME)-1495,7163(SEQ ID NO：2)或其變異體；rDEN3Δ30/31-7164(SEQ ID NO：3)或其變異體，以及rDEN4Δ30-7132,7163,8308(SEQ ID NO：4)或其變異體。
  5. 如請求項4之方法，其中所用的該Vero細胞株是ATCC CCL-81.4。
  6. 如請求項4之方法，其中在步驟(iv)中收穫該上清液，並加入等體積的該無血清培養基至該培養物中，且重複步驟(iii)與(iv)。
  7. 如請求項6之方法，其中步驟(iii)和(iv)重複一至約七次。
  8. 如請求項4之方法，其中各種登革熱病毒血清型的登革熱病毒株的病毒感染倍數(multiplicity-of-infection，MOI)係：登革熱病毒血清型第1型及第4型為0.01至0.03，登革熱病毒血清型第2型為0.02至0.04，登革熱病毒血清型第3型為0.05至0.08。
  9. 如請求項4之方法，其中該單價疫苗係以等體積比例混合，以得到該四價登革熱疫苗1、2、3、4(減毒)。
  10. 如請求項4之方法，進一步包含將該四價疫苗充填至小瓶中；冷凍乾燥該小瓶中的該四價疫苗；將在該小瓶中冷凍乾燥的該四價疫苗密封；以及將冷凍乾燥且密封的產品儲存於2-8℃步驟。
  11. 如請求項10之方法，其中用於該冷凍乾燥步驟的參數為：冷凍(-30至-50℃)、真空度(20至100μbar)、在-30至-50℃(36至42小時)以及-5至-10℃(18至24小時)下初次乾燥，以及在25至29℃(8至15小時)下二次乾燥。
  12. 一種減毒四價登革熱疫苗，其透過如請求項1所述之方法製備。
  13. 一種製備用於施用於受試者的四價登革熱疫苗的方法，其包含將如請求項12所述的密封且冷凍乾燥的該四價登革熱疫苗在含 有0.2M磷酸二氫鈉二水合物、0.2M磷酸氫二鈉七水合物以及水的組合物中重構的步驟。
  14. 如請求項13之方法，其中密封且冷凍乾燥的該疫苗是在5毫升的該組合物中重構。
  15. 一種登革熱病毒株用於製備在一受試者體內誘導對登革熱病毒血清型第1、2、3、4型免疫反應的減毒四價登革熱疫苗的用途，其包含施予如請求項12所述的該疫苗至該受試者。
  16. 一種四價登革熱疫苗套組，其包含如請求項12所述的該疫苗、一包含0.2M磷酸二氫鈉二水合物、0.2M磷酸氫二鈉七水合物以及水的重構組合物。
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