CN110129285B - 一种高效筛选鸭肝炎病毒毒种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于病毒筛选技术领域，公开了一种高效筛选鸭肝炎病毒毒种的方法，包括以下步骤：收集并处理病死鸭的肝脏病料；将肝脏病料接种于SPF鸭胚，收获死亡鸭胚液及胚体，传代培养得到待筛选的鸭肝炎病毒毒株；将上述毒株稀释后接种于SPF鸭胚，筛选出第一轮病毒毒株；用第一轮病毒毒株制备雏鸭毒，将雏鸭毒稀释后接种于雏鸭，筛选出第二轮病毒毒株；用第二轮病毒毒株制备灭火疫苗，免疫SPF鸡，筛选出第三轮病毒毒株；用第三轮病毒毒株制备的阳性血清注射于所述发病鸭场内的发病鸭，最终确定鸭肝炎病毒毒种。该方法可高效地筛选出优质的鸭肝炎病毒毒种，能够缩短疫苗产品的更新换代的时间，为市场上鸭病毒性肝炎的流行提供及时有效的治疗产品。

Description

一种高效筛选鸭肝炎病毒毒种的方法

技术领域

本发明属于病毒筛选技术领域，涉及一种高效筛选鸭肝炎病毒毒种的方法。

背景技术

鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck HepatitisVirus，DHV)引起的雏鸭的一种急性、烈性、高死亡率、高度接触性传染病，主要特征为发病急、传播快、死亡率高，常发生于3周龄以下的雏鸭，成年鸭不见发病，尤其是不足1周龄的雏鸭最易感染，发病率高达100％，一旦发病，死亡率可达90％以上，对我国养鸭业的发展危害重大。临床表现为角弓反张，病理变化为肝炎，传染源为病鸭和带毒禽，可通过消化道、呼吸道传染，尚未证实经卵传播，一年四季均可发生，主要发生于孵化雏鸭的季节，严重威胁我国养鸭业的发展。

鸭病毒性肝炎的病原分I型、II型、III型和N-DHV四个血清型，这几种血清型相互独立，且无交叉保护性，但是所引起的病理变化、临床症状却很相似。I型属于小RNA病毒科未确定种病毒，可在鸭、鸡、鹅胚尿囊腔增殖，病毒抵抗力强，在自然环境中可较长时间存活。II型属于星状病毒，仅报道于英国。III型属于小RNA病毒肠病毒属。N-DHV同I型属于微RNA病毒科的一个新属，可能为Ⅰ型变异株。

鸭病毒性肝炎由于血清型复杂，相互之间没有交叉免疫保护，给鸭病毒性肝炎的预防和控制带来诸多不便。目前除采取常规卫生防疫措施外，常采用疫苗、高免血清或卵黄抗体等进行防治。但是，疫苗对于雏鸭免疫效果差，免疫成年鸭后，雏鸭的母源抗体又会干扰雏鸭的免疫效果；高免血清用量大、成本高、质量低等，在生产使用中受到一定限制。鸭病毒性肝炎卵蛋黄抗体在养鸭生产上已被广泛应用，它弥补了高免血清和疫苗的不足，且冻干制剂便于运输和保存、有效期长、副作用小、无残留、效果显著，在鸭病毒性肝炎的紧急预防及治疗方面发挥重要作用。以上三种防疫措施均需要从制备疫苗或抗体的病毒毒株入手，故从众多毒株中筛选出繁殖性能好、交叉保护率高、免疫原性佳的鸭肝炎病毒，是亟待解决的问题。

然而，由于市场流行毒株的血清型多样，毒株变异较快，经典的鸭肝炎病毒毒株已很难100％的保护各个地区鸭病毒性肝炎的流行。一个流行毒株的筛选，一般要经过病料采集、病毒分离与纯化、病毒理化和生物学特性验证等一系列过程，该过程不仅耗费时间长，而且需要大量的人力、物力，且筛选出的毒株不一定适合作为病毒种子。因此，急需一种能够高效筛选鸭肝炎病毒毒株的方法。

发明内容

本发明的目的在于针对常规方法筛选毒株耗时长、成本高、步骤复杂、结果难以判定等问题，提供一种省时、高效、实用的筛选鸭肝炎病毒毒株的方法。

为实现上述目的，本发明提供一种高效筛选鸭肝炎病毒毒种的方法，包括以下步骤。

步骤1：收集并处理多个地区病死鸭的肝脏病料；

步骤2：将步骤1获得的肝脏病料经尿囊腔接种于SPF鸭胚，收获死亡鸭胚液及胚体，进行连续传代培养，得到待筛选的鸭肝炎病毒毒株；

步骤3：将步骤2获得的待筛选的鸭肝炎病毒毒株进行系列稀释后经尿囊腔接种于SPF鸭胚，统计死鸭胚数量，根据计算的鸭胚半数致死量ELD₅₀，筛选48～120h死亡率大于80％、且病毒含量大于105.5ELD₅₀/0.1mL的鸭肝炎病毒毒株为第一轮鸭肝炎病毒毒株；

步骤4：用步骤3筛选出的第一轮鸭肝炎病毒毒株制备雏鸭毒，将雏鸭毒进行系列稀释后接种于雏鸭，统计雏鸭死亡数量，根据计算的雏鸭半数致死量LD₅₀，筛选死亡率大于80％、且病毒含量大于106.0LD₅₀/0.2mL的鸭肝炎病毒毒株为第二轮鸭肝炎病毒毒株；

步骤5：用步骤4筛选出的第二轮鸭肝炎病毒毒株制备灭火疫苗，免疫SPF鸡，根据计算的三免后血清抗体中和效价，筛选三免后血清抗体中和效价大于1:4096的鸭肝炎病毒毒株为第三轮鸭肝炎病毒毒株；

步骤6：选取5个以上地区的发病鸭场，将步骤4筛选出的第三轮鸭肝炎病毒毒株制备的阳性血清注射于所述发病鸭场内的发病鸭，统计阳性血清对每个地区的保护率，将对每个地区保护率均不小于80％的鸭肝炎病毒毒株确定为鸭肝炎病毒毒种。

优选地，步骤2中所述连续传代培养的代数为5代。

优选地，步骤3中的系列稀释为10^-2～10^-7稀释。

优选地，步骤4中的系列稀释为10^-5～10^-7稀释。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明筛选方法先从不同地区获得多个待选鸭肝炎病毒毒株，再从鸭胚半数致死量、雏鸭半数致死量、免疫原性测定及多地区交叉保护性测定多方面入手，建立筛选标准，逐级筛选出鸭肝炎病毒毒种，该方法可高效地筛选出优质的鸭肝炎病毒毒种，能够缩短疫苗产品的更新换代的时间，为市场上鸭病毒性肝炎的流行提供及时有效的治疗产品。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中的定量实验，均三次重复试验，结果取平均值。

实施例一

(1)收集并处理多个地区病死鸭的肝脏病料

2018年2月从山东省聊城市茌平县某5万只鸭场、山东省泰安市东平县某2万只鸭场、河南省信阳市光山县某5万只鸭场、河南省商丘市柘城县某2万只鸭场无菌采集病死鸭肝脏病料，用含双抗的灭菌生理盐水冲洗5次，无菌剪刀剪碎，加入4倍体积的灭菌生理盐水，研磨，反复冻融3次。以5000转/分钟低温离心30分钟，取上清液，加5％的氯仿室温下振摇20分钟，5000转/分钟低温离心30分钟，取上清，0.22μm一次性过滤器过滤，无菌检验合格后混合分装，-80℃冻存。

(2)病毒分离

将处理后的病料用灭菌生理盐水稀释10倍后经尿囊腔接种20枚10～11日龄SPF鸭胚，每胚0.1ml，37℃孵育观察168小时，48小时前的死胚弃去，将48～120小时死亡的鸭胚及时取出置2～8℃，如无死亡则将未死亡的鸭胚置2～8℃放置20小时，逐胚收获鸭胚液及胚体，用研磨器研细，冻融3次后离心，收集上清液，无菌检验合格后混合分装，置-80℃冻存。依据上述方法连续传代5代，将4个地区分离的第5代鸭胚病毒液分别命名为SDN株、SDH株、HNN株、HNL株，作为待筛选的鸭肝炎病毒毒株。

(3)鸭胚半数致死量(ELD₅₀)测定

将上述四种待筛选的鸭肝炎病毒毒株用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，按照10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7共6个稀释度经尿囊腔接种10～11日龄健康SPF鸭胚，每个稀释度接种10枚，每枚0.1ml，另设10枚空白对照，37℃观察168小时，统计48～120小时的死亡鸭胚数量，按照Reed-Muench法计算ELD₅₀，结果如表1所示。

表1四种鸭肝炎病毒毒株的48～120h死亡率和ELD₅₀

名称	48～120h死亡率	ELD<sub>50</sub>/0.1mL
			SDN株	60％	10<sup>3.83</sup>
SDH株	80％	10<sup>5.6</sup>
			HNN株	90％	10<sup>6.12</sup>
HNL株	80％	10<sup>5.83</sup>

由表1可以看出：SDH株、HNN株、HNL株在48～120h死亡率均大于80％、且病毒含量均大于10^5.5ELD₅₀/0.1mL，仅有SDN株在48～120h死亡率为60％、且病毒含量仅为10^3.83ELD₅₀/0.1mL，故将SDH株、HNN株、HNL株可作为第一轮鸭肝炎病毒毒株。

(4)雏鸭半数致死量(LD₅₀)测定

用第一轮鸭肝炎病毒毒株制备雏鸭毒，雏鸭毒用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-7共3个稀释度取适宜稀释度经肌肉注射5～8日龄雏鸭，每个稀释度接种10只，每只0.2ml，另设10只空白对照，观察10日，记录雏鸭死亡情况，按照Reed-Muench法计算LD₅₀，结果如表2所示。

表2三种鸭肝炎病毒毒株的LD₅₀

名称	死亡率	LD<sub>50</sub>/0.2mL
			SDH株	80％	10<sup>6.3</sup>
HNN株	100％	10<sup>6.8</sup>
			HNL株	70％	10<sup>4.5</sup>

由表2可以看出，SDH株、HNN株死亡率均大于80％、且病毒含量均大于10^6.0LD₅₀/0.2mL，而HNL株死亡率仅为70％，病毒含量仅为10^4.5LD₅₀/0.2mL，故将SDH株、HNN株作为第二轮鸭肝炎病毒毒株。

(5)免疫原性的测定

将第二轮鸭肝炎病毒毒株经灭活后与油乳佐剂按质量比1：2混合制成灭活疫苗，免疫1月龄左右SPF鸡。一免：1月龄左右SPF鸡每只颈部皮下注射免疫原0.5ml；二免：在一免后7日后，每只颈部皮下注射灭活疫苗1.0ml；三免：在二免后14日，每只腿部肌肉注射灭活疫苗1.0ml。三免后2周采血，分离血清，56℃灭活30分钟，测定其血清抗体中和效价，结果如表3所示。

表3两种鸭肝炎病毒毒株的血清抗体中和效价

名称	中和效价
		SDH株	1:6871
HNN株	1:9708

由表3可以看出，由于SDH株、HNN株在三免后血清抗体中和效价均大于1:4096，表明该毒株的免疫原性较好，可将SDH株、HNN株作为第三轮鸭肝炎病毒毒株。

(6)交叉保护性试验

选取广西西宁、浙江金华、山东聊城、江苏盐城及河南商丘5地区的发病鸭场，将应用上述2株毒株制备的阳性血清分别应用于以上5地区的发病鸭场，每个养殖场选取200只发病鸭做试验，分两组，100只/组，每只腿部肌肉注射阳性血清1.0ml，观察7日，统计阳性血清对每个地区的保护率，如表4所示。

表4两种鸭肝炎病毒毒株的阳性血清对每个地区的保护率

名称	广西西宁	浙江金华	山东聊城	江苏盐城	河南商丘
						SDH株	56％	62％	49％	64％	68％
HNN株	82％	81％	83％	85％	88％

按照保护率≥80％以上为合格，由表4可知，仅HNN能保护5个鸭病毒性肝炎发病区，确定为鸭肝炎病毒毒种。

实施例二鸭肝炎病毒毒种的应用

分别利用实施例一中筛选的HNN株和广东某高校采集病死鸭肝脏病料分离出的GD106株灭活后与矿物油佐剂按质量比1：2混合制成灭活疫苗，分别命名为ML01批、ML02批。将50只10日龄SPF鸡平均分成5组，每组10只。第1组每只肌肉注射ML01批产品1.0ml，第2组每只肌肉注射ML02批产品1.0ml，免疫14日后，第1、2、3、4组SPF鸡每只肌肉注射I群禽腺病毒组织毒强毒AV208株病毒液0.1ml(含100LD₅₀)；其中第3、4组SPF鸡分别是HNN株和GD106株攻毒对照组，第5组SPF鸡为空白对照，各组隔离饲养。观察10日，记录死亡情况，结果如表5所示。

表5应用结果对比表

由表5可以看出，ML01批灭活疫苗对I群禽腺病毒强毒AV208株攻击的保护率均为100％，ML02批灭活疫苗对I群禽腺病毒强毒AV208株攻击的保护率均为80％，即用本发明方法逐级筛选出的鸭肝炎病毒毒种制备的灭活疫苗的保护率大于仅用常规方法分离而未经逐级筛选的鸭肝炎病毒毒种制备的灭火疫苗。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (4)

1.一种高效筛选鸭肝炎病毒毒种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：收集并处理多个地区病死鸭的肝脏病料；

步骤2：将步骤1获得的肝脏病料经尿囊腔接种于SPF鸭胚，收获死亡鸭胚液及胚体，进行连续传代培养，得到待筛选的鸭肝炎病毒毒株；

步骤3：将步骤2获得的待筛选的鸭肝炎病毒毒株进行系列稀释后经尿囊腔接种于SPF鸭胚，统计死鸭胚数量，根据计算的鸭胚半数致死量ELD₅₀，筛选48~120h死亡率大于80%、且病毒含量大于10^5.5ELD₅₀/0.1mL的鸭肝炎病毒毒株为第一轮鸭肝炎病毒毒株；

步骤4：用步骤3筛选出的第一轮鸭肝炎病毒毒株制备雏鸭毒，将雏鸭毒进行系列稀释后接种于雏鸭，统计雏鸭死亡数量，根据计算的雏鸭半数致死量LD₅₀，筛选死亡率大于80%、且病毒含量大于10^6.0LD₅₀/0.2mL的鸭肝炎病毒毒株为第二轮鸭肝炎病毒毒株；

步骤5：用步骤4筛选出的第二轮鸭肝炎病毒毒株制备灭火疫苗，免疫SPF鸡，根据计算的三免后血清抗体中和效价，筛选三免后血清抗体中和效价大于1:4096的鸭肝炎病毒毒株为第三轮鸭肝炎病毒毒株；

步骤6：选取5个以上地区的发病鸭场，将步骤4筛选出的第三轮鸭肝炎病毒毒株制备的阳性血清注射于所述发病鸭场内的发病鸭，统计阳性血清对每个地区的保护率，将对每个地区保护率均不小于80%的鸭肝炎病毒毒株确定为鸭肝炎病毒毒种。

2.根据权利要求1所述的一种高效筛选鸭肝炎病毒毒种的方法，其特征在于，步骤2中所述连续传代培养的代数为5代。

3.根据权利要求1所述的一种高效筛选鸭肝炎病毒毒种的方法，其特征在于，步骤3中的系列稀释为10^-2~10^-7稀释。

4.根据权利要求1所述的一种高效筛选鸭肝炎病毒毒种的方法，其特征在于，步骤4中的系列稀释为10^-5~10^-7稀释。