CN108289945B - 用于制备减毒四价登革热疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于制备减毒四价登革热疫苗的方法及其产品。本发明还涉及一种用于制备向受试者施用的四价登革热疫苗的方法，一种诱导受试者对登革热血清型1、2、3和4的免疫反应的方法以及一种四价登革热疫苗试剂盒。

Description

用于制备减毒四价登革热疫苗的方法

并入序列表

包含在2015年8月31日创建的56,450字节(在操作系统MS-Windows中测量的)的命名为“60135_146578_ST25.txt”的文件中的序列表以电子方式提交，并且通过引用整体合并于此。

技术领域

本发明在生物技术领域。本发明涉及用于制备减毒四价登革热疫苗的方法。本发明还涉及减毒四价登登革热疫苗。本发明还涉及减毒四价登革热疫苗。本发明还涉及用于重组疫苗的组合物的使用。本发明还涉及诱导对患者血清型1、2、3和4的免疫反应的方法。本发明还涉及四价登革热疫苗试剂盒。

背景技术

目前，登革热是一种对巴西公众健康有重大影响的疾病。它影响着生活在流行地区的一半的世界人口，主要集中在东南亚(太平洋地区)和美国。据WHO称，在最近的一项研究中，估计每年约有3.9亿登革热感染(95％可信区间284百万至528百万)，其中，9600万(67百万至136百万)在临床上表现出来(任何严重程度的疾病)[1]。在另一项有关登革热流行的研究中，估计128个国家的3900万人有登革热病毒感染的危险[2]。

在巴西，2000年发病人数为20万登革热病例，2010年发生了100万例登革热病例。2015年，直到3月份，巴西报告的登革热病例有460502例。东南地区报告病例数最多(304251例，66.1％)，其次是中西部地区(59855例，13％)，东北地区(51221例，11.1％)，北方地区(19402例，2％)和南方(25773例，5.6％)[3]。

登革热(DF)及其严重形式登革热出血热(DHF)/登革热休克综合症(DSS)会由登革热血清型DEN1、DEN2、DEN3和DEN4感染引起。

由于目前没有治疗这种疾病的抗病毒药物，并且蚊媒(埃及伊蚊)控制策略已被证明无效，控制登革热进展的唯一方法是通过预防，使用针对四种登革热的疫苗病毒。目前，登革热疫苗尚未获得人类使用许可。流行病学研究表明，一种登革热血清型的原发感染通常会导致DF，而第二次感染导致DHF的机会比原发感染高15倍至80倍。因此，一种有效的登革热疫苗必须由四种血清型血清型登革热病毒组成[4]。然而，四价登革热疫苗的开发非常困难，因为该产品必须提供对所有登革热病毒血清型的长期保护[5]。

2009年3月4日提交的美国专利申请13/305,639(专利号12/398,043的继续申请)、2004年10月21日提交的当前专利号8,075,903(作为申请号10/970,640的继续申请)、2003年4月25日提交的当前美国专利号7,517,531号(申请号PCT/US03/13279的继续申请)通过美国政府(由卫生和人类服务部门秘书代表)提交的标题为“登革热四价疫苗，其在登革热类型1、2、3和4或抗原嵌合登革热病毒1、2、3和4的3’中含有共同的30个核苷酸缺失”。上述专利是指从包含四种登革热病毒血清型和30个核苷酸缺失或抗原性嵌合登革热病毒的混合物中获得的一种产物。

MonikaSimmons等人在2007年11月2日提交的美国专利申请11/982,488，在2012年5月31日被公开并在2012年8月14日被授权，标题为“使用初免-加强方法诱导针对登革热病毒的免疫反应”描述了用于诱导对登革热病毒的免疫反应的方法。诱导对登革热病毒的免疫反应的方法包括：施用非复制免疫原，接着用四价活的减毒病毒疫苗进行加强。另一方面是诱导免疫反应的方法，其使用含有DNA表达系统、腺病毒表达载体或委内瑞拉马脑炎病毒复制子系统的启动免疫原的异源初免-加强方案以及包含没有DNA表达系统的上述启动免疫原。每种表达系统含有编码登革热病毒蛋白的DNA序列。以上专利描述了登革热疫苗的免疫方案。在该方案中，第一次免疫使用非复制免疫原，并在四价活减毒登革热疫苗后使用。本专利申请的目的是获得减毒活登革热疫苗的方法。

本发明教导了使用以下减毒病毒株来开发针对四种登革热病毒的疫苗：rDEN1Δ30-1545(SEQ ID NO：1)及其变体；rDEN2/4Δ30(ME)-1495，7163(SEQ ID NO：2)及其变体；rDEN3Δ30/31-7164(SEQ ID NO：3)及其变体以及rDEN4Δ30-7132、7163、8308(SEQ ID NO：4)及其变体。某些rDEN1Δ30，rDEN2/4Δ30，rDEN3Δ30和rDEN4Δ30重组减毒登革热病毒描述于美国专利号7,517,531、7,226,602和8,337,860，其全部内容在此引入作为参考。

本发明中称为登革热疫苗1、2、3、4(减毒)的疫苗以冻干形式呈现在装有10个剂量的小瓶中。在开发这种疫苗时，建立了以下过程：产生Vero细胞和登革热病毒的血清型1、2、3和4以获得细胞和病毒库；用这些库的细胞和病毒生产病毒悬浮液；浓缩这些悬浮液和病毒体的制备；配制单价和四价疫苗；填充；冻干和密封产品。

可以看出，没有一种现有技术文献公开或提出了一种能够大规模制备登革热疫苗的用于制备减毒四价登革热疫苗的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本公开将提供比现有制备四价登革疫苗的方法的显着的优点。最初，本发明的某些实施方案使用具有较低传代的Vero细胞株(第123代)，其允许该细胞系的大量传代培养，即高产量。此外，用维持在无血清培养基中的细胞制备Vero细胞主库和工作库，用非动物源胰蛋白酶传代培养，并用5％DMSO将其稳定。无血清培养基的使用导致更高的重复性，更不用说在Vero细胞的维持和扩增的次培养中使用非动物胰蛋白酶使得该方法更安全并且不可能使最终产品受猪圆环病毒污染。此外，Vero细胞可以在225cm²的TC培养瓶(组织培养瓶)或Nunc^TM细胞工厂系统^TM中生长，其具有10个托盘层(美国宾夕法尼亚州匹兹堡的赛默飞世尔科技公司(赛默飞世尔科技公司，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国)；培养面积约6,320cm²)，其允许高达约2×10⁹个细胞/CFS的细胞/TC瓶的高产量。在制备工作病毒种子库的Vero细胞中额外复制登革热病毒增加了处理的生产率。在CFS的一个生产周期中获得的病毒悬浮液的最终体积是14L(高体积)。在本发明的某些实施方案中，在病毒的单个生产周期中可以获得多达约七次收集。通过从培养物中除去含有病毒的培养基，用新鲜培养基代替被除去的培养基，用新培养基培养被感染的细胞，并在培养后收集含有病毒的培养基，从感染的细胞中收集登革热病毒悬浮液，这也增加本文提供的处理的生产率。本公开还教导了通过研究在TC培养瓶和细胞工厂系统^TM中生长的Vero细胞中的血清型1、2、3和4的登革热病毒复制曲线来获得病毒悬浮液上清液的最佳时间，其允许增加收集的次数。在某些实施方案中，本公开内容的四价疫苗使用根据每种血清型含有不同滴度的病毒登革热的单价疫苗制备(对于DENV1、DENV2、DENV3和DENV4分别为5.7±0.2、5.6±0.2、6.1±0.2以及5.8±0.2Log₁₀PFU/ml)，这使得四价疫苗中每种血清型的病毒颗粒具有更高的同质性。最后，要求保护的方法中的填充步骤和冻干步骤提供了在2℃至8℃下稳定1年的疫苗。

总之，制备本申请的减毒四价登革热疫苗的方法呈现高收率且可再生。该疫苗是所述方法的产物，其高度稳定且没有通常用于疫苗的生产中的动物源的污染物(血清和胰蛋白酶)。所述特征允许大规模生产登革热疫苗。此外，自2013年11月以来，本公开的登革热疫苗已在巴西的人体中进行了测试(II期临床试验)。这项研究的初步数据表明，该产品是安全的和免疫原性的。

在一方面，本发明涉及一种用于制备减毒四价登革热疫苗的方法，其特征在于其包括以下步骤中的任意子集或所有：将Vero细胞适于在无血清培养基中生长并且用非动物源的胰蛋白酶来获得细胞传代培养；将Vero细胞在225cm²TC烧瓶中并稍后在细胞工厂系统^TM(CFS)中扩增；用登革热病毒血清型1、2、3和4产生Vero细胞主细胞库(MCB)和工作细胞库(WCB)以及种子库和工作种子库；用来自工作种子病毒库的登革热病毒血清型1、2、3和4感染来自工作细胞库的225cm²的TC烧瓶或CFS中的Vero细胞；在36.5℃(±1℃)培育包含Vero细胞/病毒登革热悬浮液的TC培养瓶或细胞工厂系统^TM10至20天；收集上清液，过滤(0.2μm孔隙度的膜)并储存在-80℃(±5℃)下；准备登革热病毒血清型1、2、3和4的病毒体；用这些病毒体配制单价疫苗；用四种单价疫苗配制四价疫苗；填充；冻干；密封；贴标签并将产品储存在2℃至8℃。

在某些实施例中，使用的Vero细胞系是ATCC CCL-81.4(cGMPVero，肾非洲绿猴-非洲绿猴)。在另一个实施例中，所使用的登革热病毒株是来自美国国立卫生研究院(NIH)的rDEN1Δ30-1545；rDEN2/4Δ30(ME)-1495，7163；rDEN3Δ30/31-7164和rDEN4Δ30-7132，7163，8308。在另一实施例中，登革热病毒株对于每种登革热血清型的MOI：对于DENV1和DENV4，MOI约为0.01至0.03，对于DENV2约为0.02至0.04，对于DENV3约为0.05至0.08。在另一实施例中，以相同体积比混合单价疫苗以获得四价登革热疫苗血清型1、2、3、4(减毒)。在另一实施例中，用于冷冻干燥(冻干法)过程的参数是：冷冻(-30℃至-50℃)，真空(20μbar至100μbar)，-30℃至-50℃(36小时至40小时)以及5℃至-10℃(18小时至24小时)初次干燥和25℃至29℃(8小时至15小时)二次干燥。

在另一方面，本发明涉及一种通过以上描述的方法生产的减毒四价登革热疫苗。

在另一方面，本发明涉及一种用于重组通过以上描述的方法生产的疫苗的组合物的用途，其中，所述组合物包括0.2M磷酸二氢钠一水合物、0.2M磷酸氢二钠七水合物和WFI(即，注射用水)。在实施例中，使用5mL的所述组合物用于重组干燥疫苗。

在另一方面，本发明涉及一种通过对受试者施用以上所述的疫苗来诱导受试者对登革热血清型1、2、3和4的免疫反应的方法，所述受试者为人类。

在另一方面，本发明涉及一种包括如上所述的冻干四价疫苗的四价登革热疫苗试剂盒，重组组合物包括0.2M磷酸二氢钠一水合物、0.2M磷酸氢二钠七水合物和WFI水。

在某些实施例中，一种用于制备减毒四价登革热疫苗的方法，包括：(i)在培养物中扩增Vero细胞以产生Vero细胞的主库和工作库，其中，Vero细胞适于在无血清培养基中生长，并在无血清培养基中长成，并且用该细胞的非动物源的胰蛋白酶于225cm²组织培养(TC)烧瓶中并随后在细胞工厂系统^TM(CFS)中传代培养；(ii)用来自每个病毒的种子或工作库的登革热病毒血清型1、2、3和4感染来自主库或工作库的Vero细胞，其中，Vero细胞独立地感染分别在具有无血清培养基培养物中的登革热病毒血清型1、2、3和4；(iii)在36.5℃(±1℃)下培育含有感染每种登革热病毒的Vero细胞的225cm²TC烧瓶或细胞工厂系统^TM(CFS)10天至20天；(iv)收集每种培养物的上清液；(v)通过具有0.2μm孔隙度的膜过滤来自步骤(iv)的每种登革热病毒悬浮液，并在-80℃(±5℃)下存储过滤后的登革热病毒；(vi)制备血清型1、2、3和4的登革热病毒体；(vii)配制单价疫苗；(viii)通过混合单价疫苗来配制四价疫苗；(ix)用四价疫苗填充小瓶；(x)将小瓶中的四价疫苗冻干；(xi)将冻干的四价疫苗密封在小瓶中；(xii)在2℃至8℃储存冻干密封产品，从而制备减毒四价登革热疫苗。

在某些实施例中，一种用于制备减毒四价登革热疫苗的方法，包括：(i)在培养物中扩增Vero细胞以产生Vero细胞的细胞库和工作库，其中，Vero细胞适于在无血清培养基中生长，并在无血清培养基中长成，并且用非动物源胰蛋白酶传代培养；(ii)用来自每种病毒的种子或工作库的登革热病毒血清型1、2、3和4感染来自细胞库或工作库的Vero细胞，其中，Vero细胞独立地感染在具有无血清培养基的培养物中的登革热病毒血清型1、2、3和4；(iii)在36.5℃(±1℃)下培育在组织培养烧瓶或细胞工厂系统^TM中感染每种登革热病毒的Vero细胞10天至20天；(iv)收集每种培养物的上清液；(v)通过具有0.2μm孔隙度的膜过滤来自步骤(iv)的每种登革热病毒悬浮液，并在-80℃(±5℃)下储存过滤后的登革热病毒；(vi)配制血清型1、2、3和4的登革热病毒体；(vii)配制单价疫苗；(viii)通过混合单价疫苗来配制四价疫苗。

在某些实施例中，提供通过以上提到的方法中的任意方法生产减毒四价登革热疫苗。

在某些实施例中，提供一种用于制备对受试者施加的四价登革热疫苗的方法，所述方法包括在包括0.2M磷酸二氢钠一水合物、0.2M磷酸氢二钠七水合物和水的组合物中重组由以上提到的方法中的任意方法产生的密封冻干四价登革热疫苗的步骤。

还提供一种诱导受试者对登革热血清型1、2、3和4的免疫反应的方法，该方法包括给受试者施用以上提到的疫苗。

还提供一种包括以上提到的疫苗的四价登革热疫苗试剂盒，重组组合物包括0.2M磷酸二氢钠一水合物、0.2M磷酸氢二钠七水合物和水。

在以上提到的过程、疫苗、方法或试剂盒中的任意的某些实施例中，所使用的登革热病毒株是rDEN1Δ30-1545(SEQ ID NO：1)或其变体；rDEN2/4Δ30(ME)-1495，7163(SEQID NO：2)或其变体；rDEN3Δ30/31-7164(SEQ ID NO：3)或其变体以及rDEN4Δ30-7132、7163、8308(SEQ ID NO：4)或其变体。

附图说明

通过参考附图和以下描述，可以更好地理解本公开的目的以及其进一步的优点：

图1是描述了本公开的制备减毒四价登革热疫苗的方法的所有步骤的概述。

具体实施方式

虽然本发明可能容易受到不同实施例的影响，但是在附图和以下具体实施方式中示出了某些实施例，应该理解的是，本公开可以被认为是本发明原理的示例，并且不旨在限制本发明的范围，发明的范围与在本说明书中示出和公开的内容相关。

用于制备减毒四价戈登疫苗的方法。

在第一个实施方案中，本发明涉及用于制备减毒四价登革热疫苗的方法，该方法包括以下步骤中的任何子集或全部步骤：使猴肾(Vero)细胞适于无血清培养基和非动物源的胰蛋白酶中生长；在225cm²TC烧瓶中放大该细胞培养物中的Vero细胞，随后在细胞工厂系统^TM(CFS)中放大；生产主Vero细胞库(Master)和工作库以及登革热病毒血清型1、2、3和4种子和工作库；以来自库的登革热病毒血清型1、2、3和4感染在225cm²TC培养瓶或CFS中的Vero细胞；在36.5℃(±1℃)下培育含有感染登革热病毒的Vero细胞/病毒悬浮液的225cm²TC烧瓶或CFS 10-20天；收集这些培养物的上清液，将这些登革热病毒悬浮液以具有0.2μm孔隙率的膜过滤并储存在-80℃(±5℃)下；准备血清型1、2、3和4的登革热病毒体；用这些病毒体配制单价疫苗；配制混合单价疫苗的四价疫苗；填充、冻干；密封并储存产品在2℃至8℃。在另一个实施例中，使用的Vero细胞系是ATCC CCL-81.4(cGMPVero，肾非洲绿猴-非洲绿猴，可从ATCC，马纳萨斯，维吉尼亚州，美国获得)。在另一个实施例中，所使用的登革热病毒株是rDEN1Δ30-1545(SEQ ID NO：1)或其变体；rDEN2/4Δ30(ME)-1495，7163(SEQID NO：2)或其变体；rDEN3Δ30/31-7164(SEQ ID NO：3)或其变体；和rDEN4Δ30-7132，7163，8308(SEQ ID NO：4)或其变体。可以使用的上述登革热病毒株的变体包括但不限于：(1)具有与rDEN1Δ30-1545(SEQ ID NO：1)全长至少有95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同源性的基因组的变体，和具有前述百分比序列同源性的变体，其编码与由SEQ ID NO：1编码的病毒多蛋白具有至少95％、96％、97％、98％，99％或100％序列同源性的病毒多蛋白；(2)具有与rDEN2/4Δ30(ME)-1495，7163(SEQ ID NO：2)全长至少有95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同源性的基因组的变体，和具有前述百分比序列同源性的变体，其编码与由SEQ ID NO：2编码的病毒多蛋白具有至少95％、96％、97％、98％，99％或100％序列同源性的病毒多蛋白；(3)具有与rDEN3Δ30/31-7164(SEQ ID NO：3)全长至少有95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同源性的基因组的变体，和具有前述百分比序列同源性的变体，其编码与由SEQ ID NO：3编码的病毒多蛋白具有至少95％、96％、97％、98％，99％或100％序列同源性的病毒多蛋白；(4)具有与rDEN4Δ30-7132，7163，8308(SEQ ID NO：4)全长至少有95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同源性的基因组的变体，和具有前述百分比序列同一性的变体，其编码与由SEQ ID NO：4编码的病毒多蛋白具有至少95％、96％、97％、98％，99％或100％序列同源性的病毒多蛋白。

rDEN1Δ30(GenBank登录号：AY145123)是通过在3′非编码区(3′UTR)中缺失30个核苷酸(Δ30)从DEN1西太平洋(WP)野生型菌株衍生的活减毒病毒。本文使用的rDEN1Δ30-1545菌株(SEQ ID NO：1)编码病毒多蛋白中氨基酸残基编号484的单个Lys→Arg突变(A1545G突变)。

对于DEN2病毒的研发，将DEN2的ME区替换为rDEN4Δ30的相应基因以产生候选疫苗rDEN2/4Δ30(ME)。本文使用的rDEN2/4Δ30(ME)-1495，7163菌株(SEQ ID NO：2)编码病毒多蛋白中氨基酸残基编号186处的Ser→Phe突变(C1495T突变)和氨基酸残基编号112处的Leu→Phe突变(A7163C突变)。

rDEN3Δ30/31是来自rDEN3Δ30菌株的活减毒病毒。最初，它以菌株DEN3Sleman/78的完整cDNA拷贝构建，在3′UTR中产生30个核苷酸的缺失(Δ30)。从得到的rDEN3Δ30病毒中，在3′UTR中进行另外约31个核苷酸的缺失[2]。因此，rDEN3Δ30/31包含原始Δ30缺失和不连续的31nt缺失，其除去原始TL-2和TL-3结构。结果，此处使用的rDEN3Δ30/31-7164菌株(SEQ ID NO：3)编码病毒多蛋白中氨基酸残基编号115处的Val→Ala突变(T7164C突变)。

rDEN4Δ30是使用重组DNA技术衍生自野生型DEN4Dominica/81的活减毒病毒。一个在3′UTR的二级结构中鉴定为TL2的茎环结构先前通过从DEN4基因组中缺失30个核苷酸而除去(3′d 172-143)，随后被命名为Δ30突变。本文使用的rDEN4Δ30-7132，7163，8308菌株(SEQ ID NO：4)编码病毒多蛋白中氨基酸残基编号102处的Thr→Ile突变(C7132T突变)，氨基酸残基编号112处的Leu→Phe突变(A7163C突变)以及氨基酸残基编号249处的Lys→Arg突变(A8308G突变)。

在另一实施方案中，登革热病毒株的MOI针对每种登革热血清型改变：对于DENV1和DENV4，登革热病毒MOI为0.01至0.03，对于DENV2为0.02至0.04，对于DENV3为0.05至0.08。在另一实施例中，以相同体积比混合单价疫苗以获得四价登革热疫苗血清型1、2、3、4(减毒)。在另一实施例中，用于冷冻干燥过程的参数是：冷冻(-30℃至-50℃)，真空(20μμbar至100μbar)，-30℃至-50℃(36小时至40小时)以及5℃至-10℃(18小时至24小时)的初次干燥和25℃至29℃(8小时至15小时)的二次干燥。在某些实施例中，用Vero细胞的123代对无血清培养基进行适应；工作细胞库用134代进行；并且，生产登革热病毒的方法使用第138至149代的Vero细胞。

在某些实施方案中，在制备单价疫苗的步骤(vii)之前使用稳定剂。用于本发明某些实施方案的合适稳定剂包括但不限于海藻糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、AS04(稳定剂体系，其包括稳定的氢氧化铝和单磷酰脂质A的混合物)、人血清白蛋白(HSA)、

嵌段共聚物F127，F68(BASF)、P85(BASF)和P123(BASF)、多糖壳聚糖和重组HSA(rHSA)[8，9]。

减毒四价戈登疫苗

在另一实施例中，本发明涉及一种由上述方法生产的减毒四价登革热疫苗。

使用组合物重组干疫苗

在另一个实施例中，使用包含0.2M磷酸二氢钠一水合物、0.2M磷酸氢二钠七水合物和WFI水的组合物来重建如上所述的疫苗。在另一个实施例中，使用5mL组合物用于重组干燥疫苗。

用于诱发对患者的登革热血清型1、2、3和4免疫应答的方法

在另一实施例中，本发明涉及一种通过对受试者施加如上所述的疫苗来诱发受试者中的登革热血清型1、2、3和4的免疫反应的方法。

对于预防性治疗登革热感染，意图是本发明的疫苗可以在个体暴露于登革热病毒血清型1至4之前施用，并且所产生的免疫反应可以抑制或降低登革热感染。

四价登革热疫苗试剂盒

在另一实施例中，本发明涉及一种包括以上所述的疫苗的四价登革热疫苗试剂盒，重组组合物包括0.2M磷酸二氢钠一水合物、0.2M磷酸氢二钠七水合物和WFI水。

示例1生产方法的描述

生产登革热疫苗1、2、3、4(减毒)的方法包括以下步骤：

步骤1、制备在疫苗的生产过程中使用的培养基和溶液

制备用于维持Vero细胞的无血清培养基、病毒体的制备以及疫苗的配制如下：

VP-SFM AGT或AGT

(GIBCO)无血清培养基：将在烧瓶中的粉末状培养基以WFI水稀释，并向其中加入L-谷氨酰胺，从而最后培养基中存在200mM的L-谷氨酰胺。通过在0.2μm膜中过滤以将培养基灭菌，并取样进行pH测量和无菌测试。

无酚红的Leibovitz(L-15)培养基：将在烧瓶中的粉末培养基以WFI水稀释。然后，将培养基在0.2μm的膜中过滤。取样以进行无菌、细菌内毒素、pH和外观测试。

将过滤的培养基包装在聚碳酸酯烧瓶中并储存于2℃至8℃。

0.02M磷酸盐缓冲溶液由氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾和WFI水组成。该溶液用于在扩增细胞过程中和登革热病毒悬浮液浓缩期间洗涤培养物。

步骤2制备Vero细胞的主库和工作库

通过Vero细胞系ATCC CCL-81.4(例如cGMPVero，肾非洲绿猴-非洲绿猴p.123批次7388125)对无血清培养基和非动物源胰蛋白酶的培养物的适应而获得。通过使用无血清培养基(VP-SFM

-GIBCO)和重组胰蛋白酶(TrypLE

-Gibco)将在用于培养细胞的225cm²T烧瓶中的该细胞在培养细胞中连续传代来进行该适应。在仅用血清培养基培养的细胞适应在无血清培养基中生长后，使用在无血清培养基中生长的培养物来制备细胞库。

在制备主细胞库和工作细胞库时，将培养瓶中含有90％至100％汇合度的适应Vero细胞用胰蛋白酶分离，悬浮于OptiPRO AGT(Gibco)培养基中，离心并将沉淀物重新悬浮于相同的含有5％DMSO的培养基。将细胞悬浮液匀浆并分配到含有4至10×10⁶个细胞/ml的冷冻管中。将冷冻管放置在-80℃(±5℃)的冷冻箱中48小时，然后储存在液氮中。样品通过以下质量控制测试获得库认证：无菌性、核型分析、细胞识别、细胞和动物中的外来因子、血吸虫病毒和支原体。

步骤3扩增用作产生登革热病毒的细胞基质的Vero细胞

细胞扩增过程包括在37℃(±1℃)的水浴中解冻冷冻管，其中，冷冻管包含来自原始细胞(ATCC-CCL81.4)或来自主或工作细胞库的Vero细胞。解冻后，将Vero细胞的悬浮液置于无血清培养基的T培养瓶中，并在36.5℃(±1℃)下培养至T-瓶培养区的细胞单层的覆盖率为90％至100％。将烧瓶从培养箱中取出，并将细胞提交给新的传代培养。在此过程中，将细胞单层用0.02M磷酸盐缓冲的盐水溶液洗涤并用重组胰蛋白酶(Tryple

-GIBCO)分离。将细胞悬浮在无血清培养基中，并分装到含有相同培养基的TC烧瓶中。将TC烧瓶再次在36.5℃(±1℃)下培育直至达到90％至100％的覆盖率，然后进一步传代培养。细胞的扩增最初是在225cm²的TC烧瓶中制备的，随后在具有10个盘层的细胞工厂系统^TM(CFS)中制备。

步骤4制备登革热工作病毒库DEN1、DEN2、DEN3和DEN4

将具有225cm²培养区域的TC烧瓶中的扩增的Vero细胞分别感染登革热病毒株rDEN1Δ30-1545(SEQ ID NO：1)；rDEN2/4Δ30(ME)-1495，7163(SEQ ID NO：2)；rDEN3Δ30/31-7164(SEQ ID NO：3)；及rDEN4Δ30-7132，7163，8308(SEQ ID NO：4)。用于病毒感染的MOI(感染复数)对于每种血清型是不同的：DENV1和DENV4为0.01到0.03，DENV2为0.02到0.04，DENV3为0.05到0.08。感染的培养物在36.5℃(±1℃)下培育。培育8天后，分别收集感染DEN1Δ30、DEN2/4Δ30(ME)-1495，7163、DEN3Δ30/31-7164和DEN4Δ30-7132，7163，8308的培养物的上清液，通过无菌膜过滤并储存在-80℃(±5℃)的冷冻箱中。更换烧瓶的培养基，再将烧瓶在36.5℃(±1℃)下培养。该过程连续三天重复，以产生四个上清液的样品。对于感染DEN3的培养物，该过程在培育的第10天开始。每个收集的培养物的上清液的样品进行无菌和病毒滴定测试。

在工作库的制备中，收集通过无菌试验，滴度高于10^5.0PFU/ml的上清液，将其混合后分装到2mL至4mL的冷冻管中并保存在液氮中。该库经批准用于以下测试后使用：病毒识别、无菌、滴定、细胞和动物中的外来因子、血吸虫病毒和支原体。

步骤5生产用于登革热配制的登革热病毒血清型1、2、3和4

在扩增之后，包含从如以上步骤3中描述的扩增过程中获得的在TC烧瓶中或细胞工厂系统^TM中的Vero细胞被胰蛋白酶化并悬浮在无血清培养基(

AGT-GIBCO)中。获得的Vero细胞悬液接种来自在登革热疫苗生产过程的步骤4中制备的登革热病毒库中的登革热病毒株rDEN1Δ30-1545、rDEN2/4Δ30(ME)-1，495.7163、rDEN3ΔA30/31-7164和rDEN4Δ30-7132，7163，8308。为了接种，使用每种血清型的不同MOI(感染复数)：DENV1和DENV4为0.01到0.03，DENV2为0.02到0.04，DENV3为0.05到0.08。接种后，将病毒/细胞悬浮液在32℃(±1℃)下搅拌30分钟至60分钟，然后分配到225cm²的TC烧瓶或具有10个托盘层的CFS中。将无血清培养基加入到培养物中，直至其在TC培养瓶中达到100mL至150mL的体积，并且在CFS中达到1200mL至1800mL。对于具有不同数量托盘层的CFS，通过制定三条规则计算培养基的体积。培养物在36.5℃(±1℃)培育。在培育的第8天或第10天，取出50％至60％的培养基，并在培养基中加入相等体积的无血清培养基。培养物再次在36.5℃(±1℃)下培育。受感染的Vero细胞培养物上清液的收集在接种登革热病毒后第10天至第20天进行。

收集过程包括除去TC培养瓶或CFS中受感染的培养物的上清液，混合收集的上清液，对该混合物进行灭菌过滤，将在聚丙烯/聚碳酸酯瓶中过滤的登革热病毒悬浮液分布并储存在-80℃(±5℃)。将样品进行无菌和病毒滴定测试。在测试中认可后，将含有病毒登革热悬浮液的烧瓶从冷冻箱中取出并转交给浓缩过程。

收集的病毒登革热悬浮液通过使用

系统(Millipore)的切向过滤工艺解冻并浓缩，所述系统具有30kDa至50kDa的孔隙率的膜。样品进行对照质量测试：病毒滴定和无菌测试。将rDEN1Δ30-1545，rDEN2/4Δ30(ME)-1495，7163，rDEN3Δ30/31-7164或rDEN4Δ30-7132，7163，8308的病毒浓缩物(CI)命名并储存在-80℃(±5℃)。

步骤6制备登革热病毒体

在-80℃(±5℃)下从冷冻箱中取出登革热病毒浓缩物C1(rDEN1Δ30-1545，rDEN2/4Δ30(ME)-1495，7163，rDEN3Δ30/31-7164或rDEN4Δ30-7132，7163，8308))，解冻并进行以下过程：将病毒浓缩物用没有酚红的Leibovitz培养基稀释，所用的稀释因子是其初始体积的5倍至10倍。通过切向过滤(Pellicon系统)将稀释的浓缩物再次浓缩至其初始体积的2.5倍至3倍。这种浓缩物被称为C2。

浓缩物C2在具有0.2μm孔隙率的膜中过滤，分布在管/烧瓶中并储存在-80℃(±5℃)的冷冻箱中。样品进行质量控制测试(无菌和细菌内毒素、支原体、细胞中的外来因子、血吸虫病毒、身份和病毒滴定)。在质量控制测试中获得认可后，病毒体被释放到单价疫苗的配方中。

2013年和2014年生产的登革热病毒体批量均在表1中。

表1.2013和2014年产生的rDEN1Δ30-1545、rDEN2/4Δ30(ME)-1495，7163、rDEN3Δ30/31-7164和rDEN4Δ30-7132，7163，8308登革热病毒体。

附言：内毒素值直到50UE/mL的均被认为是令人满意的，这是因为最终产品必须小于或等于10UE/mL。

步骤7配制单价疫苗rDEN1Δ30-1545、rDEN2/4Δ30(ME)-1495、7163、rDEN3Δ30/31-7164、rDEN4Δ30-7132、7163、8308以及登革热疫苗血清型1、2、3、4(减毒)。

以每种登革热病毒(rDEN1Δ30-1545、rDEN2/4Δ30(ME)-1495、7163、rDEN3Δ30/31-7164和rDEN4Δ30-7132、7163、8308)配制四种登革热单价疫苗。配制的计算包括确定稀释因子，使得对于DENV1、DENV2、DENV3和DENV4提供根据各血清型的单价疫苗以下的量：5.7±0.2、5.6±0.2、6.1±0.2以及5.8±0.2Log₁₀PFU/ml。

确定稀释因子的公式为：批量滴定度(Log₁₀PFU/ml)的反对数除以每类单价所需的病毒滴度反对数(Log₁₀PFU/ml)。rDEN1Δ30-1545、rDEN2/4Δ30(ME)-1495、7163、rDEN3Δ30/31-7164和rDEN4Δ30-7132、7163、8308的单价制剂用无酚红的Leibovitz(L-15)培养基浓缩两次，即培养基保留经两次浓缩的原始组合物。

为了制备登革热疫苗血清型1、2、3、4(减毒)制剂，将单价1、2、3和4疫苗以相同体积比混合。在配制的四价疫苗均化之后，对产物进行过滤(具有0.2μm孔隙度的膜)并将样品进行以下的质量控制测试：无菌性、细菌内毒素、病毒滴定、pH和产品外观。

步骤8填充冻干并密封四价登革热疫苗

在四价登革热疫苗配制之后，产品被用于填充具有3ml疫苗的小瓶。填充小瓶中的样本进行质量控制测试(无菌、内毒素细菌、病毒滴定、外观和pH)。

填充小瓶后，将它们转移至冻干机并开始冷冻干燥过程。在此过程中，建立以下参数：冷冻(-30℃至-50℃)，真空(20μbar至100μbar)，从-30℃至-50℃(36小时至40小时)，从-5℃至-10℃(18小时至24小时)和25℃至29℃(8小时至15小时)干燥。

在冷冻干燥过程结束时，将含有冻干疫苗的小瓶进行密封过程。最终产品登革热疫苗1、2、3、4(减毒)储存在2℃至8℃。测试疫苗批次样品的无菌性、细菌内毒素、病毒滴定、使用稀释剂重组之前和之后的产品外观、pH、残余DNA和残余水分，。

按照巴西规定命名疫苗时，该产品可被命名为登革热疫苗血清型1、2、3、4(减毒)。

该产品可以用5.0mL的特定稀释剂重新配制成疫苗(磷酸钠混合物)，相当于10个剂量/0.5mL/瓶。每剂量含有登革热疫苗1、2、3、4(减毒)配方中使用的每种登革热病毒10^2.7至10^3.7PFU/剂量。表2列出了2014年生产的六批产品的质量控制测试结果。

表2 2014年生产的登革热疫苗血清型1、2、3、4(减毒)批次。

针对批次认可的值：细菌内毒素＝10UE/ml；病毒滴定＝10^2.7至10^3.7PFU/剂量；pH＝6.8至7.2；残余细胞DNA≤100pg/剂量；残余湿气≤3％；在重组之前的产品外观：微黄色(均匀干饼(SYHC)和重组之后的产品外观：微黄色澄清液体(SYCL)。

III登革热病毒重组登革热1、2、3、4(减毒)

组成：

制备1,000毫升

溶液1(磷酸二氢钠一水合物0.2M) 195mL

溶液2(磷酸氢二钠七水合物，0.2M) 05mL

注射用水qsp 1000mL

表达方式：5.0mL小瓶或安瓿瓶

IV登革热疫苗1、2、3、4(减毒)的稳定性研究

在2℃至8℃的稳定性研究

在三批储存在2℃至8℃的登革热疫苗1、2、3、4(减毒)的样本中进行的测试结果，如表3和4所示。

表3在2℃至8℃储存的登革热疫苗1、2、3、4(减毒)中发现的无菌性和理化试验结果。

SYHC：微黄色均匀干饼。SYCL：淡黄色澄清液体。

针对登革热疫苗1、2、3、4的重组病毒(减毒)的稀释剂

组成：

表3的结果的分析表明：在至少一年的存储之内，登革热病毒血清型1、2、3和4的滴度仍然令人满意。在2℃至8℃储存18个月后，DENV3和DENV4滴度下降到最低要求(10^2.7PFU/疫苗剂量)以下。

表4在2℃至8℃储存的登革热疫苗1、2、3、4(减毒)的登革热病毒滴度组分的结果。

参考文献

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[8]Wiggan O’Neil，Livengood JA，Silengo SJ，Kinney RM，Osorio JE，HuangCYH，Stinchcomb DT.Novel formulations enhance the thermal stability of live-attenuated flavivirus vaccines.Vaccine 29(2011)7456-7462.

[9]Burke CJ，Hsu T-A，Volkin DB.Formulation，Stability and Delivery ofLive Attenuated Vaccines for Human Use.Critical Review in Therapeutic DrugCarrier Systems(1999)16(1)：1-8.

已经描述了本发明的某些实施例，本领域技术人员将在权利要求中理解：鉴于上述教导，可对本发明进行很多修改和变化。因此，应该理解的是：在权利要求和在此提供的公开内容的范围内，本发明可以以与特定实施例中具体描述的不同的方式来实施。

序列表

<110> N·M·F·盖丽娜

<120> 用于制备减毒四价登革热疫苗的方法

<130> PN005849

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10703

<212> DNA

<213> 登革热病毒1

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> n是a、c、g或t

<400> 1

nnnnnnnagt ctacgtggac cgacaagaac agtttcgaat cggaagcttg cttaacgtag 60

ttctaacagt tttttattag agagcagatc tctgatgaac aaccaacgga aaaagacggg 120

tcgaccgtct ttcaatatgc tgaaacgcgc gagaaaccgc gtgtcaactg tttcacagtt 180

ggcgaagaga ttctcaaaag gattgctttc aggccaagga cccatgaaat tggtgatggc 240

ttttatagca ttcctaagat ttctagccat acctccaaca gcaggaattt tggctagatg 300

gggctcattc aagaagaatg gagcgatcaa agtgttacgg ggtttcaaga aagaaatctc 360

aaacatgttg aacataatga acaggaggaa aagatctgtg accatgctcc tcatgctgct 420

gcccacagcc ctggcgttcc atctgaccac ccgaggggga gagccgcaca tgatagttag 480

caagcaggaa agaggaaaat cacttttgtt taagacctct gcaggtgtca acatgtgcac 540

ccttattgca atggatttgg gagagttatg tgaggacaca atgacctaca aatgcccccg 600

gatcactgag acggaaccag atgacgttga ctgttggtgc aatgccacgg agacatgggt 660

gacctatgga acatgttctc aaactggtga acaccgacga gacaaacgtt ccgtcgcact 720

ggcaccacac gtagggcttg gtctagaaac aagaaccgaa acgtggatgt cctctgaagg 780

cgcttggaaa caaatacaaa aagtggagac ctgggctctg agacacccag gattcacggt 840

gatagccctt tttctagcac atgccatagg aacatccatc acccagaaag ggatcatttt 900

tattttgctg atgctggtaa ctccatccat ggccatgcgg tgcgtgggaa taggcaacag 960

agacttcgtg gaaggactgt caggagctac gtgggtggat gtggtactgg agcatggaag 1020

ttgcgtcact accatggcaa aagacaaacc aacactggac attgaactct tgaagacgga 1080

ggtcacaaac cctgccgtcc tgcgcaaact gtgcattgaa gctaaaatat caaacaccac 1140

caccgattcg agatgtccaa cacaaggaga agccacgctg gtggaagaac aggacacgaa 1200

ctttgtgtgt cgacgaacgt tcgtggacag aggctggggc aatggttgtg ggctattcgg 1260

aaaaggtagc ttaataacgt gtgctaagtt taagtgtgtg acaaaactgg aaggaaagat 1320

agtccaatat gaaaacttaa aatattcagt gatagtcacc gtacacactg gagaccagca 1380

ccaagttgga aatgagacca cagaacatgg aacaactgca accataacac ctcaagctcc 1440

cacgtcggaa atacagctga cagactacgg agctctaaca ttggattgtt cacctagaac 1500

agggctagac tttaatgaga tggtgttgtt gacaatggaa aaacgatcgt ggctcgtcca 1560

caaacaatgg tttctagact taccactgcc ttggacctcg ggggcttcaa catcccaaga 1620

gacttggaat agacaagact tgctggtcac atttaagaca gctcatgcaa aaaagcagga 1680

agtagtcgta ctaggatcac aagaaggagc aatgcacact gcgttgactg gagcgacaga 1740

aatccaaacg tctggaacga caacaatttt tgcaggacac ctgaaatgca gactaaaaat 1800

ggataaactg actttaaaag ggatgtcata tgtaatgtgc acagggtcat tcaagttaga 1860

gaaggaagtg gctgagaccc agcatggaac tgttctagtg caggttaaat acgaaggaac 1920

agatgcacca tgcaagatcc ccttctcgtc ccaagatgag aagggagtaa cccagaatgg 1980

gagattgata acagccaacc ccatagtcac tgacaaagaa aaaccagtca acattgaagc 2040

ggagccacct tttggtgaga gctacattgt ggtaggagca ggtgaaaaag ctttgaaact 2100

aagctggttc aagaagggaa gcagtatagg gaaaatgttt gaagcaactg cccgtggagc 2160

acgaaggatg gccatcctgg gagacactgc atgggacttc ggttctatag gaggggtgtt 2220

cacgtctgtg ggaaaactga tacaccagat ttttgggact gcgtatggag ttttgttcag 2280

cggtgtttct tggaccatga agataggaat agggattctg ctgacatggc taggattaaa 2340

ctcaaggagc acgtcccttt caatgacgtg tatcgcagtt ggcatggtca cactgtacct 2400

aggagtcatg gttcaggcgg actcgggatg tgtaatcaac tggaaaggca gagaactcaa 2460

atgtggaagc ggcatttttg tcaccaatga agtccacacc tggacagagc aatataaatt 2520

ccaggccgac tcccctaaga gactatcagc ggccattggg aaggcatggg aggagggtgt 2580

gtgtggaatt cgatcagcca ctcgtctcga gaacatcatg tggaagcaaa tatcaaatga 2640

attaaaccac atcttacttg aaaatgacat gaaatttaca gtggtcgtag gagacgttag 2700

tggaatcttg gcccaaggaa agaaaatgat taggccacaa cccatggaac acaaatactc 2760

gtggaaaagc tggggaaaag ccaaaatcat aggagcagat gtacagaata ccaccttcat 2820

catcgacggc ccaaacaccc cagaatgccc tgataaccaa agagcatgga acatttggga 2880

agttgaagac tatggatttg gaattttcac gacaaacata tggttgaaat tgcgtgactc 2940

ctacactcaa gtgtgtgacc accggctaat gtcagctgcc atcaaggata gcaaagcagt 3000

ccatgctgac atggggtact ggatagaaag tgaaaagaac gagacttgga agttggcaag 3060

agcctccttc atagaagtta agacatgcat ctggccaaaa tcccacactc tatggagcaa 3120

tggagtcctg gaaagtgaga tgataatccc aaagatatat ggaggaccaa tatctcagca 3180

caactacaga ccaggatatt tcacacaaac agcagggccg tggcacttgg gcaagttaga 3240

actagatttt gatttatgtg aaggtaccac tgttgttgtg gatgaacatt gtggaaatcg 3300

aggaccatct cttagaacca caacagtcac aggaaagaca atccatgaat ggtgctgtag 3360

atcttgcacg ttaccccccc tacgtttcaa aggagaagac gggtgctggt acggcatgga 3420

aatcagacca gtcaaggaga aggaagagaa cctagttaag tcaatggtct ctgcagggtc 3480

aggagaagtg gacagttttt cactaggact gctatgcata tcaataatga tcgaagaggt 3540

aatgagatcc agatggagca gaaaaatgct gatgactgga acattggctg tgttcctcct 3600

tctcacaatg ggacaattga catggaatga tctgatcagg ctatgtatca tggttggagc 3660

caacgcttca gacaagatgg ggatgggaac aacgtaccta gctttgatgg ccactttcag 3720

aatgagacca atgttcgcag tcgggctact gtttcgcaga ttaacatcta gagaagttct 3780

tcttcttaca gttggattga gtctggtggc atctgtagaa ctaccaaatt ccttagagga 3840

gctaggggat ggacttgcaa tgggcatcat gatgttgaaa ttactgactg attttcagtc 3900

acatcagcta tgggctacct tgctgtcttt aacatttgtc aaaacaactt tttcattgca 3960

ctatgcatgg aagacaatgg ctatgatact gtcaattgta tctctcttcc ctttatgcct 4020

gtccacgact tctcaaaaaa caacatggct tccggtgttg ctgggatctc ttggatgcaa 4080

accactaacc atgtttctta taacagaaaa caaaatctgg ggaaggaaaa gctggcctct 4140

caatgaagga attatggctg ttggaatagt tagcattctt ctaagttcac ttctcaagaa 4200

tgatgtgcca ctagctggcc cactaatagc tggaggcatg ctaatagcat gttatgtcat 4260

atctggaagc tcggccgatt tatcactgga gaaagcggct gaggtctcct gggaagaaga 4320

agcagaacac tctggtgcct cacacaacat actagtggag gtccaagatg atggaaccat 4380

gaaaataaag gatgaagaga gagatgacac actcaccatt ctcctcaaag caactctgct 4440

agcaatctca ggggtatacc caatgtcaat accggcgacc ctctttgtgt ggtatttttg 4500

gcagaaaaag aaacagagat caggagtgct atgggacaca cccagccctc cagaagtgga 4560

aagagcagtc cttgatgatg gcatttatag aattctccaa agaggattgt tgggcaggtc 4620

tcaagtggga gtaggagttt ttcaagaagg cgtgttccac acaatgtggc acgtcaccag 4680

gggagctgtc ctcatgtacc aagggaagag actggaacca agttgggcca gtgtcaaaaa 4740

agacttgatc tcatatggag gaggttggag gtttcaagga tcctggaacg cgggagaaga 4800

agtgcaggtg attgctgttg aaccggggaa gaaccccaaa aatgtacaga cagcgccggg 4860

taccttcaag acccctgaag gcgaagttgg agccatagct ctagacttta aacccggcac 4920

atctggatct cctatcgtga acagagaggg aaaaatagta ggtctttatg gaaatggagt 4980

ggtgacaaca agtggtacct acgtcagtgc catagctcaa gctaaagcat cacaagaagg 5040

gcctctacca gagattgagg acgaggtgtt taggaaaaga aacttaacaa taatggacct 5100

acatccagga tcgggaaaaa caagaagata ccttccagcc atagtccgtg aggccataaa 5160

aagaaagctg cgcacgctag tcttagctcc cacaagagtt gtcgcttctg aaatggcaga 5220

ggcgctcaag ggaatgccaa taaggtatca gacaacagca gtgaagagtg aacacacggg 5280

aaaggagata gttgacctta tgtgtcacgc cactttcact atgcgtctcc tgtctcctgt 5340

gagagttccc aattataata tgattatcat ggatgaagca catttcaccg atccagccag 5400

catagcagcc agagggtata tctcaacccg agtgggtatg ggtgaagcag ctgcgatttt 5460

catgacagcc actccccccg gatcggtgga ggcctttcca cagagcaatg cagttatcca 5520

agatgaggaa agagacattc ctgaaagatc atggaactca ggctatgact ggatcactga 5580

tttcccaggt aaaacagtct ggtttgttcc aagcatcaaa tcaggaaatg acattgccaa 5640

ctgtttaaga aagaatggga aacgggtggt ccaattgagc agaaaaactt ttgacactga 5700

gtaccagaaa acaaaaaata acgactggga ctatgttgtc acaacagaca tatccgaaat 5760

gggagcaaac ttccgagccg acagggtaat agacccgagg cggtgcctga aaccggtaat 5820

actaaaagat ggcccagagc gtgtcattct agccggaccg atgccagtga ctgtggctag 5880

cgccgcccag aggagaggaa gaattggaag gaaccaaaat aaggaaggcg atcagtatat 5940

ttacatggga cagcctctaa aaaatgatga ggaccacgcc cattggacag aagcaaaaat 6000

gctccttgac aacataaaca caccagaagg gattatccca gccctctttg agccggagag 6060

agaaaagagt gcagcaatag acggggaata cagactacgg ggtgaagcga ggaaaacgtt 6120

cgtggagctc atgagaagag gagatctacc tgtctggcta tcctacaaag ttgcctcaga 6180

aggcttccag tactccgaca gaaggtggtg ctttgatggg gaaaggaaca accaggtgtt 6240

ggaggagaac atggacgtgg agatctggac aaaagaagga gaaagaaaga aactacgacc 6300

ccgctggctg gatgccagaa catactctga cccactggct ctgcgcgaat tcaaagagtt 6360

cgcagcagga agaagaagcg tctcaggtga cctaatatta gaaataggga aacttccaca 6420

acatttaacg caaagggccc agaacgcctt ggacaatctg gttatgttgc acaactctga 6480

acaaggagga aaagcctata gacacgccat ggaagaacta ccagacacca tagaaacgtt 6540

aatgctccta gctttgatag ctgtgctgac tggtggagtg acgttgttct tcctatcagg 6600

aaggggtcta ggaaaaacat ccattggcct actctgcgtg attgcctcaa gtgcactgtt 6660

atggatggcc agtgtggaac cccattggat agcggcctct atcatactgg agttctttct 6720

gatggtgttg cttattccag agccggacag acagcgcact ccacaagaca accagctagc 6780

atacgtggtg ataggtctgt tattcatgat attgacagtg gcagccaatg agatgggatt 6840

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tgctgcaatg ctggacgtag acctacatcc agcttcagcc tggactctct acgcagtggc 6960

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attcatggaa gacatgggga aaagcaaaaa tcttcacccc agaagcaaga aatagcacat 2820

ttttaataga cggaccagac acctctgaat gccccaatga acgaagagca tggaactctc 2880

ttgaggtgga agactatgga tttggcatgt tcacgaccaa catatggatg aaattccgag 2940

aaggaagttc agaagtgtgt gaccacaggt taatgtcagc tgcaattaaa gatcagaaag 3000

ctgtgcatgc tgacatgggt tattggatag agagctcaaa aaaccagacc tggcagatag 3060

agaaagcatc tcttattgaa gtgaaaacat gtctgtggcc caagacccac acactgtgga 3120

gcaatggagt gctggaaagc cagatgctca ttccaaaatc atatgcgggc cctttttcac 3180

agcacaatta ccgccagggc tatgccacgc aaaccgtggg cccatggcac ttaggcaaat 3240

tagagataga ctttggagaa tgccccggaa caacagtcac aattcaggag gattgtgacc 3300

atagaggccc atctttgagg accaccactg catctggaaa actagtcacg caatggtgct 3360

gccgctcctg cacgatgcct cccttaaggt tcttgggaga agatgggtgc tggtatggga 3420

tggagattag gcccttgagt gaaaaagaag agaacatggt caaatcacag gtgacggccg 3480

gacagggcac atcagaaact ttttctatgg gtctgttgtg cctgaccttg tttgtggaag 3540

aatgcttgag gagaagagtc actaggaaac acatgatatt agttgtggtg atcactcttt 3600

gtgctatcat cctgggaggc ctcacatgga tggacttact acgagccctc atcatgttgg 3660

gggacactat gtctggtaga ataggaggac agatccacct agccatcatg gcagtgttca 3720

agatgtcacc aggatacgtg ctgggtgtgt ttttaaggaa actcacttca agagagacag 3780

cactaatggt aataggaatg gccatgacaa cggtgctttc aattccacat gaccttatgg 3840

aactcattga tggaatatca ctgggactaa ttttgctaaa aatagtaaca cagtttgaca 3900

acacccaagt gggaacctta gctctttcct tgactttcat aagatcaaca atgccattgg 3960

tcatggcttg gaggaccatt atggctgtgt tgtttgtggt cacactcatt cctttgtgca 4020

ggacaagctg tcttcaaaaa cagtctcatt gggtagaaat aacagcactc atcctaggag 4080

cccaagctct gccagtgtac ctaatgactc ttatgaaagg agcctcaaga agatcttggc 4140

ctcttaacga gggcataatg gctgtgggtt tggttagtct cttaggaagc gctcttttaa 4200

agaatgatgt ccctttagct ggcccaatgg tggcaggagg cttacttctg gcggcttacg 4260

tgatgagtgg tagctcagca gatctgtcac tagagaaggc cgccaacgtg cagtgggatg 4320

aaatggcaga cataacaggc tcaagcccaa tcatagaagt gaagcaggat gaagatggct 4380

ctttctccat acgggacgtc gaggaaacca atatgataac ccttttggtg aaactggcac 4440

tgataacagt gtcaggtctc taccccttgg caattccagt cacaatgacc ttatggtaca 4500

tgtggcaagt gaaaacacaa agatcaggag ccctgtggga cgtcccctca cccgctgcca 4560

ctaaaaaagc cgcactgtct gaaggagtgt acaggatcat gcaaagaggg ttattcggga 4620

aaactcaggt tggagtaggg atacacatgg aaggtgtatt tcacacaatg tggcatgtaa 4680

caagaggatc agtgatctgc cacgagactg ggagattgga gccatcttgg gctgacgtca 4740

ggaatgacat gatatcatac ggtgggggat ggaggcttgg agacaaatgg gacaaagaag 4800

aagacgttca ggtcctcgcc atagaaccag gaaaaaatcc taaacatgtc caaacgaaac 4860

ctggcctttt caagacccta actggagaaa ttggagcagt aacattagat ttcaaacccg 4920

gaacgtctgg ttctcccatc atcaacagga aaggaaaagt catcggactc tatggaaatg 4980

gagtagttac caaatcaggt gattacgtca gtgccataac gcaagccgaa agaattggag 5040

agccagatta tgaagtggat gaggacattt ttcgaaagaa aagattaact ataatggact 5100

tacaccccgg agctggaaag acaaaaagaa ttcttccatc aatagtgaga gaagccttaa 5160

aaaggaggct acgaactttg attttagctc ccacgagagt ggtggcggcc gagatggaag 5220

aggccctacg tggactgcca atccgttatc agaccccagc tgtgaaatca gaacacacag 5280

gaagagagat tgtagacctc atgtgtcatg caaccttcac aacaagactt ttgtcatcaa 5340

ccagggttcc aaattacaac cttatagtga tggatgaagc acatttcacc gatccttcta 5400

gtgtcgcggc tagaggatac atctcgacca gggtggaaat gggagaggca gcagccatct 5460

tcatgaccgc aacccctccc ggagcgacag atccctttcc ccagagcaac agcccaatag 5520

aagacatcga gagggaaatt ccggaaaggt catggaacac agggttcgac tggataacag 5580

actaccaagg gaaaactgtg tggtttgttc ccagcataaa agctggaaat gacattgcaa 5640

attgtttgag aaagtcggga aagaaagtta tccagttgag taggaaaacc tttgatacag 5700

agtatccaaa aacgaaactc acggactggg actttgtggt cactacagac atatctgaaa 5760

tgggggccaa ttttagagcc gggagagtga tagaccctag aagatgcctc aagccagtta 5820

tcctaccaga tgggccagag agagtcattt tagcaggtcc tattccagtg actccagcaa 5880

gcgctgctca gagaagaggg cgaataggaa ggaacccagc acaagaagac gaccaatacg 5940

ttttctccgg agacccacta aaaaatgatg aagatcatgc ccactggaca gaagcaaaga 6000

tgctgcttga caatatctac accccagaag ggatcattcc aacattgttt ggtccggaaa 6060

gggaaaaaac ccaagccatt gatggagagt ttcgcctcag aggggaacaa aggaagactt 6120

ttgtggaatt aatgaggaga ggagaccttc cggtgtggct gagctataag gtagcttctg 6180

ctggcatttc ttacaaagat cgggaatggt gcttcacagg ggaaagaaat aaccaaattt 6240

tagaagaaaa catggaggtt gaaatttgga ctagagaggg agaaaagaaa aagctaaggc 6300

caagatggtt agatgcacgt gtatacgctg accccatggc tttgaaggat ttcaaggagt 6360

ttgccagtgg aaggaagagt ataactctcg acatcctaac agagattgcc agtttgccaa 6420

cttacctttc ctctagggcc aagctcgccc ttgataacat agtcatgctc cacacaacag 6480

aaagaggagg gagggcctat caacacgccc tgaacgaact tccggagtca ctggaaacac 6540

tcatgcttgt agctttacta ggtgctatga cagcaggcat cttcctgttt ttcatgcaag 6600

ggaaaggaat agggaaattg tcaatgggtt tgataaccat tgcggtggct agtggcttgc 6660

tctgggtagc agaaattcaa ccccagtgga tagcggcctc aatcatacta gagttttttc 6720

tcatggtact gttgataccg gaaccagaaa aacaaaggac cccacaagac aatcaattga 6780

tctacgtcat attgaccatt ctcaccatca ttggtctaat agcagccaac gagatggggc 6840

tgattgaaaa aacaaaaacg gattttgggt tttaccaggt aaaaacagaa accaccatcc 6900

tcgatgtgga cttgagacca gcttcagcat ggacgctcta tgcagtagcc accacaattc 6960

tgactcccat gctgagacac accatagaaa acacgtcggc caacctatct ctagcagcca 7020

ttgccaacca ggcagccgtc ctaatggggc ttggaaaagg atggccgctc cacagaatgg 7080

acctcggtgt gccgctgtta gcaatgggat gctattctca agtgaaccca ataaccttga 7140

cagcatcctt agtcatgctt ttcgtccatt atgcaataat aggcccagga ttgcaggcaa 7200

aagccacaag agaggcccag aaaaggacag ctgctgggat catgaaaaat cccacagtgg 7260

acgggataac agtaatagat ctagaaccaa tatcctatga cccaaaattt gaaaagcaat 7320

tagggcaggt catgctacta gtcttgtgtg ctggacaact actcttgatg agaacaacat 7380

gggctttctg tgaagtcttg actttggcca caggaccaat cttgaccttg tgggagggca 7440

acccgggaag gttttggaac acgaccatag ccgtatccac cgccaacatt ttcaggggaa 7500

gttacttggc gggagctgga ctggcttttt cactcataaa gaatgcacaa acccctagga 7560

ggggaactgg gaccacagga gagacactgg gagagaagtg gaagagacag ctaaactcat 7620

tagacagaaa agagtttgaa gagtataaaa gaagtggaat actagaagtg gacaggactg 7680

aagccaagtc tgccctgaaa gatgggtcta aaatcaagca tgcagtatca agagggtcca 7740

gtaagatcag atggattgtt gagagaggga tggtaaagcc aaaagggaaa gttgtagatc 7800

ttggctgtgg gagaggagga tggtcttatt acatggcgac actcaagaac gtgactgaag 7860

tgaaagggta tacaaaagga ggtccaggac atgaagaacc gattcccatg gctacttatg 7920

gttggaattt ggtcaaactc cattcagggg ttgacgtgtt ctacaaaccc acagagcaag 7980

tggacaccct gctctgtgat attggggagt catcttctaa tccaacaata gaggaaggaa 8040

gaacattaag agttttgaag atggtggagc catggctctc ttcaaaacct gaattctgca 8100

tcaaagtcct taacccctac atgccaacag tcatagaaga gctggagaaa ctgcagagaa 8160

aacatggtgg gaaccttgtc agatgcccgc tgtccaggaa ctccacccat gagatgtatt 8220

gggtgtcagg agcgtcggga aacattgtga gctctgtgaa cacaacatca aagatgttgt 8280

tgaacaggtt cacaacaagg cataggagac ctacttatga gaaggacgta gatcttgggg 8340

caggaacgag aagtgtctcc actgaaacag aaaaaccaga catgacaatc attgggagaa 8400

ggcttcagcg attgcaagaa gagcacaaag aaacctggca ttatgatcag gaaaacccat 8460

acagaacctg ggcgtatcat ggaagctatg aagctccttc gacaggctct gcatcctcca 8520

tggtgaacgg ggtggtaaaa ctgctaacaa aaccctggga tgtgattcca atggtgactc 8580

agttagccat gacagataca accccttttg ggcaacaaag agtgttcaaa gagaaggtgg 8640

ataccagaac accacaacca aaacccggta cacgaatggt tatgaccacg acagccaatt 8700

ggctgtgggc cctccttgga aagaagaaaa atcccagact gtgcacaagg gaagagttca 8760

tctcaaaagt tagatcaaac gcagccatag gcgcagtctt tcaggaagaa cagggatgga 8820

catcagccag tgaagctgtg aatgacagcc ggttttggga actggttgac aaagaaaggg 8880

ccctacacca ggaagggaaa tgtgaatcgt gtgtctataa catgatggga aaacgtgaga 8940

aaaagttagg agagtttggc agagccaagg gaagccgagc aatctggtac atgtggctgg 9000

gagcgcggtt tctggaattt gaagccctgg gttttttgaa tgaagatcac tggtttggca 9060

gagaaaattc atggagtgga gtggaagggg aaggtctgca cagattggga tatatcctgg 9120

aggagataga caagaaggat ggagacctaa tgtatgctga tgacacagca ggctgggaca 9180

caagaatcac tgaggatgac cttcaaaatg aggaactgat cacggaacag atggctcccc 9240

accacaagat cctagccaaa gccattttca aactaaccta tcaaaacaaa gtggtgaaag 9300

tcctcagacc cacaccgcgg ggagcggtga tggatatcat atccaggaaa gaccaaagag 9360

gtagtggaca agttggaaca tatggtttga acacattcac caacatggaa gttcaactca 9420

tccgccaaat ggaagctgaa ggagtcatca cacaagatga catgcagaac ccaaaagggt 9480

tgaaagaaag agttgagaaa tggctgaaag agtgtggtgt cgacaggtta aagaggatgg 9540

caatcagtgg agacgattgc gtggtgaagc ccctagatga gaggtttggc acttccctcc 9600

tcttcttgaa cgacatggga aaggtgagga aagacattcc gcagtgggaa ccatctaagg 9660

gatggaaaaa ctggcaagag gttccttttt gctcccacca ctttcacaag atctttatga 9720

aggatggccg ctcactagtt gttccatgta gaaaccagga tgaactgata gggagagcca 9780

gaatctcgca gggagctgga tggagcttaa gagaaacagc ctgcctgggc aaagcttacg 9840

cccagatgtg gtcgcttatg tacttccaca gaagggatct gcgtttagcc tccatggcca 9900

tatgctcagc agttccaacg gaatggtttc caacaagcag aacaacatgg tcaatccacg 9960

ctcatcacca gtggatgacc actgaagata tgctcaaagt gtggaacaga gtgtggatag 10020

aagacaaccc taatatgact gacaagactc cagtccattc gtgggaagat ataccttacc 10080

tagggaaaag agaggatttg tggtgtggat ccctgattgg actttcttcc agagccacct 10140

gggcgaagaa cattcacacg gccataaccc aggtcaggaa cctgatcgga aaagaggaat 10200

acgtggatta catgccagta atgaaaagat acagtgctcc ttcagagagt gaaggagttc 10260

tgtaattacc aacaacaaac accaaaggct attgaagtca ggccacttgt gccacggttt 10320

gagcaaaccg tgctgcctgt agctccgcca ataatgggag gcgtaataat ccccagggag 10380

gccatgcgcc acggaagctg tacgcgtggc atattggact agcggttaga ggagacccct 10440

cccatcactg acaaaacgca gcaaaagggg gcccaagact agaggttaga ggagaccccc 10500

ccaacacaaa aacagcatat tgacgctggg aaagaccaga gatcctgctg tctctgcaac 10560

atcaatccag gcacagagnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnn 10618

Claims (16)

1.一种用于制备减毒四价登革热疫苗的方法，其包括：

(i)在培养物中扩增第123代的Vero细胞，以产生Vero细胞的主库和工作库，其中，所述Vero细胞适于在无血清培养基中生长，并在无血清培养基中在225cm²组织培养烧瓶中通过连续传代长成，其使用非动物源的胰蛋白酶以分离所述细胞，并随后在细胞工厂系统^TM中扩增所述细胞；

(ii)用来自每个病毒的种子或工作库的减毒登革热病毒血清型1、2、3和4感染来自主库或工作库的Vero细胞，其中，所述Vero细胞悬浮液在搅拌下独立地感染分别在具有无血清培养基的培养物中的减毒登革热病毒血清型1、2、3和4，以获得将用于制备所述病毒体的培养物，其中DENV1和DENV4的感染复数为0.01至0.03；DENV2的感染复数为0.02至0.04；DENV3的感染复数为0.05至0.08；并且其中所述每个病毒的种子和工作库通过在225cm²组织培养烧瓶中或在多层细胞系统中感染来自主库和工作库的Vero细胞制备的；

(iii)在培养箱中在36.5℃±1℃下培育含有在步骤(ii)中获得的所述受每种登革热病毒感染的Vero细胞的225cm² TC烧瓶或细胞工厂系统^TM10天至20天；

(iv)通过连续收集感染的培养物的上清液收集每种培养物的上清液，同时更换培养基，其中可以在病毒生产周期期间执行最高达8次收集上清液；

(v)通过具有0.2μm孔隙度的膜过滤来自步骤(iv)的每种登革热病毒悬浮液，并在-80℃±5℃下存储该过滤后的登革热病毒；

(vi)通过浓缩所述收集的病毒上清液、通过切向过滤纯化所述浓缩物、以及使其在0.2μm膜中过滤来制备所述血清型1、2、3和4的登革热病毒体；

(vii)配制四种单价疫苗，每个革登热血清型各一种；

(viii)通过混合所述单价疫苗来配制所述四价疫苗；

(ix)用所述四价疫苗填充小瓶；

(x)将所述小瓶中的所述四价疫苗冻干；

(xi)将所述冻干的四价疫苗密封在所述小瓶中；且

(xii)在2℃至8℃储存冻干且密封的产品，从而制备所述减毒四价登革热疫苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述上清液在步骤(iv)中收集，相同体积的无血清培养基被添加到所述培养物，并且步骤(iii)和(iv)被重复。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤(iii)和步骤(iv)重复一次至七次。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所使用的登革热病毒株是如SEQ ID NO：1所示的rDEN1Δ30-1545或其变体；如SEQ ID NO：2所示的rDEN2/4Δ30(ME)-1495，7163或其变体；如SEQ ID NO：3所示的rDEN3Δ30/31-7164或其变体以及如SEQ ID NO：4所示的rDEN4Δ30-7132，7163，8308或其变体。

5.一种用于制备减毒四价登革热疫苗的方法，其包括：

(i)在培养物中扩增第123代的Vero细胞，以产生Vero细胞的主库和工作库，其中，所述Vero细胞适于在无血清培养基中生长，并在无血清培养基中通过在225cm²组织培养(TC)烧瓶中连续传代长成，其使用非动物源的胰蛋白酶以分离所述细胞，并且然后随后在多层细胞系统中扩增所述Vero细胞；

(ii)用来自每种病毒的种子或工作库的减毒登革热病毒血清型1、2、3和4感染来自所述主库或工作库的Vero细胞，其中，所述Vero细胞在搅拌下独立地感染分别在具有无血清培养基的培养物中的减毒登革热病毒血清型1、2、3和4，以获得将用于制备所述病毒体的培养物，其中DENV1和DENV4的感染复数为0.01至0.03；DENV2的感染复数为0.02至0.04；且DENV3的感染复数为0.05至0.08；并且其中所述每个病毒的种子和工作库通过在225cm²组织培养烧瓶中或在多层细胞系统中感染来自主库和工作库的Vero细胞制备的；

(iii)在组织培养烧瓶或细胞工厂系统^TM中在36.5℃±1℃下培育在以上步骤(ii)获得的受每种登革热病毒感染的所述Vero细胞，DENV1和DENV4持续10-15天，DENV2持续12-17天，并且DENV3持续13-20天；

(iv)通过连续收集感染的培养物的上清液收集每种培养物的上清液，同时更换培养基，其中可以在病毒生产周期期间执行最高达8次收集上清液；

(v)通过具有0.2μm孔隙度的膜过滤来自步骤(iv)的每种登革热病毒悬浮液，并在-80℃±5℃下储存该过滤后的登革热病毒；

(vi)通过浓缩所述收集的病毒上清液、通过切向过滤纯化所述浓缩物、以及使其在0.2μm膜中过滤来配制所述血清型1、2、3和4的登革热病毒体；

(vii)用革登热病毒体配制单价疫苗；以及

(viii)通过混合所述单价疫苗来配制四价疫苗。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述所用的Vero细胞系是ATCC CCL-81.4。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述上清液在步骤(iv)中被收集，相同体积的无血清培养基被添加到所述培养物，以及步骤(iii)和步骤(iv)被重复。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤(iii)和步骤(iv)重复一次至七次。

9.根据权利要求5所述的方法，其中，所述所使用的登革热病毒株是如SEQ ID NO：1所示的rDEN1Δ30-1545或其变体；如所示SEQ ID NO：2的rDEN2/4Δ30(ME)-1495，7163或其变体；如SEQ ID NO：3所示的rDEN3Δ30/31-7164或其变体以及如SEQ ID NO：4所示的rDEN4Δ30-7132、7163、8308或其变体。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述登革热病毒株对每种登革热血清型的感染复数为：针对DENV1和DENV4为0.01至0.03，针对DENV2为0.02至0.04，以及针对DENV3为0.05至0.08。

11.根据权利要求5所述的方法，其中，所述单价疫苗以相同的体积比混合以获得所述减毒四价登革热疫苗1、2、3、4。

12.根据权利要求5所述的方法，其还包括：用所述四价疫苗填充小瓶的步骤；将所述小瓶中的所述四价疫苗冻干；将所述冻干的四价疫苗密封在所述小瓶中；在2℃至8℃储存所述冻干且密封的产品。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，在所述冻干处理中使用的参数为：在-30℃至-50℃冷冻，在20μbar至100μbar真空，从-30℃至-50℃持续36小时至42小时以及-5℃至-10℃的初次干燥持续18小时至24小时，25℃至29℃的二次干燥持续8小时至15小时。

14.一种用于制备向受试者施用的四价登革热疫苗的方法，其包括在包含0.2M磷酸二氢钠一水合物、0.2M磷酸氢二钠七水合物和水的组合物中重建密封并且冻干的按照权利要求1中的方法生产的减毒四价革登热疫苗的步骤。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述密封并且冻干的疫苗在5毫升所述组合物中重建。

16.一种包括按照权利要求1中的方法生产的减毒四价登革热疫苗和重建组合物的四价登革热疫苗试剂盒，所述重建组合物包含0.2M磷酸二氢钠一水合物、0.2M磷酸氢二钠七水合物和水。

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