KR100616195B1 - 바이러스 및 마이코플라즈마의 보존방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 살아있는 바이러스 또는 마이코플라즈마를 포함하는 생물학적-활성 물질을 2% 미만의 함수량을 갖는 유리질 트레할로스의 기질내에 동결건조 없이 건조 방법으로 보존한다. 상기 방법은 두 단계의 진공 건조 단계를 포함한다. 일반적인 냉동 건조 보다 짧은 시간 주기에서, 바이러스 또는 마이코플라즈마가 재수화될 수 있는 물질로 제공되도록 보존되어 효능을 갖는 백신을 제조한다.
바이러스, 마이코플라즈마, 유리질, 트레할로스, 탈수, 백신

Description

바이러스 및 마이코플라즈마의 보존방법{Method for the preservation of viruses and mycoplasma}
본 발명은 바이러스 및 마이코플라즈마의 보존방법에 관한 것이다. 특히, 바이러스 및 마이코플라즈마가 이당류, 트레할로스(trehalose)를 사용하여 보존될 수 있는 초고속 방법에 관한 것이다. 이 방법을 통하여, 바이러스 및/또는 마이코플라즈마의 장기 보존이 이루어질 수 있고, 특히, 살아있는 순화 백신(attenuated vaccine)이 제조될 수 있다.
탈수(dehydration) 및 삼투농도(ocmoconcentration)에 의한 생분해성 물질의 보존은 종래 기술이다. 감수성(sensitive) 생체분자를 보존하는 작업이 필요할 때, 탈수에 의한 단순 건조로 구조적 물이 제거되어, 잇따른 생체활성의 변성(denaturation) 및 손실을 야기한다. 액체 질소에서 동결보존(cryopreservation)과 동결건조(lyophilisation)가 감수성 생체 분자의 장기간 보존을 위해 허용된 방법이 되었고, 후자의 방법은 살아있는 순화 백신의 보존을 위해 광범위하게 사용된다.
냉동 탈수된 우역(Rinderpest) 백신의 개선된 내열성(thermotolerance)이 2차건조 주기를 진행하는 것으로 이루어져, 잔류 수분(RM) 수준을 약 1 내지 2%로 감소시켰다. 이는 마리너, 제이. 씨 등(Mariner, J. C., et al., Vet. Microbiol., 1990, 21, 195-209)에 따른 72 시간까지의 운전 주기를 수행하는 길고, 높은 에너지 소모를 포함한다. 이 방법에 의해 제조된 백신들이 공지되고, "THERMOVAX"라는 상품명으로 표준 백신과 구별된다.
상술된 바와 같이, 종래 공정은 시간 소모성이고, 높은 에너지 투입을 포함한다. 또한, 동결건조는 최종 생성물에서 단지 보통 수준의 내열성을 부여하고, 냉동이 저장시 변질을 감소시키기 위해 여전히 요구된다. 특히 문제점은 살아있는 백신이 열대 기후에서 사용되는 것으로, 이들은 예방 접종 프로그램이 열대 국가에서 실시되는 잘못된 결과에 따라 효능을 잃게 되기 때문으로, 열대 국가에서, "콜드 체인"을 조정하는 것은 어렵고, 결과적으로, 표준이하의 또는 일부 경우에 쓸모 없는 백신으로 환자들을 예방 접종하게 된다.
진화상의 자연 선택시, 식물 및 동물의 특정 종들은 극한 탈수에 내성인 놀랍고, 지능적인 능력을 얻어서, 매우 장기간 동안 적대적 환경에서 휴면 상태로 존재한다. 그 예는 재생 식물 셀라기넬라 레피도파일라( Selaginella lepidophyla ), 바다 새우 아르테미다 살리나 (Artemia salina )(Clegg, J., J. Comp. Biochem. Physiol, 1967, 20, 801-809), 효모 사카로마이세스 세레비지에( Saccharomyces cerevisiae )(Coutinho, E., Journal of Biotechnology, 1988, 7, 23-32) 및 완보류(tardigrade) 마크로바이오투스 후페란디( Macrobiotus hufelandi )(Kinchin, I. M., Biologist, 1995, 42, 4)를 포함한다. 상기 생물체를 잠재 식물상(cryptobiotic)이라 하고, 그들이 살아남는 과정을 무수생물태(anhydrobiosis)라고 한다. 이러한 능력을 나타내는 동물과 식물의 모든 종은 이당류 트레할로스(α-D-글루코피라노실-α-D-글루코피라노사이드)를 포함한다. 대부분의 크립토바이온트(cryptobionts)에서 일반적으로 0.2g/g 건조 세포 중량의 존재가 그들이 극한 탈수, 고온, X-선 및 또한, 완보류의 일부 종에서는 600 Mpa의 높은 압력에 저항할 수 있도록 한다.
콜라코 등(Colaco et al., Biotechnology, 1992, 10, 1007-1011)은 트레할로스를 사용하는 생물학적 물질의 급속한 건조의 이점을 기술한다. 이 방법은 대게 셀룰로오스 섬유 같은 미리 성형된 고체 기질 위 또는 ELISA 같은 진단 도구 또는 연구실에서 사용하는 유사한 진단 도구에 대한 플라스틱 판의 표면에 제한효소 및 면역글로불린의 건조를 언급한다. 그러나, 이들 기술이 더욱 많은 양의 단위 넘버 및 부피가 부분적으로 밀봉된 용기 중에서, 관련된 무균 기술을 사용하여 다루어지는 대량 상업 백신 제조 등의 산업적 요구가 증가할 때, 문제가 발생한다. 1.0 ml 이상의 단위 부피와 20 L의 제조 배치가 일반적인 대량 백신 제조의 운전 요구를 충족하기 위해, 경제적으로 수용가능한 시간에서 물의 그 부피를 제거하는 다른 전략이 요구된다. 가장 높은 생리학적 내성 온도의 분위기 압력에서 건조는 부분적으로 밀폐된 백신 용기로부터 충분히 신속하게 물을 제거하는데 허용할 수 없는 오랜 시간을 요구하고, 불가피하게 변성 및 효능의 손실을 야기한다.
본 발명은 물이 제거되는 조건 하에서 트레할로스를 사용하는 바이러스 또는 마이코플라즈마의 보존방법에 관한 것이고, 동시에 보존되는 물질의 생물학적 보전 을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명은
(ⅰ) 생물학적-활성 물질의 수용성 현탁액을 트레할로스의 멸균 수용액과 혼합하여 혼합물 중 0.2 내지 10 중량%의 트레할로스 농도를 얻는 단계;
(ⅱ) 상기 혼합물을 대기 보다 낮은 압력 및 0℃ 이하로 떨어지지 않도록 제어하고, 최종적으로 40℃ 미만인 37℃ 미만의 초기 온도에서 30 내지 60분 동안 1차건조시켜, 10% 미만의 잔류 함수량을 갖고, 기질내에 탈수된 생물학적-활성 물질을 포함하는 유리질 다공성 기질을 형성하는 단계; 및
(ⅲ) 단계(ⅱ)의 유리질 다공성 기질을 0.1 mbar 미만의 압력 및 최종적으로 40 내지 45℃ 범위의 온도에서 10 내지 30시간 동안 2차건조시켜서 기질 내에 탈수된 생물학적-활성 물질을 함유하는 2% 미만의 잔류 함수량을 갖는 트레할로스 기질을 형성하는 단계를 포함하는 살아있는 바이러스 또는 마이코플라즈마를 포함하는 생물학적-활성 물질을 보존하는 방법을 제공한다.
본 발명을 통하여, 종래 기술과 비교하여, 향상된 생물학적 특성 및 명확한 상업적 이점을 갖는 살아있는 백신을 제조하는 것이 가능하다. 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 백신은 종래 냉동 건조 과정의 것보다 더욱 신속하게 건조된다. 예컨대, 본 발명의 방법은 트레할로스/생물학적-활성 물질 혼합물을 1시간 내에 약 10%의 함수량으로 건조하는데 사용될 수 있다. 또한, 종래 기술의 50시간과 비교하여, 30시간 미만, 예컨대, 약 20시간 내에 약 1 내지 2%의 잔류 함수량으로 탈수될 수 있다. 또한, 용질 농도에 의해 야기되는 단점이 본 발명에 따라 최소화되고, 특 히 빙정화(ice crystallization)를 피할 수 있다. 트레할로스 유리질 기질에서 보존된 생물학적-활성 물질의 내열성은 종래 방법에 의해 보존된 재료의 것 보다 크고, 따라서, 종래 냉동-건조 백신에서 중요한 요소인 "콜드 체인(cold-chain)"에 대한 요구가 최소화된다. 본 발명의 생성물은 높은 분위기 온도, 예컨대, 약 45℃까지, 장기간 동안 생물학적 활성의 어떤 부가적 손실 없이 노출될 수 있다. 본 발명의 이들 및 다른 이점에 부가하여, 본 발명의 생성물은 재수화에 대한 동시의 "순간 용해성(flash solubility)"을 나타낸다.
본 발명의 방법은 바이러스 및 마이코플라즈마의 장기 보존을 이루는데 적합하다. 특히, 재수화되어 백신을 형성할 수 있는 높은 불안정성의 살아있는 순화 바이러스 성분 및 마이코플라즈마 성분을 보존하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 보존될 수 있는 생물학적-활성 물질의 예는 하기를 포함한다:
과(family): 파라믹소비리데(paramyxoviridae)
아과(subfamily): 파라믹소비리네(paramyxovirinae)
속(genera): 파라인플루엔자(parainfluenza) 바이러스 그룹 홍역(Measles), 우역(Rinderpeat), 개 디스템퍼(canine distemper), 가성우역 바이러스(Peste des Petits Ruminants(PPR))
파라믹소바이러스(Paramyxovirus): 볼거리 바이러스(Mumps)
속(genus): 루비바이러스(Rubivirus), 풍진(Rubella(German Measles))
속(genus): 플라비바이러스(Flavivirus), 황열 바이러스(Yellow Fever virus (Yellow Fever))
속(genus): 라브도바이러스(Rhabdoviruses), 광견병 바이러스(Lyssaviridiae(Rabies virus))
피코르나 바이러스(Picorna viruses(Polio virus))
뉴우카슬병 바이러스(Newcastle Disease virus)
마이코플라즈마: 마이코플라즈마 마이코이데( Mycoplasma mycoides (전염성 소 흉막폐렴(bovine pleuropneumonia))
브루셀라아보르투스(Brucella abortus): 균주 19 백신
클라미디아(Chlamydia): 클라미디아 시타치( Chlamydia psittaci 동물토착성 유산(Enzootic abortion))
콕시디아(Coccidia): 톡소플라즈마 곤디( Toxoplasma gondii (Toxoplasmosis))
본 발명의 방법에 따라, 보존되는 생물학적-활성 물질은 적절한 수용성 배지 중에 현탁액으로 보존된다. 바이러스의 경우, 유용한 농도의 물질을 제공하도록 현탁하기 전에 예컨대, 베로 세포(vero cells) 등의 적절한 배양 배지에서 배양되고, 회수될 필요가 있다. 일반적으로, 생물학적-활성 물질의 수용성 현탁액은 pH 조절, 예컨대, 알칼리를 첨가하여, 7.0 내지 7.8로, 특히, 약 7.4로 조절되어야 한다.
트레할로스는 가장 안정하고, 화학적 비반응성 이당류 중의 하나이다. 1 Kcal/Mol 미만의 대단히 낮은 결합 에너지를 가지고 있어서 다이머 구조를 매우 안정하게 한다. 심하게 가열되지 않으면, 캐러맬화되지 않고, 단백질 또는 펩타이드와 마일라드 반응(Maillard reaction)을 야기하지 않는다. 두 개의 물분자를 함유하는 천연 이수산기화합물 구조는 이당류 결합 주변에 특이한 가요성을 일으키고, 이는 3차 구조된 생물학적 분자와 밀접한 연관을 가능하게 한다. 이는 흡습성은 아니나, 수화에 대한 "순간 용해성"을 나타내고, 이러한 특성은 탈수된 백신에 유용하다.
생물학적-활성 물질의 수용성 현탁액을 트레할로스의 멸균 수용액과 혼합하여, 상기 혼합물을 0.2 내지 10중량%, 바람직하게는 2 내지 10중량% 및 더욱 바람직하게는 2.5 내지 8중량%의 트레할로스 농도를 갖도록 준비한다. 트레할로스 농도의 범위 내에서, 사용된 실제 농도는 일반적으로, 생물학적-활성 물질의 단위 크기에 의존할 것이다. 더욱 작은 트레할로스가 큰 세포보다 작은 바이러스 입자에 대해 요구된다.
멸균 수용성 트레할로스/생물학적-활성 물질 혼합물은 1차건조 단계에 이어 2차건조 단계를 포함하는 진공 건조 과정을 거친다. 바람직하게는, 종래 냉동 건조 장치(예컨대, EDWARDS, CHRIST, USIFROID 또는 SAVANT에 의해 제조)가 건조 과정을 위해 사용되어 본 발명에서 중요한 단계를 위해 제어된 환경을 제공한다. 그러나, 상기 장치가 사용되면, 냉동 건조 조건이 적용되지 않고, 물질은 냉동 건조되지 않는 것이 강조된다. 상기 건조 과정은 두 개의 건조 단계를 포함하는 것으로, 이는 물질의 잔류 함수량이 10% 미만의 값으로 감소되는 1차건조 단계와 상기 물질의 잔류 함수량이 2% 미만으로 감소되는 2차건조 단계이다.
1차건조 단계에서, 상기 건조 장치의 초기 온도는 상기 트레할로스 혼합물의 온도가 37℃ 미만, 바람직하게는 37℃로 유지되고, 상기 방법의 1차건조 단계에서, 생물학적 활성의 손실을 방지한다. 물이 혼합물로부터 증발될 때, 상기 혼합물의 온도가 떨어진다. 그러나, 이 건조는 종래의 냉동 건조 과정에서 일반적으로 경험되는 얼음의 어름 또는 승화의 발생 없이 진행되고, 즉, 상기 건조 공정의 1차건조시 생성물의 온도가 0℃이하로 떨어지지 않고, 일반적으로 4℃ 이하로 떨어지지 않도록 제어된다. 상기 압력은 분위기 압력 이하, 바람직하게는 800 내지 300 mbar로 감소된다.
상기 1차건조 단계는 30 내지 60분 사이의 시간 동안 계속되고, 그 시간 동안 트레할로스 혼합물의 온도는 초기에 물이 증발되는 것에 따라 떨어지고, 그 후, 증가한다. 이 과정 동안 약 25℃에의 온도(사용된 감압 하에서)에 도달시, 상기 트레할로스는 유리질 트레할로스를 포함하고, 탈수된 또는 부분적으로 탈수상태인 생물학적-활성 물질을 포함하는 유리질 기질을 형성한다. 상기 1차건조 단계는 상기 유리질 기질의 함수량이 10% 이하에 도달시 완성되고, 이 과정의 중요한 단계에서, 상기 온도가 40℃를 초과하지 않는 것이 필수적이다. 상기 1차건조 단계의 말기에 온도가 40℃를 초과하면, 손상을 야기할 것이다.
상기 1차건조 단계로부터 얻은 생성물은 바람직하게는 1차건조 단계에 사용된 건조 장치로부터 제거 없이, 2차건조 단계가 수행된다. 2차건조 단계에서, 상기 1차건조 단계로부터 얻은 유리질 기질은 또한, 0.1 mbar를 넘지 않는 감압 하에서 탈수된다. 현재 상업적으로 이용 가능한 장치는 매우 낮은 압력, 예컨대, 0.001 mbar 미만의 매우 낮은 압력에서 운전할 수 있다. 그러나, 매우 우수한 결과는 0.001 내지 0.1 mbar의 범위, 일반적으로, 0.01 내지 0.1 mbar의 범위에서 2차건조 단계를 위한 감압을 사용하는 본 발명에 따라 얻어진다. 상기 2차건조 단계는 10 내지 30시간, 바람직하게는 20 내지 30시간의 총 시간 동안 계속된다.
상술된 바와 같이, 상기 1차건조 단계의 말기에 유리질 기질의 온도는 40℃를 넘지 않는다. 2차건조 단계 동안, 상기 기질의 온도는 건조 과정의 말기에 40℃ 내지 45℃의 최종 온도까지 약간 상승할 수 있다. 2차건조 단계의 말기에서 상기 트레할로스 기질은 2% 미만의 잔류 함수량, 바람직하게는 1% 미만의 잔류 함수량을 갖게되어 생성물에서 매우 높은 정도의 내열성을 보장하게 된다. 그러한 잔류 함수량에서, 상기 기질에서 탈수된 생물학적-활성 물질이 45℃ 이상에서 일부 파괴되기 때문에 상기 건조 공정 중의 최종 온도는 45℃를 넘지 않는다. 바람직하게는 2차건조 단계의 말기에서, 상기 생성물의 온도는 44℃를 넘지 않을 것이다.
2차건조 단계시, 상기 기질의 온도를 제어하는데 있어 이점이 실험을 통하여 확인되었는데, 15 내지 17시간 동안 약 37℃로 유지되고, 남아있는 2차건조 시간에 걸쳐서 이는 점차로 증가하여(예컨대, 시간당 0.5 내지 1℃), 최종 온도 40℃ 내지 45℃ 내로 도달한다.
본 발명에 따라 제조된 유리질 트레할로스 기질은 적절한 수용성 배지, 일반적으로 멸균된 증류수에서 매우 신속하게 재수화되어 매우 단시간 내에 사용 가능한 백신을 제조할 수 있다. 얼음으로부터 승화를 포함하는 동결건조 단계 없이 우역 및 가성우역 바이러스 같은 바이러스의 건조를 위한 냉동 건조기를 사용하는 백신 제조 및 운전 과정은 이당류 트레할로스의 특이한 성질을 이용하여 건조시 3차 거대분자를 보호한다.
종래 냉동-건조 과정과 비교하여, 본 발명의 방법은 하기와 같은 이점을 제 공한다.
비교적 짧고, 단순한 과정, 예컨대, 25시간의 생산 주기를 사용하여, 생산 주기 시간과 에너지 소모를 감소시키는 높은 수준의 바이러스 보호를 제공한다.
반드시 필수적이지 않은 복잡한 마이크로프로세서 제어된 냉동 건조기가 사용될 수 있을 지라도, 기본적인 건조 장치가 필요한 것의 전부이다.
본 발명은 단기 동력 고장(short power failure)이 생성물 융해를 야기하여 바이러스의 허용할 수 없는 손실을 유도할 수 있는 동결건조와는 다르게 동력 중단에 내성이 있다.
바이러스의 일부 순화 균주를 갖는 경구 예방 접종은 상피 굴성(epitheliotropism)의 손실로 과거에 제조하는 것이 어려웠다. 경구 및 비강내 예방 접종 모두는 비말감염(droplet infection)의 자연 루트를 모방하여 IgA 및 체액성 IgG2a T 보조-세포(helper-cell) 타입 1 반응으로 방어적 점막 면역의 캐스캐이드를 유도하기 때문에 다양한 적용에 유용하고 적절하다. 그러한 예방 접종의 루트로 투여하는 것이 용이하고, 이들은 적절한 백신이 제조되는 경우에 적용 가능하다. 감염의 자연 루트를 모방하는 살아있는 순화 균주를 갖는 예방 접종 과정은 더욱 광범위한 장점액성(sero mucous) 및 세포 매개 면역을 유도한다. 본 발명의 다른 관점은 또한, 상술된 방법에 따라, 적절한 양성 전하, 생물적합성(biocompatible), 수용성 면역보강제와 결합된 탈수된 바이러스를 포함하는 트레할로스의 유리질 기질을 제조하고, 상기 유리질 기질을 적절한 수용성 조성물로 재수화하는 것을 포함하는 경구 또는 비강내 백신의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 상기 관점의 바람직한 일실시형태에 따라, 경구 또는 비강내 예방 접종을 위한 백신은 MMR 백신이다. 현재 소아 MMR 백신(paediatric MMR vaccine)은 종래 냉동 건조 기술에 의해 제조되어, 환자에게 피하 주사되기 때문에, 경구 또는 비강내 백신은 큰 이점을 제공할 것이다.
도 1은 1차건조 공정 차트이다.
실시예 1
파라믹소바이러스 우역 RBOK 순화 백신 균주를 37℃에서 10일 동안 2차 소 신장 세포에서 증식시킨다. 상기 바이러스 현탁액을 회수하고, 냉각 원심기의 1000 rpm에서 원심분리하여 정화하였다.
10 중량% 트레할로스와 5% 락트알부민(lactalbumin) 가수분해물을 함유하는 멸균 부형제에 4℃에서 정화된 바이러스액을 1:1의 비율로 첨가하였다.
상기 부형제/바이러스 혼합물 1.0 ml을 멸균 건조 부틸 고무 스토퍼(stopper)로 부분적으로 밀폐된 멸균 10 ml 중성 유리 용기 안으로 분액하였다.
상기 용기를 냉동 건조 챔버의 선반에 놓고, 생성물의 온도를 37℃까지 올렸다.
냉각기를 운전하고, 냉각기 온도를 -60℃로 안정화한다.
진공 펌프를 운전하고, 상기 생성물을 함유하는 챔버를 800 mbar의 압력으로 사출시키고, 상기 생성물을 30분 동안 서서히 탈기시켜서 증발성 냉각을 피하기 위해 생성물 온도를 조심스럽게 체크하면서 스퍼터링을 피한다. 건조 챔버와 냉각기 사이의 압력 차를 유지하는 것으로, 상기 수증기의 75%를 초기 30분 내에 냉각기로 보낸다.
압력을 500 mbar로 저하시키고, 구조된 준안정성 유리 기질이 형성된다. 상기 압력은 또한, 0.10 mbar로 감소시키고, 30분 동안 유지된다.
용기는 0.01 mbar의 최종 진공 하에서 밀폐 및 밀봉되고, 알루미늄 덮개로 씌운다.
건조 전 바이러스 역가: 104 TCID/50/ml
건조 후 바이러스 역가: 104 TCID/50/ml
상기 생성물 기질은 증류수에서 순간 용해성이다. 이 실시예는 바이러스의 효능이 본 발명의 방법의 1차건조 단계에서 사용된 처리에 의해 실질적으로 영향을 받지 않음을 나타낸다. 또한, 산업적 스케일에 대한 바이러스 백신을 제조하기 위해 바이러스의 탈수 가능성을 개시한다.
실시예 2
재료 및 방법
우역(RP) 및 가성우역(PPR) 백신 배양의 제조
가성우역(PPRV 75/1) 및 우역(RBOK) 균주를 하기와 같은 10% 트립토오스 포스페이트 배양액(TPB, Difco)와 10% 태아 소 혈청(FCS)으로 보강된 글라스고 변형 이글 배지(Glasgow modification Eagles medium: GMEM)에서 베로 세포를 사용하여 초기 증식시킨다:
베로 세포를 플라스크 당 60 ml, 287,000 세포/ml의 세포 농도에서 5 × 150 ㎠로 접종시킨다. 두 개의 플라스크를 0.03 바이러스 입자/세포의 감염 다중도(multiplicity of infection)로 0.5 ml 가성우역(PPR) 바이러스 현탁액으로 접종시킨다. 두 개의 플라스크는 유사하게 RP 바이러스로 접종시킨다. 남은 한 개의 플라스크는 대조군으로서 비접종시킨다.
플라스크는 5% CO2, 37℃에서 접종시키고, 세포병변효과(cytopathic effect: cpe)의 발달에 대해 세포를 매일 조사한다. 4일째에, GMEM 배지를 2% FCS 및 0.1% 트레할로스 이수산기화합물을 함유하는 항크스 락트알부민 효모 추출물(Hanks LYE)로 대치시킨다. 6일째에, 세포병변효과는 대략 80%이고, 바이러스 회수는 혼주, 냉각 및 -20℃에서 저장된다. 상기 대조군 플라스크는 10일 동안의 인큐베이션하고, 외래성 작용물질(adventitious agents)의 명확한 징후를 갖지 않는 오염 또는 세포 분해가 없음이 증명되었다.
탈수 과정
사용된 탈수 과정은 동결건조와 유사한 두 가지 주요한 구성으로 1차건조와 2차건조로 구성될 수 있다. 동결건조와의 기본적 차이는 생성물이 냉각되지 않고, 건조가 생성물이 얼음으로부터 승화 없이 단순한 탈수에 의한 것이다.
혼주된 바이러스 현탁액을 융해시키고, 트레할로스 이수산기화합물의 멸균 5 중량% 수용액으로 1:1로 희석하여, 혼합물 중의 2.5 중량% 트레할로스의 최종 농도를 생성한다. 1 ml 부피를 5 ml 백신 용기의 각각에 분배하고, 건조 통기 부틸 고무 삽입물로 부분적으로 밀봉시킨다. 이 운전은 실온, 층류(laminar) 공기 흐름 생물재해(biohazard) 캐비넷에서 진행되고, 엄격한 무균 예방책을 유지한다.
1차건조
탈수 과정은 챔버 압력, 냉각기 압력, 선반 및 생성물 온도에 걸친 정밀한 제어를 갖는 에드워즈 슈퍼모율요(Edwards Supermodulyo) 냉각 건조기를 사용하여 수행되었다. 냉각 건조기를 생성물을 함유하는 용기를 선반 챔버에 적하하기 전에 미리 준비하였다. 상기 선반 온도는 40℃까지 올리고, 상기 냉각기 온도는 -40℃의 운전 제한 온도에 도달시킨다. 용기를 선반에 놓고, 그 함유물을 35℃에 도달하도록 한다. 상기 챔버 도어는 마크로(macro) 및 마이크로 공기 어드미턴스 밸브(micro admittance valve)가 완전히 열리는 것에 따라 닫히고, 진공 펌프는 적절한 기체 안정기(ballast)로 켜진다. 챔버에서 압력은 마크로 공기 어드미턴스 밸브를 조심스럽게 닫으면서 800 mbar로 조절된다. 냉각기에서 압력은 500 mbar로 유지되어 챔버와 냉각기 사이의 압력 차를 생성하고, 이는 구동력을 제공하여 수증기가 냉각기의 생성물 표면으로부터 흐르도록 유도한다. 스토퍼에 의한 용기의 부분적 닫음은 또한, 개구(aperture)를 조절하는 이로운 효과를 가지고 있어서, 또한 생성물 표면에서 압력을 증가시킨다. 부분적으로 닫힌 용기가 온도 기록 열전기(thermocouple)를 포함하는 완전히 열린것 보다 더 신속하게 건조되는 것이 확인되었다.
1차건조 단계시, 시간에 따른 생성물의 온도에서 변화와 챔버 압력에서 변화는 첨부된 도면에 도시한다. 도면에 도시된 바와 같이, 증발이 생성물 온도에서 하강에 의해 지시된 것처럼 즉시 시작된다. 생성물 온도는 주로 초기 15분 동안 조심스럽게 마크로 공기 어드미턴스 밸브를 닫으면서 제어되고, 그 후, 마이크로 공기 어드미턴스 밸브의 조작으로 조절되어 생성물이 냉각되지 않도록 한다. 증발성 냉각에 의해 야기된 약 1-2℃ 온도를 유지하는 것이 증발 속도를 증가시켜서 물의 90%가 1시간 내에 증발되고, 생성물 온도는 선반 온도와 적합하게 증가하기 시작한다. 탈수가 진행됨에 따라, 40분 후에 임계점에 도달하고, 이때, 25℃까지의 급속한 증가가 있고, 수초 내에 생성물 온도가 15℃로 감소된다. 이는 생성물의 극적인 기포에 의해 수반된다.
2차건조
살아있는 순화 우역 균주(RP)의 다른 배치(배치 2)를 준비하고, 상술된 바와 같이 1시간 동안 1차건조된다. 이는 상기 온도가 또한 17시간 동안에 걸쳐서 증가되어 완전히 닫힌 기체 안정기로 최종 생성물 온도 42.4℃, 0.06 mbar의 압력까지 증가하는 2차건조된다. 이는 물질의 잔류 함수량을 대략 0.72%가지 감소시키는 효과를 나타낸다.
살아있는 순화 가성우역 바이러스의 다른 배치(배치 2)가 준비되고, 상술된 것처럼 1시간 동안 1차건조된다. 그리고, 2차건조된다. 상기 2차건조는 42.8℃의 온도 및 0.06 mbar의 압력에서 2시간 후에 정지된다. 이 단기간의 2차건조 과정 후 생성물은 5.36%의 잔류 함수량을 갖는다.
내열성에 대한 시험
상술된 바와 같이 제조된 가성우역 및 우역 각각의 배치 2로부터의 샘플을 4℃, 25℃, 37℃ 및 45℃에서 저장한다. 각 저장 온도로부터의 세 가지 용기를 바이러스 역가 측정을 위해 인큐베이션 후 0, 3, 7, 10 및 14일에 취하였다. 세 개 용기의 기하 평균이 명시된 인큐베이션 시간 동안의 각 온도에서 각 배치 형태에 대한 잔류 바이러스 역가로서 확인되었다(표3 및 표4).
바이러스 역가측정
이들은 트레할로스 유리질 상태에 의해 유도된 보호 정도로서 평가된 바와 같이, 초고속 1시간의 효과를 측정하도록 수행되었다. 바이러스 역가측정은 마크 엠. 류예마무 등(Mark, M. Rweyemamu, et al., FAO Animal Production and Health Paper, 1994, No. 118(NB FAO는 UN의 식품 및 농업 기구이다.)에 의해 기술된 우역 백신에 대한 표준 운전 과정에서 기술된 바와 같이 수행되었다. 주: 동물 백신 질의 조절과 조정의 주요한 부분은 Office International Epizooties(OIE)이다. RP 및 PPR의 효능에 대한 OIE 기준은 각각 102.5 TCID50 s/투여량, 103 TCID 50 s/투여량이다(여기서 TCID(tissue culture infective dose)는 조직 배양 감염 투여량이다.) 하기 표1, 2, 3 및 4에서, 바이러스 역가는 X log10 TCID50/ml로 표시되고, 여기서, "X"는 표 각각에서 시험 1, 2 및 3 하에 나타낸 도이다.
결과 및 토론
결과는 표1 및 2에 기술된 동결탈수된 백신의 대조군 및 2.5% 트레할로스를 함유하는 모본 비처리된 바이러스 혼주와 비교하여 상술된 방법을 사용하는 1시간 동안 탈수된 우역 및 가성우역 백신의 한 쌍의 샘플로부터 얻어졌다. 2.5% 트레할로스를 함유하는 부형제는 0.45 log10 TCID50/ml의 하기 건조에 따른 손실로 800 mbar의 감압 하의 조건 하의 37℃에서 신속한 탈수가 따르는 RP 바이러스의 우수한 방어를 제공한다.
1차건조 후 우역 바이러스 역가측정 결과
시험된 물질 시험 1 시험 2 시험 3
바이러스 혼주 + 2.5% 트레할로스 5.7 5.9 5.8
바이러스 혼주 + 1시간 동안 37℃에서 탈수된 2.5% 트레할로스 5.0 5.7 5.35
동결탈수된 대조군 백신 4.8 4.8 4.8
동일한 부형제에서 가성우역 바이러스의 보호는 하기 건조에 따라 단지 0.15 log10 TCID50/ml의 손실으로 우수하였다.
가성우역 바이러스 역가측정
시험된 물질 시험 1 시험 2 시험 3
바이러스 혼주 + 2.5% 트레할로스 5.0 4.9 4.95
바이러스 혼주 + 1시간 동안 37℃에서 탈수된 2.5% 트레할로스 4.9 4.7 4.8
동결탈수된 대조군 백신 4.9 4.9 4.9
탈수 과정에서 제2 단계의 포함은 명확히 생성물의 내열성에 대한 놀라운 효과를 갖는다. 이는 45℃에서 2주 후 단지 1.9 log10 TCID50/ml의 손실을 갖는 17시간의 2차건조를 거친 우역 배치 2에 의해 증명되었다.
우역 배치 2의 내열성 시험
인큐베이션(일) 다양한 온도에서 저장 후 바이러스 역가측정
4℃ 25℃ 37℃ 45℃
0 4.97 4.97 4.97 4.97
3 4.83 4.70 4.10 3.80
7 4.83 4.63 4.17 3.37
10 4.80 4.57 4.10 3.30
14 4.87 4.30 3.83 3.03
한편, 2차건조의 단지 2시간을 수행한 가성우역 배치 2는 45℃에서 접종 14일후 바이러스를 감지할 수 없었다.
가성우역 배치 2의 내열성 시험
인큐베이션(일) 다양한 온도에서 저장 후 바이러스 역가측정
4℃ 25℃ 37℃ 45℃
0 5.40 5.40 5.40 5.40
3 5.33 4.80 4.57 3.90
7 5.33 4.77 4.40 2.70
10 5.40 4.77 3.97 2.50
14 5.27 4.50 3.60 0.00
상술된 무수생물태 과정을 사용하는 우역 및 가성우역 바이러스의 탈수는 1시간 내에 대략 10% 잔류 함수를 갖는 유리질, 벌집형 구조를 생성한다. 40분 건조 후의 관찰된 발열(exotherm)은 감압 하에서 트레할로스 부형제의 유리 전이 온도로 추정되고, 이는 상기 트레할로스가 액체로부터 변화하여 준안정 유리를 형성하는 지점이다(Robert J. Willians and A. Carl Leopold, The glassy state in corn embryos, Plant Physiol., 1989, 89, 977-981). 약 10%의 잔류 함수량을 갖는 이 상태에서 생성물은 미세결정 구조를 갖고, 희석제로 재수화에 대한 놀라운 "순간 용해성"을 나타낸다. 5.36% 잔류 함수의 생성물에 대한 진행된 내열성 시험이 바이러스 역가의 상당한 손실에 의해 증명된 바와 같이 허용할 수 없는 파괴를 야기한다(표4).
1/2 강도 항크스(Hanks) LYE, 1% FCS 및 2.5 중량% 트레할로스를 함유하는 부형제는 한 시간의 초고속 탈수시, 우역 및 가성우역 바이러스 모두를 충분히 보호하고, 이때, 잔류 함수량은 신속하게 10%로 감소된다(표1 및 2).
5.36%에서 14일 동안 45℃에 노출은 바이러스를 파괴한다(표4). 그러나, 17시간 동안의 제2탈수의 진행은 잔류 함수 감소(1% 미만)의 예상된 효과를 나타내어 증가된 내열성을 부여한다(표3).
log103.03 TCID50/ml의 최소 역가를 유지하면서 14일 동안 45℃에의 노출 후 log1.9 TCID/50/ml 역가의 적하는 종래의 동결탈수된 "내열성'(Thermovax) 백신에서 확인된 역가에서 예상된 하강과 적절하게 비교된다. 2차건조의 단지 2시간을 수행하고, 유사하게 45℃에 노출된 가성우역 배치2에서 바이러스의 완전한 손실은 높은 잔류 함수량의 해로운 효과를 강조하고, 2차건조의 진행의 필요가 낮은 함수량을 확정하는 것을 강조한다.
실시예 3
가성우역 바이러스를 10% 태아 소 혈청 및 10% 트립토오스 포스페이트 배양액(Difco)을 함유하는 GMEM 배지(Sigma No. G6148)의 베로 세포에서 증식시켰다. 상기 세포를 ml 당 26 × 104 내지 28 × 104 세포의 농도로 150 ㎠ 플라스크 농도 에서 플라스크 당 세포 현탁액 60 ml을 추가하여 증식시켰다.
각 150 ㎠ 플라스크를 10-3 바이러스 입자/세포의 감염 다중도의 충분한 가성우역 접종 바이러스로 접종시켰다.
이른 세포병리효과(CPE)가 나타난 접종 후 4일째에, 배지를 0.1% 트레할로스 이수산기화합물(글루코오스 대신)을 갖는 2% 태아 소 혈청을 함유하는 항크스 락트알부민 효모 추출물로 대치시킨다. 이는 계속되는 탈수동안 용질 농도를 감소시키고, 삼투압을 최소화하고, 탈수시 핵단백질을 변성할 수 있는 마일라드 반응에 영향을 줄 수 있는 글루코오스 같은 설탕을 감소시킨다.
접종 후 6일째에, 세포병리효과는 80 내지 90%이었고, 상기 바이러스액을 회수하고, 밤새 냉동시킨다. 상기 냉동액을 융해시켜 내인성 바이러스를 방출시키고, -20℃에서 저장한다.
융해된 바이러스액을 16 중량% 멸균 수용성 트레할로스 이수산기화합물(DFS Ltd)과 1:1의 비율로 혼합하여 바이러스 부형제 혼합물 중의 최종 농도 8%의 트레할로스를 생성한다.
바이러스 부형제 혼합물의 1 ml 부피를 멸균성 5 ml 백신 용기에 분배하고(각 용기로 1 ml의 수분), 상기 용기는 통기 건조 부틸 고무 스토퍼로 부분적으로 막힌다(3시간 동안 130℃에서 신선하게 탈수된다.). 상기 탈수는 에드워즈 슈퍼 모듈요 냉각 건조기를 사용하여 수행된다.
상기 냉각 건조기는 미리 선반에 용기를 적하하여 준비된다. 상기 냉각기를 켜고, 냉각기 온도는 -40℃의 운전 제한에 도달하도록 한다. 선반 가열이 실시되고, 선반 온도는 40℃로 설정한다. 냉각기 도어와 배수(drain) 밸브는 닫히고, 상기 진공 펌프는 적절한 기체 안정기로 켜진다. 상기 선반 온도가 40℃에 도달할 때, 상기 용기를 선반에 적하하고, 열전기를 각 선반 위의 용기에 삽입하고, 챔버 도어를 마크로 및 마이크로 공기 어드미턴스 밸브가 완전히 열리는 것으로 닫는다.
용기의 함유물의 온도가 35℃에 도달할 때, 상기 마크로 공기 어드미턴스 밸브가 부분적으로 닫혀서 800 내지 900 mbar의 압력에 도달한다. 초기 15분 동안, 배지 중의 중탄산염으로부터 용해된 CO2를 함유하고 있는 용기내의 부형제는 서서히 탈기된다. 이 과정 동안, 트레할로스의 바이러스 지질막에 대한 접근이 발생할 수 있다.
마크로 공기 어드미턴스 밸브가 또한, 닫혀서 500 mbar로 압력을 감소시킨다. 상기 용기 중의 부형제의 온도는 대략 4.0℃로 떨어지고, 이는 증발성 냉각이 발생하는 것을 나타낸다. 부형제 온도를 감지하면서, 마이크로 공기 어드미턴스 밸브를 조심스럽게 닫아서 약 4/0℃의 온도로 안정화한다. 운전시 가장 중요한 단계는 생성물의 냉각을 유도하는 스퍼터링 및/또는 매우 급속한 증발을 피하는 것이다. 멸균 공기가 챔버 안으로 계량되어 압력 차를 제공하여, 수증기의 냉각기로의 흐름을 야기한다. 전체를 통하여, 생성물 온도는 마이크로 공기 어드미턴스 밸브의 조심스러운 제어로 4℃로 유지된다. 20 내지 30분 동안, 약 4℃의 범위에서 생성물의 온도를 유지한 후에, 약 4℃의 생성물 온도 및 300 mbar의 챔버 압력을 유지하 면서, 마이크로 공기 어드미턴스 밸브를 천천히 닫는다. 이 단계에서, 상기 생성물 부피는 시럽 농도로 상당히 감소된다. 상기 마이크로 공기 밸브는 시간에 따라 완전히 닫힌다.
1차건조 과정의 시작에서 대략 40분 후, 생성물 온도는 증가하기 시작한다. 45분 후, 상기 부형제에서 물의 부피는 증발되고, 생성물은 미세결정 벌집형 구조로 진행되고, 대략 15℃의 순간 발열이 수반되어, 트레할로스는 준안정성 포말 유리 기질로 유리모양이 된다. 이에 따라, 상기 생성물의 온도는 또한, 증발된 생성물 중의 수분으로 떨어져서 최종 함수량 10%를 갖는 생성물을 얻는다.
마크로 및 마이크로 어드미턴스 밸브가 모두 닫히고, 진공 펌프 기체 안정기 밸브가 닫히면서, 건조가 0.1 mbar의 챔버 압력에서 밤새 진행되고, 이 시간 동안 생성물 온도는 챔버의 선반의 온도인 40℃에 이른다. 건조는 24시간의 총 건조 시간을 완성할 때까지 계속되고, 상기 챔버에서 선반 온도는 44℃의 최종 온도(선반 및 생성물)에서 정점에 이르는 건조 시간의 마지막 4시간 동안, 시간 당 1.0℃로 오른다. 0.06 mbar의 챔버 압력을 유지하면서, 상기 용기가 밀봉되고, 알루미늄 덮개로 씌어진다.
본 실시예에 따라 생성된 상기 탈수된 생성물의 샘플을 14일 동안 45℃에서 저장하고, 바이러스 역가를 실시예 2에서 기술된 것처럼 측정하였다. 상기 과정에 따른 탈수된 생성물의 잔류 함수량은 대략 1.0%로 측정되었다. 14일 동안 45℃에서 저장 과정에 따라 상기 생성물은 바이러스 효능을 약간 상실하고, 이는 유용한 백신 물질을 생산하는데 적절하다.
실시예 4
실시예 3의 상기 과정을 실시예 3에서 기술된 가성우역 배양 대신에 우역 바이러스 배양을 사용하여 안정화된 우역의 제조에 대한 것이다. 상기 건조 과정은 유사하게 14일 동안 45℃에서 저장된 후에 비교적 낮은 손실을 갖는 안정화된 우역을 생산하였다.

Claims (28)

  1. (ⅰ) 생물학적-활성 물질의 수용성 현탁액과 트레할로스의 멸균 수용액을 혼합하여 혼합물 중 2.5 내지 8 중량%의 트레할로스 농도를 얻는 단계;
    (ⅱ) 상기 혼합물을 대기 보다 낮은 압력 및 0℃ 이하로 떨어지지 않도록 제어하고, 최종적으로 40℃를 초과하지 않는 37℃ 미만의 초기 온도에서 30 내지 60분 동안 1차건조시켜, 10% 미만의 잔류 함수량을 갖고, 기질내에 탈수된 생물학적-활성 물질을 함유하는 유리질 트레할로스를 포함하는 유리질 다공성 기질을 형성하는 단계; 및
    (ⅲ) 단계(ⅱ)의 유리질 다공성 기질을 0.1 mbar 미만의 압력 및 최종적으로 40 내지 45℃ 범위의 온도에서 10 내지 30시간 동안 2차건조시켜 기질내에 탈수된 생물학적-활성 물질을 함유하는 2% 미만의 잔류 함수량을 갖는 트레할로스 기질을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 살아있는 바이러스 또는 마이코플라스마를 포함하는 생물학적-활성 물질의 보존방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계(ⅲ)에서 2차건조 단계는 20 내지 30시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 생물학적-활성 물질의 보존방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 2차건조 단계는 약 37℃에서 15 내지 17시간 동안 수행되고, 상기 온도는 남은 2차건조 시간에 걸쳐서 점차로 상승되어 40℃ 내지 45℃ 범위의 최종 온도가 되는 것을 특징으로 하는 생물학적-활성 물질의 보존방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
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  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계(ⅱ)에서 상기 1차건조 단계는 800 mbar 미만의 압력에서 수행되는 것을 특징으로 하는 생물학적-활성 물질의 보존방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 단계(ⅱ)에서 1차건조의 말기에 상기 유리질 트레할로스 기질의 잔류 함수량은 약 10%인 것을 특징으로 하는 생물학적-활성 물질의 보존방법.
  20. 제1항에 있어서, 단계(ⅲ)에서 2차건조의 말기에 잔류 함수량은 1.0% 이하인 것을 특징으로 하는 생물학적-활성 물질의 보존방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 살아있는 바이러스는 우역 바이러스(Rinderpest virus), 가성우역 바이러스(Peste des Petits Ruminants virus), 홍역 바이러스(Measles virus), 볼거리 바이러스(Mumps virus), 풍진 바이러스(Rubella virus), 황열 바이러스(Yellow Fever virus), 폴리오 바이러스(Polio virus) 및 뉴우카슬병 바이러스(Newcastle Disease virus)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생물학적-활성 물질의 보존방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 살아있는 바이러스는 우역 바이러스 또는 가성우역 바이러스인 것을 특징으로 하는 생물학적-활성 물질의 보존방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 마이코플라즈마는 감염성 소 흉막폐렴 바이러스(Contagious Bovine Pleuropneumonia mycoplasma)인 것을 특징으로 하는 생물학적-활성 물질의 보존방법.
  24. 기질 내에 탈수된 살아있는 바이러스 및 탈수된 마이코플라즈마로부터 선택된 탈수된 생물학적-활성 물질을 함유하는 1% 미만의 함수량을 갖는 준안정성 유리 기질의 형태로 트레할로스를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 제조용 재수화성 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 생물학적-활성 물질은 우역 바이러스, 가성우역 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 풍진 바이러스, 황열 바이러스, 폴리오 바이러스 및 뉴우카슬병 바이러스로부터 선택된 살아있는 바이러스인 것을 특징으로 하는 백신 제조용 재수화성 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 생물학적-활성 물질은 우역 바이러스 및 가성우역 바이러스로부터 선택된 살아있는 바이러스인 것을 특징으로 하는 백신 제조용 재수화성 조성물.
  27. 제24항에 있어서, 상기 생물학적-활성 물질은 전염성 소 흉막폐렴 바이러스인 것을 특징으로 하는 백신 제조용 재수화성 조성물.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 적절한 수용성 배지에서 재수화시키는 것을 특징으로 하는 백신의 제조방법.
KR1020017014025A 1999-05-04 2000-05-03 바이러스 및 마이코플라즈마의 보존방법 KR100616195B1 (ko)

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