CN103341162A

CN103341162A - 一种猪传染性胃肠炎冻干疫苗

Info

Publication number: CN103341162A
Application number: CN2013102782403A
Authority: CN
Inventors: 胡潇; 邹桂荣; 李芳�; 王龙; 张维; 孙健
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2013-07-03
Filing date: 2013-07-03
Publication date: 2013-10-09

Abstract

本发明涉及一种猪传染性胃肠炎冻干疫苗，由作为抗原的猪传染性胃肠炎病毒和保护剂组成，其中保护剂是由如下质量百分比浓度的物质组成的：2.4～4% NZ-胺、0.3～0.5%谷氨酸单钾盐、16～20%蔗糖、6～20%水解乳蛋白、1～1.6%明胶；余量为水。本发明的疫苗所用到的冻干保护剂采用的原料成本低，操作简单，可以大规模生产。由该保护剂制备的疫苗在2～8℃条件下保存24个月后，疫苗效价均≥10^5.7TCID₅₀/头份（国标），从而有效的延长了疫苗的保存期限。

Description

一种猪传染性胃肠炎冻干疫苗

技术领域

本发明属于兽用疫苗技术领域，具体涉及一种猪传染性胃肠炎冻干疫苗。

背景技术

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis of pigs,TGE)是猪的一种高度接触性的病毒性传染病，主要引起2周龄以下的仔猪呕吐、严重腹泻和脱水。目前在国内，该病的发病率逐年上升，有的猪场阳性率达 40 %以上，已经成为集约化猪场的主要传染病之一。当前养猪业集约化程度较高，饲养密度大，各种应激因素均可促进本病的发生。在当前众多的猪传染性疾病中，猪传染性胃肠炎的发生较为严重，直接危害猪的健康发展，给养猪业带来了巨大的经济损失。

目前，弱毒活疫苗是预防畜禽传染病的主要疫苗之一，在我国动物疫苗中，活疫苗占相当大的比例。国内疫苗企业常用的冻干保护剂组方简单，保护性能差，如果在2～8℃条件下保存，保存期只有短短的3～6个月，大多需要在-15℃条件下保存，使疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制，加上基层防疫部门缺乏必要的冷冻和冷藏设施，容易因疫苗保存温度不当而使效价大打折扣，最终导致免疫失败而造成疫病流行。所以，耐热保护剂的研究十分必需。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪传染性胃肠炎冻干疫苗，即一种可以在2～8℃条件下长期保存仍能保持疫苗效价的耐热型猪传染性胃肠炎冻干疫苗。

本发明的猪传染性胃肠炎冻干疫苗，由猪传染性胃肠炎病毒抗原和保护剂组成，其中保护剂的组成如下：2.4～4% NZ-胺、0.3～0.5%谷氨酸单钾盐、20～25%蔗糖、1.5～2.5%水解乳蛋白、4～6%明胶；余量为水。

上述的猪传染性胃肠炎冻干疫苗中还加入了青霉素和链霉素，其终浓度分别为青霉素100IU/ml，链霉素80μg/ml。

上述的耐热冻干保护剂，其制备方法如下：

1）首先称取NZ-胺、谷氨酸单钾盐、蔗糖和水解乳蛋白，溶解后过滤除菌制成过滤液；

2）称取明胶加入到沸水中，搅拌直至完全溶解，高压灭菌制成明胶溶液；

3）将步骤1）制备的过滤液和步骤2）的明胶溶液混合，制成冻干保护剂。

其中步骤1）的过滤除菌是用0.22μm滤膜过滤除菌。

本发明的疫苗所用到的冻干保护剂采用的原料成本低，操作简单，可以大规模生产。由该保护剂制备的疫苗在2～8℃条件下保存24个月后，疫苗的保护率仍可达到90%以上，从而有效的延长了疫苗的保存期限。

具体实施方式

在疫苗的冻干保护剂制备领域中，保护剂组分的选择及配比对疫苗的保存效果具有重要的影响。为了使本发明的猪瘟疫苗能够长期保存，申请人对本发明冻干保护剂的组分进行了长期的研究，并优化了彼此间的配比浓度，从而使各组分之间具有最大的复配效果。

对于本发明冻干保护剂所使用的组分描述如下：

1、NZ胺（NZ amine casein hydrolysate），又称为酪蛋白的酶促水解物；

2、谷氨酸单钾盐：是一种表面活性剂，可降低界面的张力，在冻结和脱水过程中既能降低冰、水界面张力所引起的冻结和脱水变形，又能在复水过程中对活性组分起到润湿剂作用。

3、水解乳蛋白又称水解乳清蛋白，是蛋白酶水解浓缩乳清蛋白或乳白蛋白的产物，含足量的必须氨基酸。

4、蔗糖具有渗透作用，能抑制有害微生物生长，延长产品保藏期，具有很好的水溶性。可提高微生物存活率，形成均一悬液，起到水分缓解作用，可防止活性组分变性。

5、明胶可去掉杂质蛋白、无抗原性、无过敏反应、无热源，并且分子量小、均质、易溶于水，可过滤除菌，共熔点为-12℃，对微生物有保护作用，可促进其升华形成冻干骨架阻断热传导和热辐射，能防止有效物质随水蒸气一起升华飞散并使之成形。对微生物的保护作用高出普通明胶10％以上

对于本发明冻干保护剂的组分选用市场上已有的产品，例如NZ-胺购自SIGMA公司，谷氨酸单钾盐购自SIGMA，水解乳蛋白购自GIBCO，蔗糖购自德国默克，明胶购自SIGMA。

本发明所用到的猪传染性胃肠炎病毒毒株选用已报道的毒株，例如购自中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心，编号为CVCCAV1412的猪传染性胃肠炎病毒株。

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一、冻干保护剂的配制：分A液和B液两部分。

1）A液配制：称取NZ-胺48g、谷氨酸单钾盐 6g、蔗糖 400g、水解乳蛋白30g；将以上成分按顺序溶于800ml注射用水中，充分溶解后摇匀，补充注射用水至1000ml后摇匀，用0.22μm滤膜过滤除菌， 37℃温室中保存备用。

2）B液配制：取明胶80g，用800ml70-80℃的注射用水充分溶解后，补充注射用水至1000ml后搅匀，121℃、15磅高压灭菌30分钟，灭菌后保存在37℃。

3）按A液：B液=1：1的体积比例进行配比，混合均匀即为耐热冻干保护剂。

二、制备猪传染性胃肠炎冻干疫苗

1、猪传染性胃肠炎病毒液的制备

①ST细胞的复苏、培养：从液氮中取出冻存的ST细胞(购自美国ATCC细胞库)冻存管，迅速放在37℃水浴中使其快速融化。将每个冻存管中的细胞转移至盛有5ml细胞生长液的离心管中，500r/min离心5分钟，弃去上清液，用10ml细胞生长液（含10%小牛血清、1%L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、80ug/ml链霉素的MEM营养液）重悬细胞，将细胞移入一次性进口细胞培养瓶中吹打均匀，置37℃、5%CO2培养箱中静止培养。48～72小时形成良好单层后，弃去生长液，用PBS洗细胞面2次，用细胞消化液（0.25%胰酶-0.02%EDTA）将细胞消化下来，待细胞面出现针尖大小的缝隙时，吸弃细胞消化液，轻拍细胞瓶，细胞沿瓶壁均与脱落，此时用吸管吸取细胞生长液，轻轻吹打分散细胞，使细胞分散为单个细胞，将分散的细胞悬液按1：3～1：4的比例进行扩大培养。

②病毒的增殖：当细胞长满瓶壁的80%～90%时，将猪传染性胃肠炎病毒接种到细胞单层上，补足细胞维持液（MEM营养液中含2%小牛血清，100IU/ml青霉素、80ug/ml链霉素，pH7.4～7.6）置35℃～36℃培养，每天观察细胞病变，待细胞病变达到75%～80%时，收获猪传染性胃肠炎病毒培养液，-20℃冷库中保存备用。

2、将收获的猪传染性胃肠炎病毒经无菌检验和病毒含量测定，合格的病毒液与制备的保护剂按体积比4：1的比例进行混合，按比例加入青、链霉素，使其终浓度分别为青霉素100IU/ml、链霉素80μg/ml，充分摇匀，定量分装后迅速进行冷冻真空干燥。

3、将分装好的病毒液装入冻干机箱内，选取预冻温度为-50℃、预冻时低温保持时间为2h、预冻前期控制在-15℃，待产品释放解吸热后快速冷冻：升华阶段产品温度为-33℃、板层温度设定为-8℃、升华时间为11h；解吸温度为26℃、解吸时间为4h,冻干全过程为24h，加塞出箱，得到猪传染性胃肠炎活疫苗。

实施例2

一、冻干保护剂的配制：

1）A液配制：称取NZ-胺80g、谷氨酸单钾盐10g、蔗糖500g、水解乳蛋白50g；将以上成分按顺序溶于800ml注射用水中，充分溶解后摇匀，补充注射用水至1000ml，用0.22μm滤膜过滤除菌， 37℃温室中保存备用。

2）B液配制：取明胶120g，用800ml70-80℃的注射用水充分溶解后，补充注射用水至1000ml，121℃、15磅高压灭菌30分钟，灭菌后保存在37℃。

3）按A液：B液=1：1的比例进行配比，混合均匀后即可作为耐热保护剂。

二、疫苗的制备

1、猪传染性胃肠炎病毒经培养后，进行无菌检验和病毒含量测定，将合格的病毒液和配制好的冻干保护剂按4：1的比例混合后，按比例加入青、链霉素，使其终浓度分别为青霉素100IU/ml、链霉素80ug/ml，充分摇匀，定量分装后迅速进行冷冻真空干燥。

2、将分装好的病毒液装入冻干机箱内，选取预冻温度为-45℃、预冻时低温保持时间为3h、预冻前期控制在-18℃，待产品释放解吸热后快速冷冻：升华阶段产品温度为-35℃、板层温度设定为-10℃、升华时间为12h；解吸温度为24℃、解吸时间为3h,冻干全过程为24h，加塞出箱，得到猪传染性胃肠炎活疫苗。

实施例制备的冻干产品的各项指标测试

（1）加入本发的冻干保护剂的猪传染性胃肠炎疫苗与普通冻干保护剂制备的猪传染性胃肠炎疫苗的比较

取无猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）中和抗体的仔猪每组20头，分别免疫本发明疫苗、普通冻干保护剂制备的猪传染性胃肠炎疫苗以及空白病毒培养液，结果为本发明的疫苗免疫组的中和抗体效价比普通冻干保护剂制备的疫苗高4倍，结果如下：

（2）将不同实施案例冻干的产品，置于37℃耐老化7日，测定其性状、真空度、剩余水分、效价，结果如下。

表1冻干样品37℃保存不同时间性状、真空度、剩余水分、TCID₅₀检测结果

上表说明，用耐热保护剂冻干的产品，置于37℃耐老化7日和10日后，分别测定其效价，结果均高于国标规定的10^5.7TCID₅₀/头份；而用普通冻干保护剂冻干的产品，置于37℃耐老化7日，其效价还高于国标，但置于37℃耐老化10日后，其效价远远低于国标的要求。因此，耐热保护剂保护病毒的效果明显好于普通冻干保护剂。

（3）将不同实施案例冻干的产品，置于2～8℃保存不同时间，测定其性状、真空度、剩余水分、效价，结果如下。

表2：冻干样品2～8℃保存不同时间性状、真空度、剩余水分、效价检测结果

上表说明，用本发明耐热冻干保护剂冻干的疫苗，在2～8℃条件下放置180日和360日，其效价基本不变，放置720日，其效价下降滴度在0.5以内，仍高于国标规定的标准；而用普通保护剂冻干的产品，在2～8℃条件下放180日，其效价高于国标的规定，但放置360日和720日后效价远低于国标，不可再使用，只能按报废品处理。因此，在2～8℃条件下保存的产品，本发明耐热保护剂对病毒的保护效果明显高于普通冻干保护剂。

Claims

1.一种猪传染性胃肠炎冻干疫苗，由猪传染性胃肠炎病毒抗原和保护剂组成，其中保护剂的组成如下：2.4～4% NZ-胺、0.3～0.5%谷氨酸单钾盐、20～25%蔗糖、1.5～2.5%水解乳蛋白、4～6%明胶；余量为水。

2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于还加入了青霉素和链霉素，其终浓度分别为青霉素100IU/ml，链霉素80μg/ml。

3.如权利要求1所述的疫苗，其特征在所述的耐热冻干保护剂，其制备方法如下：

3）将步骤1）制备的过滤液和步骤2）的明胶溶液混合后，制成冻干保护剂。

4.如权利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的步骤1）的过滤除菌是用0.22μm滤膜过滤除菌。

5.权利要求1所述的疫苗用于预防猪传染性胃肠炎。