SU1237081A3 - Способ производства лиофилизированной вакцины против гепатита уток - Google Patents

Description

1 .

Изобретение относитс  к ветеринарной вирусологии, в частности к способам производства лиофилизиро- ванной вакцины против гепатита уток с применением культивируемого по Ас- плину ослабленного гепатитного вируса TN.

Цель изобретени  - повышение активности и стабильности вакцины.

Культивируемый по методу Асплина ослабленный гепатитный вирус TN, хран щийс  под номером 00220 в фондах венгерского сельскохоз йственного института здравоохранени  (OKI), инъецируют в алларгтоисную полость куриных  иц.

Яйца инкубируют при температуре 37 С, собирают погибшие в течение 24-96 ч инкубации, а оставшиес  в живых эмбрионы, уничтожают в случае необходимости удал ют в стерильных услови х твердые ткани, затем гомоге- .низируют эмбрионы в стерильном физиологическом растворе хлористого натри , центрифугируют гомогенизат, ввод т антибиотик в прозрачную суспензию и лиофилизируют жидкость, известным способом после добавлени  в нее защитных коллоидов и структурообразу ющих веществ.

Под SPF- йцами понимаютс   йца,, не содержащие возбудителей Avian encephalomyelitis, чумы птиц, ЕДЗ , бронхита, лейкоза, А-В, Gumboro, Ма- rek, реовируса, а также Salmonella Gall, Salmonella typhinurium, Мусо- plasma Gall, Mycoplasma Synoviae или их антител.

При гомогенизации разбавл ют суспензию предпочтительно в таком соотношении , чтобы содержалось 25-35 сб.% эмбрионной массы и 76-65 об.% физиологического раствора хлористого натри .

В качестве защитного коллоида и структурообразующего вещества предпочтительно используют комбинацию поли винилпирролидона, желатины, глюкозы и сахарозы.

При лиофилизации полки устройства дл  лиофилизации, предназначенные дл  укладки материала, охлаждают до О - (-6)Cj а материал, наход щ:нйс  .на полках - (-30) - (-40) С, после окончани  сублимации полки нагревают до 30-40°С и сушат материал в течение 4-10 ч.

370812

Пример. SPF куриные  йца инкубируют в течение 10 сут, затем просвечивают и отмечают положение возд утной камеры и эмбриона на  ич- 5 ной скорлупе. Затем тупой конец  йца дезинфицируют. Суспензию инфицируемого вируса через проделанное над воз- Дущной камерой отверстие ввод т в аллантоисную полость. Инифицируемый. материал содержит в одном миллилитре 50000 ElDjQ. На одно  йцо используетс  0,2 мл инфицируемого материала. Затем в отверстие закрывают при помощи парафина и  йца инкубируют в ин- 5 кубаторе при 37°С. Яйца просвечиваютс  каждый день и  йца, содержащие погибщие эмбрионы,хран тс  до их дальнейшего применени  при 2-5 С. Оставшиес  в живых после 96 ч от инку- 20 бации эмбрионы уничтожаютс .

Эмбрионы извлекают в стерильных услови х их  иц,отрезают переднюю часть головы и измельчают. Затем до-, бавл ют физиологический раствор хло- ристого натри , продолжают гомогенизацию в гомогенизаторе. Массу подвергают дальнейшему разбавлению, пока количество добавленного солевого .раствора не составит 70% от получен- 0 ной суспензии. Суспензию центрифугируют в течение 20 мин при скорости 3000 об/мин. Прозрачный суперн-атант фильтруют через четыре сло  стерильной марли.

35 Полученный материал подвергают пробе на чистоту и сразу же за этим подвергают обработке антибиотиками (пенициллил, стрептомицин, неомицин и хлороцид). Суспензию выдерживают 40 при комнатной температуре в течение одного часа, а затем провер ют на стерильность, высева  на пита тельную среду.

Есши материал окажетс  не сте- . рильным, его стерилизуют гентамици- ном. Не позже 5-6 сут после нарушени  целости, скорлупы суспензз-да лиофилизируют . До того времени суспен50

55

зию хран т при 4 с. Перед лиофилиза- цией добавл ют следующие защитные вещества: 5% 10 об,%-ного коллидоно- вого раствора, 5% 10 об.%-ного раствора жел(атины, 4% 50 об.%-ного раствора глюкозы и .3% 50 об.%-ного раствора сахарозы.

Общее количество защитных колло- ;идов и структурообразующих веществ

составл ет 17%. Перед лиофштизацией определ етс  титр суспензии - 10 ElDjo/Mn.

Суспензию расфасовывают порци ми по 2 мл в стаканчики. Их размещают на предварительно охлажденных до -5 С полках устройства дл  лиофили- задии. Когда температура материала опуститс  до -45 С, включаетс  ва10

куум. После того, когда давление со- ставл ет 0,1 мбар, включаетс  нагрев

полок и регулируетс  таким образом, чтобы температура материала держалась в пределах (-30) - (-35)°С (при 0,1 мбар дл  этого необходима темпе- 15 ратура полок около - 15°С). По окончании сублимадии полки нагревают до 35 С и устанавливают максимальную производительность вакуум-установки. После сушки в течение 8 ч остаточное 20 количество влаги составл ет менее 2%. Стаканчики еще в установке дл  лиофи- лизации под вакуумом закрывают герметично резиновыми пробк ами с металлическими колпачками.25

П р и м е р 2. Дл  получени  -инфи- дируемого вируса повтор ют методику, изложенную в примере 1, с тем отличием , что в суспензию не добавл ют анти- бцотнк, а готовую вакцину не лиоф}ти- зо зируют,, хран т в замороженном состо нии в жидком азоте. Титр инфицируемого вируса составл ет по меньшей мере 10 -10 ElDjp/мл. Перед применением из инфицируемого материа- эс а готов т разбавленный раствор в соотношении 1:60-1:200. Одна прививочна  доза (0,2 мл) содержит примерно lOOOO/ElDjj . Инфицируемый вирус не должен вызывать гемаглютинизацию 40 красных кров ных шариков кур.

П р и м е р 3. Иммуногенность оценивают в реакции нейтрализации. Дл  эксперимента используют 480 ут т из хоз йства, в котором вследствие экспортных поставок поголовье не подвергают иммунизации. Кажда  группа состоит из 20 птиц.

В эксперименте с вакцинацией примен ют буфер следующего состава,г: 50

ан

8

0,2 1,15 0,2 0,1 0,1

До 1000 мл

10

23708 4

Из полученной по методике примера 1 вакцины С помощью буфера приведенного состава получают разбавленные растворы различной концентрации. Эти 5 растворы примен ют как дл  внутримышечных инъекций, так и в питьевой воде. С целью сравнени  провод т аналогичные эксперименты с коммерческой жидкой вакциной.

Через 12 сут отбирают пробы кро 15 20 25

- зо эс 40

5

0

5

ви и сыворотки, инактивируют при 56°С в течение 30 мин. Затем разведение сыворотки в соотношении 1:10. провод т в контакт с различными разведени ми вируса и выдерживают при комнатной температуре в течение одного часа, а затем полученной смесью инфицируют инкубированные в течение 1 1 сут SPF  йца. Титр вируса или индекс нейтрализации (ИН) определ ют после истечени  одной недели по количеству погибших или еще живущих, но подвергшихс  характерным Патологическим изменени м эмбрионов по методу Риид-Мюнха.

Сравнительные данные по иммуноген- ной активности замороженной жидкой вакцины и предлагаемой вакцины приведены в таблице.

Индекс более 2  вл етс  положительным , индекс более 3  вл етс  отличным результатом.

J Из таблицы видно, что полученна  по согласно предлагаемому способу вакцина имеет отличные защитные качества .

Пример 4. Способность вакцины к хранению исследуют посредством моделировани  действительного хранени , а также посредством обычной тепловой нагрузки. При моделировании условий хранени  исход т из того, что в инструкци х большинства стран предписываетс  способность к хранению при 4 С, поэтому способность к хранению предусмотренного на экспорт продукта провер ют при этой температуре. Хранивша с  в течение 12 мес при 2 - 5 с вакцина тер ет 0,6 дес тичных степени своей активности , (от показател  степени значени  EID). Эта величина незначительна и не превышает разброс величины ЕЮ-, двух колбочек.

yQ

Проба с тепловой нагрузкой обеспечивает в достаточной мере быструю проверку. Если титр хранившейс  в течение одной недели при вакЦИ11Ы  вл етс  удовлетворительным, то гарантированным  вл етс  то, что при хранении в течение года в предписываемых услови х она  вл етс  пригодной ,цл  применени ..Полученна  сог- , 5  вл етс  отличным результатом.

Контроль

Замороженна  . жидка  вакцина,

подкожно

Лиофилизиро- ванна  вакцина согласно предлагаемому способу

1237081 .§

ласно предлагаемому изобретению вакцина при хранении в течение одной недели при 37°С тер ет только 0,5 дес тичных степени своей активности, что

1,6

25

87,5

125

Claims (1)

1. СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА УТОК, предусматривающий культивирование вакцинного вируса гепатита уток на эмбрионах, добавление в полученный вирусосодержащий материал антибиотиков и защитной среды с после- дующей лиофилизацией полученной суспензии, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и стабильности вакцины из вакцинных вирусов гепатита используют штамм TN № 00220, из эмбрионов применяют куриные, после культивирования вируса гепатита куриные эмбрионы гомогенизируют в присутствии физиологического раствора хлористого натрия при содержании эмбриомассы и физиологического раствора, соответственно равном 25-35 и 65-75 об.%, центрифугируют, в качестве вирусосодержащего материала используют надосадочную жидкость гомогената, а в качестве защитной среды - смесь, содержащую 0,5% поливинилпирролидона, 0,5% желатины, 2% глюкозы, 1,5% сахарозы от вирусосодержащей суспензии.

   SU 1237081 АЗ