CN108118034B - Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原的制备方法及其制品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原的制备方法及其制品。本发明首先公开了一种Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原的制备方法，包括以下步骤：(1)繁殖Ⅰ群4型禽腺病毒毒株，收获病毒液，灭活；(2)将灭活的病毒液与冻干保护剂混合均匀，冷冻干燥，即得。本发明进一步公开了所述方法制备得到的Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原，其琼扩效价达25，在2‑8℃可以保存6个月，在‑15℃可以保存18个月。本发明通过将Ⅰ群4型禽腺病毒毒株接种LMH细胞后收获病毒液，并对冻干保护剂配方进行优化，不但提高了禽腺病毒琼扩抗原的琼扩效价，而且延长了禽腺病毒琼扩抗原的保存期。本发明Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原的制备方法，操作简单，适于大生产。

Description

Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原的制备方法及其制品
技术领域
本发明涉及一种Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原的制备方法，还涉及所述方法制备得到的Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原，属于Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原的制备领域。
背景技术
禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAV)，根据抗原性差异可以分为3个群，其中Ⅰ群禽腺病毒又可分为12个血清型，能引起包涵体肝炎、心包积液、肌胃糜烂等病变。1987年在巴基斯坦安卡拉地区的肉鸡场爆发了一种以心包积液为特征的疾病，称为心包积液综合征，又称安卡拉病，该病后来蔓延至全国，给当地的肉鸡养殖业造成了极大的损失。
常用的血清学诊断方法为双向免疫琼脂扩散(简称琼扩)试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)。琼扩试验为可溶性抗原与抗体在琼脂凝胶中所呈现的一种沉淀反应，当对应的抗原、抗体在半固体琼脂终相遇，且二者比例适当时，便出现可见的白色沉淀线，这组沉淀线是一组抗原、抗体的特异性复合物。当琼脂中有多组不同的抗原、抗体存在时，便各自依其扩散速度的差异，在适当的部位形成独立的沉淀线。因此，琼脂扩散不仅用于疾病的诊断，更广泛地用于抗原成分的分析。此外，琼扩试验简便易行，非常适用于基层。
现有的禽腺病毒琼扩抗原制备方法，操作过程复杂，产量低，不适于大量生产，而且保存期短。因此，亟待改进现有禽腺病毒琼扩抗原的制备方法。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原的制备方法，该方法不但操作简单，适于大生产，而且提高了禽腺病毒琼扩抗原的琼扩效价，延长了禽腺病毒琼扩抗原的保存期；
本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述制备方法制备得到的Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了一种Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原的制备方法，包括以下步骤：(1)繁殖Ⅰ群4型禽腺病毒毒株，收获病毒液，灭活；(2)将灭活的病毒液与冻干保护剂混合均匀，冷冻干燥，即得。
其中，按体积百分比计，步骤(1)所述灭活为向病毒液中加入终浓度为0.2％甲醛溶液，37℃灭活48小时；优选的，所述灭活还包括加入亚硫酸钠终止灭活。
步骤(2)所述灭活的病毒液与冻干保护剂按照体积比1：1混合。
步骤(2)所述冻干保护剂的组成为：每100ml保护剂中，海藻糖1-3g，蔗糖5-9g，脱脂乳2-6g，胰蛋白胨1-5g，余量为纯化水；优选的，所述冻干保护剂的组成为：每100ml保护剂中，海藻糖3g，蔗糖5g，脱脂乳6g，胰蛋白胨3g，余量为纯化水。
本发明对冻干保护剂配方进行筛选的结果表明，采用每100ml保护剂中，海藻糖3g，蔗糖5g，脱脂乳6g，胰蛋白胨3g，余量为纯化水，所制备琼扩抗原冻干成品的物理性状、剩余水分、真空度全部合格，而且冻干后病毒损失最小。
本发明Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原的制备方法，步骤(1)所述繁殖Ⅰ群4型禽腺病毒毒株，收获病毒液，包括：(a)将Ⅰ群4型禽腺病毒毒株接种SPF鸡胚，收获鸡胚尿囊液，得到毒种；(b)将毒种接种LMH细胞(鸡肝癌细胞系)，当细胞病变80％以上时，(-20℃反复冻融三次)收获细胞液，得到F1代毒；(c)重复步骤(b)，将F1代毒在LMH细胞上连续传代，收获第n代病毒液，离心，取上清液，即得。
其中，步骤(a)所述SPF鸡胚为6日龄SPF鸡胚，接种剂量为0.2mL/枚，置37℃孵育，弃去24h内死亡的鸡胚；所述收获鸡胚尿囊液为收获接种48-144h之间死亡的鸡胚尿囊液。按体积百分比计，步骤(b)将毒种按2％的接毒量接种于LMH细胞。步骤(c)将F1代毒在LMH细胞上连续传3代，收获第3代病毒液；所述离心为4000r/min离心20min。
本发明将Ⅰ群4型禽腺病毒接种LMH细胞后，经传3代获得的抗原液的琼扩效价明显高于接种鸡胚制备的抗原琼扩效价。
本发明Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原的制备方法，对Ⅰ群4型禽腺病毒毒株没有特殊限制；优选的，所述Ⅰ群4型禽腺病毒毒株为Ⅰ群4型禽腺病毒HB株，其微生物保藏编号为CGMCCNo.14324；分类命名：Ⅰ群禽腺病毒(血清4型)；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间是2017年7月6日，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明进一步公开了所述制备方法制备得到的Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原。
本发明方法制备得到的Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原的琼扩效价达25，在2-8℃可以保存6个月，在-15℃可以保存18个月；而原方法制备的琼扩抗原的琼扩效价为23，在2-8℃保存期仅为1个月，在-15℃保存期为12个月。可见，本发明方法不但明显提高了禽腺病毒琼扩抗原的琼扩效价，而且有效延长了禽腺病毒琼扩抗原的保存期。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明将禽腺病毒接种LMH细胞后收获病毒液来制备琼扩抗原，并通过对冻干保护剂配方的优化，提高了禽腺病毒琼扩抗原的琼扩效价，而且延长了禽腺病毒琼扩抗原的保存期，更方便于禽腺病毒抗原的运输与现地的检测。本发明方法操作简单，适于大量生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原的制备
1、毒种的繁殖
将分离的Ⅰ群禽腺病毒HB株(血清4型)(微生物保藏编号为CGMCC No.14324)，卵黄囊接种于6日龄SPF鸡胚，0.2mL/枚。置37℃孵化箱孵育，空气湿度60％，每日照胚2次。弃去24h内死亡的鸡胚，收获接种48～144h之间死亡的鸡胚尿囊液，检验合格后置-80℃低温保存备用。
2、抗原的制备
将检验合格的毒种按2％的接毒量(体积百分比)，接种于LMH细胞(鸡肝癌细胞系)，置CO2培养箱吸附2小时，补维持液后放入CO2培养箱。当细胞病变80％以上时，将细胞培养瓶放入-20℃反复冻融三次，收获细胞液为F1代。将F1代毒，用上述方法连续在LMH细胞上连续传3代后，收获第3代病毒液。进行琼脂扩散试验。将琼脂试验检验合格的病毒液4000r/min离心20min，取其上清液。
3、抗原的灭活
将检验合格的病毒液加入终浓度为0.2％甲醛溶液(体积比)，置37℃摇床，灭活48小时，取出加入亚硫酸钠终止灭活。
4、抗原的稳定
按病毒液与冻干保护剂1:1的比例(体积比)加入冻干保护剂(每100ml保护剂中，海藻糖3g，蔗糖5g，脱脂乳6g，胰蛋白胨3g，余量为纯化水)。震荡混匀后利用冷冻真空干燥技术冻干后，即得到禽腺病毒琼扩抗原。
5、琼扩抗原的保存期试验
制备的抗原分别在4℃保存1、2、4、6、8个月，分别测定其琼扩效价。在-15℃保存6、12、18、21个月，分别测定其琼扩效价。
试验例1 4型禽腺病毒抗原冻干保护剂的筛选
1、4型禽腺病毒抗原冻干保护剂的筛选
选择配方组份中的主要成份，通过正交试验方法，(四因素三水平，表1)配制9组保护剂，另设对照1组，共10组；其中，1-9组保护剂中各组分百分比均为按照g/ml计，另外，1-9组中海藻糖用量为1％、2％、3％，蔗糖用量为5％、7％、9％，脱脂乳的用量为2％、4％、6％，胰蛋白胨的用量为1％、3％、5％；第10组为5％蔗糖、5％脱脂乳(表2)；余量为纯化水。各组保护剂按不同比例配制混均后，按1:1的比例(体积比)加入禽腺病毒抗原(禽腺病毒抗原的制备方法同实施例1)，进行冻干。冻干后，将通过物理性状、剩余水分、真空度、冻干前后病毒损失等检测指标的比较，确定保护剂的最佳配方。
表1不同保护剂的筛选比例
Figure BDA0001528456000000051
表2 10组腺病毒保护剂的不同组合
Figure BDA0001528456000000061
2、禽腺病毒抗原冻干保护剂最佳配方筛选结果
将以上10组冻干成品分别进行物理性状、剩余水分、真空度、冻干前后病毒损失的检测。根据结果筛选出第7组保护剂的物理性状、剩余水分、真空度全部合格，且冻干后病毒损失最小(效价最高)。本发明将第7组的保护剂确定为禽腺病毒抗原的最佳保护剂。各组分的含量为：每100ml保护剂中，海藻糖3g，蔗糖5g，脱脂乳6g，胰蛋白胨3g，余量为纯化水。冻干成品的检验结果见表3。
表3冻干成品检验结果
Figure BDA0001528456000000062
Figure BDA0001528456000000071
实施例2原有禽腺病毒琼扩抗原的制备方法
1、制苗用毒种的繁殖
将分离的禽腺病毒HB株，卵黄囊接种于6日龄SPF鸡胚，0.2mL/枚。置37℃孵化箱孵育，空气湿度60％，每日照胚2次。弃去24h内死亡的鸡胚，收获接种48～144h之间死亡的鸡胚尿囊液，检验合格后置-80℃低温保存备用。
2、接种鸡胚抗原的制备
将检验合格的毒种用PBS作100倍稀释，卵黄囊接种于6日龄SPF鸡胚，0.2mL/枚。置37℃孵化箱孵育，空气湿度60％，每日照胚2次。弃去24h内死亡的鸡胚，将48～144h之间死亡的鸡胚置2～8℃冷却12～24小时。无菌剖检，收集尿囊液和鸡胚制备琼扩抗原。将鸡胚含毒材料用尿囊液做5倍稀释，匀浆机研磨，低温反复冻融3次，4000r/min离心20min取其上清液，进行琼脂扩散试验，检测琼扩效价。
3、抗原的灭活
将检验合格的病毒液加入终浓度为0.2％甲醛溶液(体积比)，置37℃摇床，灭活48小时。
4、抗原的稳定
按病毒液与冻干保护剂1:1的比例(体积比)加入冻干保护剂(5％蔗糖、5％脱脂乳(按照g/ml计))混匀后分装，利用冷冻真空干燥技术冻干后，即得到禽腺病毒琼扩抗原。
5、琼扩抗原的保存期试验
在4℃保存1、2、4、6、8个月，分别测定其琼扩效价。在-15℃保存6、12、18、21个月，分别测定其琼扩效价。
实施例3本发明方法(实施例1)与原方法(实施例2)制备的琼扩抗原保存期比较
1、禽腺病毒接种鸡胚(原方法)制备抗原与禽腺病毒接种细胞(本发明方法)制备抗原的琼扩检验结果
禽腺病毒接种细胞后，经传3代，获得的抗原液的琼扩效价要高于鸡胚制备的抗原琼扩效价。因此，本发明选择病毒接种细胞后收获病毒液来制备琼扩抗原。结果见表4。
表4两种方法制备的抗原琼扩效价的比较结果(单位：AGP 2X)
Figure BDA0001528456000000081
2、两种方法制备的抗原2-8℃保存期结果
原方法制备的琼扩抗原(实施例2)在2-8℃保存期为1个月，而本发明方法(即新方法，实施例1)制备的抗原液在2-8℃可以保存6个月。结果见表5。
表5两种方法制备的抗原2-8℃保存期结果(单位：2X)
Figure BDA0001528456000000091
3、两种方法制备的抗原在-15℃保存期结果
原有方法制备的琼扩抗原(实施例2)在-15℃保存期为12个月，而本发明方法(即新方法，实施例1)制备的抗原液在-15℃可以保存18个月。结果见表6。
表6两种方法制备的抗原-15℃保存期结果(单位：2X)
Figure BDA0001528456000000092
本发明对抗原液的半成品进行优化，细胞接种方法的琼扩效价比鸡胚接种方法的琼扩效价更高。本发明方法制备的禽腺病毒琼扩抗原，不但提高了禽腺病毒的琼扩效价，而且还延长了禽腺病毒琼扩抗原的保存期，更方便于禽腺病毒抗原的运输与现地的检测。

Claims (7)

1.一种Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）繁殖Ⅰ群4型禽腺病毒毒株，收获病毒液，灭活；（2）将灭活的病毒液与冻干保护剂混合均匀，冷冻干燥，即得；所述冻干保护剂的组成为：每100ml保护剂中，海藻糖3g，蔗糖5g，脱脂乳6g，胰蛋白胨3g，余量为纯化水；所述Ⅰ群4型禽腺病毒毒株为Ⅰ群4型禽腺病毒HB株的微生物保藏编号为CGMCC No.14324。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述繁殖Ⅰ群4型禽腺病毒毒株，收获病毒液，包括：（a）将Ⅰ群4型禽腺病毒毒株接种SPF鸡胚，收获鸡胚尿囊液，得到毒种；（b）将毒种接种LMH细胞，当细胞病变80%以上时，收获细胞液，得到F1代毒；（c）重复步骤（b），将F1代毒在LMH细胞上连续传代，收获第n代病毒液，离心，取上清液，即得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（a）所述SPF鸡胚为6日龄SPF鸡胚；所述收获鸡胚尿囊液为收获接种48-144 h之间死亡的鸡胚尿囊液。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：按体积百分比计，步骤（b）将毒种按2%的接毒量接种于LMH细胞；
步骤（c）将F1代毒在LMH细胞上连续传3代，收获第3代病毒液；
步骤（c）所述离心为4000r/min离心20min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：按体积百分比计，步骤（1）所述灭活为向病毒液中加入终浓度0.2%甲醛溶液，37℃灭活48小时；
步骤（1）所述灭活还包括加入亚硫酸钠终止灭活。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述灭活的病毒液与冻干保护剂按照体积比1：1混合。
7.权利要求1至6任何一项所述制备方法制备得到的Ⅰ群4型禽腺病毒琼扩抗原。
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RU2326942C1 (ru) * 2007-06-13 2008-06-20 Борис Савельевич Народицкий Способ создания рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации и генной терапии

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