RU2127604C1 - Вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц - Google Patents

Abstract

Изобретение предназначено для специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц. Вакцина содержит эффективное количество вирусного материала из штамма "Винтерфилд 84-ДЕП" и стабилизатор, взятые в соотношении, мас. %, 85-95: 5-15. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным номером "Винтерфилд" 84-ДЕП. Штамм "Винтерфилд" 84-ДЕП репродуцируется как в культуре клеток ФЭК, так и на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 6,50 - 8,00 lg ТЦД₅₀/мл и 5,00-6,00 lg ЭИД_50/0,2 мл соответственно. В качестве стабилизатора используют отдельно или в комбинации обезжиренное молоко, лактозу, желатозу, сахарозу и др. Полученная вакцина представляет собой сухую однородную массу в виде цилиндрической таблетки, растворимой в воде. Цыплят вакцинируют с 7-10-дневного возраста (в зависимости от уровня материнских антител в сыворотке крови цыплят) дважды с интервалом 10 дней в дозе 1000 - 2000 ЭИД₅₀ или 10000 - 20000 ТЦД₅₀. методом выпаивания. Иммунитет птиц наступает через 21 сутки после второй вакцинации и сохраняется в течение всего восприимчивого периода. Технический результат: повышение иммуногенной и антигенной активности и безвредности препарата. 2 з.п.ф-лы, 10 табл.

Description

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств для специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц.

ИББ птиц (болезнь Гамборо) - высококонтагиозная болезнь, характеризуется поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями, диареей. В основном ИББ поражает B-лимфоциты фабрициевой сумки, вызывая атрофию ее лимфоидных фолликулов. Важным средством борьбы против ИББ, причиняющей экономический ущерб за счет гибели 20 - 40% птиц при остром ее течении, снижения привесов и проявления вторичных инфекций на фоне иммунодепрессивного воздействия вируса на организм птиц, является вакцинопрофилактика заболевания. Специфическая профилактика ИББ проводится с помощью живых и инактивированных вакцин. Преимущества живых препаратов состоят в том, что они пригодны для массового применения путем выпаивания, аэрозольного распыления и т.п., для иммунизации птиц требуется относительно малое количество иммунизирующего препарата, т.к. живой антиген продолжает размножаться в организме иммунизированной птицы, они являются более дешевыми в производстве и для их хранения требуется относительно мало места в холодильных установках.

Известна вакцина против ИББ птиц на основе штамма "52/70" [1].

Недостаток этой вакцины состоит в том, что штамм "52/70" является вирулентным, поэтому он пригоден для изготовления только инактивированной вакцины.

Известна также вакцина против ИББ птиц на основе штамма "КБК", адаптированного к перевариваемой культуре клеток почки серо-зеленой мартышки ВГМ-70 [1].

Недостатки данной вакцины состоят в том, что для репродукции вируса используют перевиваемую линию серо-зеленой мартышки, которая еще недостаточно изучена в отношении онкогенного воздействия на занятый в производстве препарат персонал, а также не изучены последствия влияния на человеческий организм мяса птицы, иммунизированной данной вакциной.

Известна также вакцина против ИББ птиц, включающая авирулентный генетически однородный вирусный материал из штамма "ВНИВИП" вируса ИББ птиц и стабилизатор, взятые в равном соотношении. Указанный штамм репродуцируется в культуре клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) с титром 10^5,5 - 10^6,0 ТЦД₅₀/мл. В качестве стабилизатора используют обезжиренное молоко. Для профилактики ИББ птицу иммунизируют до 60-дневного возраста путем дачи вакцины с водой в дозе 10^3,0 - 10^4,0 ТЦД₅₀/мл [2].

Недостаток данной вакцины состоит в том, что она обладает низкой иммуногенной активностью.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ИББ птиц, включающая вирусный материал из штамма "Винтерфилд-2512" вируса ИББ птиц и стабилизатор, взятые в эффективном соотношении. В качестве стабилизатора используют обезжиренное молоко [3].

Недостаток данной вакцины состоит в ее низкой иммуногенной активности. Это объясняется тем, что многочисленные изоляторы (2512-P48, 2512-P84, 2512 - P85, клон 2512, 1-2512, P-2512, H-2512) штамма "Винтерфилд" вируса ИББ, используемые для изготовления вакцины, при пассировании различными способами изменяют свои характеристики (иммуногенность, патогенность и др.), которые заметно отличаются от исходного вируса. Для их контроля рекомендовано использовать референтные штаммы [4].

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка вакцины против ИББ птиц на основе штамма "Винтерфилд", обладающей высокой иммуногенной активностью.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении иммуногенной активности вакцины.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ИББ птиц, охарактеризованной следующей совокупностью признаков:
1) вакцина против ИББ птиц;
2) вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП, репродуцированного в культуре клеток ФЭК с титром 6,5 - 8,0 lg ТЦД₅₀/мл или на 9-11-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром 5,0 - 6,0 lg ЭИД_50/0,2 мл;
3) вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "Винтерфилд" 84-ДЭП взят в эффективном количестве;
4) стабилизатор;
5) из стабилизаторов вакцина содержит обезжиренное молоко и/или лактозу, и/или желатозу, и/или сахарозу;
6) вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП, репродуцированного в культуре клеток ФЭК с титром 6,5 - 8,0 lg ТДЦ₅₀/мл или на 9-11-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром 5,0 - 6,0 lg ЭИД_50/0,2 мл, и стабилизатор взяты в соотношении, мас.%:
Вируссодержащий материал - 85-95
Стабилизатор - 5-15
Предлагаемое изобретение включает совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) вакцина против ИББ птиц;
2) вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП, репродуцированного в культуре клеток ФЭК с титром 6,5 - 8,0 lg ТЦД₅₀/мл или на 9-11-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром 5,0 - 6,0 ЭИД_50/0,2/ мл;
3) вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП взят в эффективном количестве;
4) стабилизатор.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения:
1) из стабилизаторов вакцина содержит обезжиренное молоко и/или лактозу, и/или желатозу, и/или сахарозу;
2) вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП, репродуцированного в культуре клеток фибробластов эмбрионов кур с титром 6,5 - 8,0 lg ТЦД₅₀/мл или на 9-11-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром 5,0 - 6,0 lg ЭИД₅₀/ мл, и стабилизатор взяты в соотношении, мас.%:
Вируссодержащий материал - 85 - 95
Стабилизатор - 5 - 15
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) вакцина против ИББ птиц;
2) вируссодержащий материал из аттенуированного штамма вируса ИББ птиц взят в эффективном количестве;
3) стабилизатор.

По сравнению с вакциной-прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются:
1) в качестве вируссодержащего материала вакцина содержит аттенуированный штамм "Винтерфилд" 84-ДЕП, репродуцированный в культуре клеток ФЭП с титром 6,5 - 8,0 lg ТДЦ₅₀/мл или на 9-11-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром 5,0 - 6,0 lg ЭИД_50/0,2 мл;
2) вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП" взят в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также и другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения:
1) из стабилизаторов вакцина содержит обезжиренное молоко, и/или лактозу, и/или желатозу, и/или сахарозу;
2) вируссодержащий материал из аттенуированного штамма вируса "Винтерфилд" 84-ДЕП, репродуцированный в культуре клеток ФЭК с титром 6,5 - 8,0 lg ТЦД₅₀/ мл или на 9-11 суточных СПФ-эмбрионах кур с титром 5,0 - 6,0 lg ЭИД_50/0,2 мл, и стабилизатор взяты в соотношении, мас.%:
Вируссодержащий материал - 85 - 95
Стабилизатор - 5 - 15.

По сравнению с прототипом штамм "Винтерфилд" 84-ДЕП обладает более высокой иммуногенной активностью.

Экспериментально подтверждена возможность его использования для приготовления живой вакцины против ИББ птиц.

Исходный вирус для получения штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП выделен от больной птицы в США в 1965 году. Поступил в ВГНКИ в 1993 году с неизвестными характеристиками. В результате проведения трех перемежающихся пассажей штамм "Винтерфилд-2512" на СПФ-эмбрионах кур и СПФ-цыплятах 20-30-суточного возраста получен модифицированный штамм, отличающийся от исходного более высокой иммуногенной активностью. Полученный штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации (ВГНКИ) 21.06.96 г. под регистрационным номером "Винтерфилд" 84-ДЕП.

Штамм "Винтерфилд" 84-ДЕП вируса ИББ птиц характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства
Штамм "Винтерфилд" 84-ДЕП вируса ИББ птиц (Bursistis infectiosa gallinae) относится к семейству Birnaviridae, роду Avibirnavirus, Серотипу 1, обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ИББ: форма вириона экосаэдрическая, размер вириона 58-60 нм. Капсид- T 13, внешняя оболочка отсутствует.

Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм "Винтерфилд" 84-ДЕП относится к сероварианту 1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой.

Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антилет, выявляемых в РДП в разведении 1: 2 - 1:32, в ИФА - 1:400 - 1:6000 и более, при гипериммунизации - в РПД - до 2048 и выше, в ИФА - до 1:10000 и более. При определении антигенного соответствия вакционного штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП с полевыми изолятами вируса ИББ было проведено сравнение вариабельной области VP₂37 полевых изолятов, выделенных в 1993-96 гг. на территории РФ и странах СНГ и 7 образцов коммерческих живых вакцин. Для этого в ПЦР амплифицировали, используя специфические олигонуклеотидные праймеры и термостабильную Tag-ДНК-полимеразу, вариабельную область гена VP₂, кодирующую основной конформационный эпитоп.

Методом прямого секвенирования определяли нуклеотидную последовательность этого наиболее важного в проявлении антигенных свойств участка генома полевых изолятов и вакционного штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП ИББ.

Установлено, что большинство полевых изолятов вируса ИББ, выделенных на птицефабриках России, антигенно отличаются от импортных вакцинных штаммов фирм "Рон-Мерье" (Франция), "Интервет" (Голландия), "Солвей Дюфар" (США), "Сафит" (Израиль) и имеют более близкую структуру к штамму "Винтерфилд" 84-ДЕП.

Биотехнические характеристики
Штамм "Винтерфилд" 84-ДЕП проявляет высокую биологическую, иммуногенную и антигенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, в также высокую степень гомологии (≈ 96%) при сравнении с многочисленной группой изоляторов, выделенных на территории РФ в 1993-1996 гг.

Штамм "Винтерфилд" 84-ДЕП предназначен для использования в качестве сырья для приготовления живой вакцины против ИББ птиц. Этот штамм репродуцируется в культуре клеток ФЭК, а также в 10-суточных СПФ-эмбрионов кур при 37,7^oC и влажности 55-60%. В течение 72 - 96 часов инкубирования вирус накапливается до 5,0 - 6,0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл при титровании на СП-эмбрионах кур или до 6,5-8,0 lg ТЦД₅₀/мл при титровании в культуре клеток ФЭК. Штамм "Винтерфилд" 84-ДЕП является стабильным и безвредным.

Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм "Винтерфилд" 84-ДЕП является РНК-содержащим вирусом с мол. массой 2,16 • 10⁶ Д. Нуклеиновая кислота является 2-нитевой, 2-сегментной (A и B).

Вирион содержит 5 видов белков (VP₁-VP₅):
VP₁-РНК -зависимая РНК-полимераза;

VP₄ - протеаза;
VP₅ - не идентифицирован.

Липиды отсутствуют.

Штамм "винтерфилд" 84-ДЕП проявляет генетическую стабильность. Основная масса мутаций сосредоточена в VP₂. Аминокислотные изменения в VP₂ определяют антигенную вариабельность.

Сегмент A нуклеиновой кислоты содержит 2 частично перекрывающие открытые рамки для считывания малого VP₅ и большого полипротеинового предшественника белков VP₂ и VP₃. Сегмент B кодирует VP₁.

Физические свойства
Масса вириона - 55 • 10⁶ D. Коэффициент седиментации - 460S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,33 - 1,34 г/мл в градиенте CsCl.

Устойчивость к внешним факторам
Штамм "Винтерфилд" 84-ДЕП устойчив к растворителям (эфиру, хлороформу) и детергентам, чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению γ- - облучению и высыханию.

Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - 90%.

Реактогенность отсутствует.

Патогенность отсутствует.

Вирулентность отсутствует.

Онкогенность отсутствует.

Контагиозность отсутствует.

Стабильность аттенуации отмечена при повреждении 5 пассажей на чувствительных цыплятах.

По сравнению с прототипом вирусвакцина на основе аттенуированного штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП обладает более высокой иммуногенной активностью, является безвредной и способна преодолеть материнские антитела против ИББ птиц.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволил установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в предлагаемой вакцине, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемой вакцины условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения.

Результаты поиска показали, что предлагаемая вакцина не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения.

Пример 1.

На первом этапе готовят монослой клеток ФЭК. Для этого тушки эмбрионов кур измельчают до кусочков размером 2-3 мм. Измельченную эмбриональную ткань отмывают от эритрицитов 3-4 раза фосфатно-буферным раствором (ФБР) до получения прозрачных сливных вод, после чего осадок измельченной ткани помещают в емкость и заливают рабочим 0.25% раствором трипсина. Емкость устанавливают на термостатирующую магнитную мешалку на 20-30 минут. По истечении времени контакта раствор фермента сливают, а в емкость наливают ФБР и помещают на термостатирующую магнитную мешалку. Через каждые 20 минут проводят слив ФБР со взвешенными клетками в центрифужные стаканы. К оставшейся ткани вновь добавляют ФБР и перемешивают до полного расщепления тканевых фрагментов. Оставшийся осадок стерильно сливают в центрифужный стакан и центрифугируют 20 минут при 800-1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в ростовой среде в объеме 50-100 см³. Из этого объема берут 0,2 см³ для подсчета клеток в камере Горяева. В клеточную суспензию добавляют антибиотики и разливают в культуральные сосуды. Сплошной клеточный монослой образует через 24-48 час. Для заражения отбирают сосуды со сплошным монослоем ФЭК при отсутствии подозрений на бактериальный пророст. Используя вакуум, из культуральных сосудов удаляют ростовую среду и вносят в таком же объеме промывающий раствор, в качестве которого используют раствор Хенкса или ФБР. Затем сосуды подвергают вращению со скоростью 5 ± 2 об/мин в течение 10-15 мин. Промывающий раствор удаляют также, как и ростовую среду. Промывку монослоя повторяют в таком же режиме. Инфицирующую смесь для заражения монослоя клеток готовят путем разведения исходного штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП вируса ИББ птиц в среде Игла, ГЛАх и 199 в 20-500 раз вносят в сосуд с монослоем объем, равный 1/5-1/6 среды роста, что соответствует множественности заражения 0,01-0,001 ТЦД₅₀ вируса на клетку. Контакт вируса с клетками осуществляют при температуре 37 ± 1^oC в течение 1-1,5 час. После этого инокулят с неадсорбировавшимся вирусом удаляют. Монослой клеток промывают. Затем в культуральные сосуды вносят поддерживающую среду, состоящую из среды Игла, ГЛАх, 199 без добавления сыворотки.

Вирус выращивают при 37^oC в течение 96-104 часов до проявления ЦПД на 90-100%. После этого культуральные сосуды встряхивают для снятия клеток в поддерживающую среду. Вируссодержащую жидкость собирают в маркированные мерные емкости с помощью вакуума и помещают в холодильник при температуре 4^oC на 18-20 часов. После отстаивания надосадочную вируссодержащую жидкость переносят с помощью вакуума в стерильную емкость. Емкость с вируссодержащей жидкостью устанавливают в металлический контейнер и помещают в низкотемпературный холодильник. Размораживание вируссодержащей жидкости производят термолизом при температуре 37 ± 1^oC. Осветление вируссодержащей жидкости осуществляют отстоем в течение 18-20 часов при 4 ± 2^oC. К стерильному полуфабрикату добавляют стабилизатор, в качестве которого можно использовать отдельно или в комбинации обезжиренное молоко, лактозу, желатозу, сахарозу и др. Полученную вакцину перемешивают на шуттель-аппарате и расфасовывают в стерильные флаконы по 4 мл. Замораживание вакцины проводят в холодильных установках при температуре минус 48-50^oC с последующим высушиванием препарата методом сублимации. Продолжительность сушки - 59 - 68 суток. Полученная вакцина представляет собой сухую однородную массу в виде таблетки цилиндрической формы розового или желтоватого цвета. Хорошо растворяется в воде без образования хлопьев и осадка.

Вакцину применяют с профилактической целью в хозяйстве, где не регистрируют клинических и патологических признаков проявления ИББ. Цыплят вакцинируют с 7-10-дневного возраста дважды с интервалом 10-14 дней в дозе 10000-20000 ТЦД₅₀ методом выпаривания. После второй вакцинации иммунитет у птиц наступает через 14-21 день и сохраняется в течение всего восприимчивого к ИББ периода.

Полученная вакцина против ИББ птиц имеет оптимальный компонентный состав, мас.% (см.табл.1).

Содержание вируссодержащего материала в диапазоне 85 - 95 мас.% представляет собой эффективное количество антигена в предлагаемой вакцине. Полученная вакцина при титровании на культуре клеток ФЭК имеет титр 6,5 - 8,0 ТЦД₅₀/мл.

Пример 2.

Проведены испытания вакцины, содержащей, мас.%:
Вируссодержащий материал из штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП вируса ИББ птиц, репродуцированного в культуре клеток ФЭК с титром биологической активности 7,25 lg ТЦД₅₀/мл - 85
Стабилизатор - 15
Определение иммуногенной активности проводили на цыплятах. Для этого предварительно готовили 10-кратные разведения вакцины и каждым разведением вакцины иммунизировали по 10 цыплят путем выпаривания. Иммуногенную активность лиофилизированной вакцины оценивали по результатам контрольного заражения цыплят в опытной и контрольной группах через 21 сутки после введения вакцины. Опыты проводили трехкратно. Результаты исследований представлены в табл. 2.

Данные табл. 2 свидетельствуют о том, что разведенная в 1000 раз вакцина обеспечивает 80-90% защиту цыплят, а выпаривание вакцины с водой является эффективным способом массовой вакцинации птиц.

Пример 3.

Проведены испытания вакцины, содержащей, мас.%: вируссодержащий материал из штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП вируса ИББ птиц, репродуцированного в культуре клеток ФЭК с титром биологической активности 7,5 lg ТЦД₅₀/мл - 90; стабилизатор - 10.

Определение иммуногенной активности проводили на цыплятах. Для этого предварительно готовили 10-кратные разведения вакцины и каждым разведением вакцины иммунизировали по 10 цыплят путем вынашивания. Иммуногенную активность лиофилизированной вакцины оценивали по результатам контрольного заражения цыплят в опытной и контрольной группах через 21 суток после введения вакцины. Опыты проводили трехкратно. Результаты исследований представлены в таблице 3.

Данные таблицы 3 свидетельствуют о том, что разведенная в 1000 раз вакцина обеспечивает 80-90% защиту цыплят, а выпаивание вакцины с водой является эффективным способом массовой иммунизации птиц
Пример 4.

Проведены испытания вакцины, содержащей, мас.%: dируссодержащий материал из штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП вируса ИББ птиц, репродуцированного на культуре клеток ФЭК с титром биологической активности 7,25 lg ТЦД₅₀/мл - 95; cтабилизатор - 5.

Определение иммуногенности проводили на цыплятах. Для этого предварительно готовили 10-кратные разведения вакцины и каждым разведением вакцины иммунизировали по 10 цыплят путем выпаривания.

Иммуногенную активность лиофилизованной вакцины оценивали по результатам контрольного заражения цыплят в опытной и контрольной группах через 21 сутки после введения вакцины. Опыты проводили трехкратно.

Результаты исследований представлены в табл.4.

Данные табл. 4 свидетельствуют о том, что разведенная в 1000 раз вакцина обеспечивает 80-90% защиту цыплят, а выпаивание вакцины с водой является эффективным способом массовой иммунизации.

Пример 5.

На первом этапе готовят матровый материал из штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП вируса ИББ птиц. Полученную вирусосодержащую жидкость используют для массового заражения 10-суточных СПФ-эмбрионов кур. Вирусный материал в количестве 0,2 мл инокулируют на хориоаллантоисные оболочки (ХАО) и инкубируют при 37,7^oC 48-120 часов. Павшие эмбрионы разделывают, замораживают при -40^oC и полученное сырье используют для приготовления вакцины. Вирусный материал размораживают, измельчают на коллоидной мельнице, экстрагируют при 40^oC в течение 45 минут, дважды промораживают-оттаивают, добавляют фосфатный буфер с pH 7,5 и центрифугируют в течение 20 минут при 3000 об/мин.

Вирусосодержащую надосадочную жидкость осторожно сливают в стерильных условиях, а затем добавляют стабилизатор, в качестве которого можно использовать (отдельно или в комбинации) обезжиренное молоко, лактозу, желатозу, сахарозу и др. , расфасовывают во флаконы, промораживают при -60 (-80^oC) и подвергают лиофилизации. Лиофилизированный материал закупоривают под вакуумом и подвергают исследованию на иммуногенность (на 14-дневных СПФ-цыплятах) и на безвредность (на 30-дневных СПФ-цыплятах).

Полученная вакцина представляет собой сухую однородную массу розово-коричневого цвета в виде цилиндрической таблетки, растворимой в воде. При растворении в воде до исходного объема она превращается в стойкую однородную суспензию розово-коричневого цвета.

Вакцину применяют с профилактической целью в хозяйствах, где не регистрируют клинических и патологоанатомических признаков проявления ИББ. Цыплят вакцинируют с 7-10-дневного возраста (в зависимости от наличия материнских антител) дважды с интервалом в 10 дней в дозе 1000-2000 ЭИД₅₀ методом выпаивания.

Иммунитет у птиц наступает через 21 сутки после второй вакцинации и сохраняется в течение всего восприимчивого к ИББ периода.

Полученная вакцина против ИББ птиц имеет оптимальный компонентный состав, мас.% (см. таблицу 5).

Полученная вакцина при титровании на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур имеет титр 5,0-6,0 lg ЭИД_50/0,2 мл.

Пример 6.

Проведены испытания вакцины, содержащей, мас.%: вирусосодержащий материла штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,00-6,00 lg ЭИД_50/0,2 мл - 85; cтабилизатор - 15.

Определение иммуногенной активности проводили на цыплятах. Для этого предварительно готовили 10-кратные разведения вакцины и каждым разведением иммунизировали по 10 цыплят путем выпаивания. Иммуногенную активность лиофилизованной вакцины оценивали по результатам контрольного заражения цыплят в опытной и контрольной группах через 21 сутки после введения вакцины. Опыты проводили трехкратно. Результаты исследований приведены в табл. 6.

Данные табл.6 свидетельствуют о том, что разведенная в 1000 раз вакцина обеспечивает 80-90% защиту цыплят, а выпаивание вакциной с водой является эффективным способом массовой вакцинации птиц.

Пример 7.

Проведены испытания вакцины, содержащей, мас.%: вирусосодержащий материал из штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП" вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10-суточных эмбрионах кур с титром биологической активности 5,00-6,00 lg ЭИД_50/0,2 мл - 90; cтабилизатор - 10.

Определение иммуногенной активности проводили на цыплятах. Для этого предварительно готовили 10-кратные разведения вакцин и каждым разведением иммунизировали по 10 цыплят путем выпаивания.

Иммуногенную активность лиофилизованной вакцины оценивали по результатам контрольного заражения цыплят в опытной и контрольной группах через 21 сутки после введения вакцины. Опыты проводили трехкратно. Результаты исследований приведены в табл.7.

Данные табл.7 свидетельствуют о том, что разведенная в 1000 раз вакцина обеспечивает 80-90% защиту цыплят, а выпаивание вакцины с водой является эффективным способом массовой вакцинации птиц.

Пример 8.

Проведены испытания вакцины, содержащей, мас.%: вирусосодержащий материал из штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП вируса ИББ птиц, репродуцированного на 10-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром биологической активности 5,00-6,00lg ЭИД_50/0,2 мл - 95; cтабилизатор - 5.

Определение иммуногенной активности проводили на цыплятах. Для этого предварительно готовили 10-краткие разведения вакцины и каждым разведением иммунизировали по 10 цыплят путем выпаивания. Иммуногенную активность лиофилизованной вакцины оценивали по результатам контрольного заражения цыплят в опытной и контрольной группах через 21 сутки после введения вакцины. Опыты проводили трехкратно. Результаты исследований приведены в табл. 8.

Данные табл. 8 свидетельствуют о том, что разделенная в 1000 раз вакцина обеспечивает 80-90% защиту цыплят, а выпаивание вакцины с водой является эффективным способом массовой вакцинации птиц.

Пример 9.

Сравнительная оценка вирусвакцин против ИББ птиц.

В опытах были использованы вакцины из штамма "Тавиар" (Италия), из штамма "Д-78" (Голландия), из штамма "Гумбораль СЕ" (Франция), из штамма "ВНИВИП" (Россия), из штамма "Винтерфилд-2512" и из штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП (Россия).

Изучение эффективности указанных вакцин проводили на СПФ-цыплятах 14-дневного возраста.

Всем цыплятам инокулировали орально по одной дозе из указанных выше вакцин. Оценку эффективности вакцин проводили по результатам контрольного заражения вирулентным штаммом 52/70 вируса ИББ всех групп цыплят через 21 сутки после их вакцинации. Результаты исследований приведены в табл.9.

Данные табл. 9 свидетельствуют о том, что при контрольном заражении вакцинированных цыплят вирулентным штаммом 52/70 вируса ИББ в дозе 10⁴ ТЦД₅₀/мл вакцина из штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП превосходит прототип.

Пример 10.

В лабораторных экспериментах и в условиях птицехозяйств РФ проведена сравнительная оценка иммуногенной активности культуральных и эмбриональных образцов вакцины из штамма "Винтерфилд" 84-ДЭП. Результаты исследований приведены в табл.10.

Данные табл. 10 свидетельствуют о том, что существенных различий не установлено между иммуногенностью вакцин из культурального и эмбрионального вирусосодежащего сырья штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП.

Таким образом приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- вакцина из штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной медицине в биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- вирусвакцина из штамма "Винтрфилд" 84-ДЕП вируса ИББ, полученная в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации
1. Патент РФ N 2054038; МПК⁶ C 12 N 7/00, C 12 R 1/92; 10.02.96.

2. Авт.свид. СССР N 1824443; МПК⁵ C 12 N 7/00, A 61 K 39/12, 30.06.93 г.

3. Winterfield R.W. et al. Immune response and pathogenecity of different strains of infectious bursal disease virus applied as vaccines. Avian Dis., 1978, 22, 4, 721-731 (прототип).

4. Winterfield R.W. et al. Characteristics of apparent derivates of the 2512 strain of infectious Bursal Disease virus when used as vaccines. Avian Dis., 1981, 25, 4, 900-910.

5. Winterfield R. W. Immunity response to the infectious bursal agent. Avian Dis., 1969, 13, 548-557.

6. Авт. свид. СССР N 1668392; МПК⁵ C 12 N 7/00, A 61 K 39/12; 07.08.91.

7. Патент США N 4530831; МПК⁴ A 61 K 39/12, C 12 N 7/00; 23.07.85 г.

8. Пат США N 5192539; МПК⁵ A 61 K 39/12, C 12 N 7/00; 09.03.93 г.

9. Алиев А.С. Специфическая профилактика инфекционного бурсита кур//Ветеринария. - 1991.-3,3.

Claims (3)

1. Вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц, включающая вируссодержащий материал из аттенуированного штамма вируса инфекционной бурсальной болезни птиц и стабилизатор, отличающаяся тем, что в качестве вируссодержащего материала вакцина содержит аттенуированный штамм "Винтерфилд" 84-ДЕП вируса инфекционной бурсальной олезни птиц, репродуцированный в культуре клеток фибробластов эмбрионов кур с титром 6,5 - 8,0 lg ТЦД₅₀/мл или на 9 - 11-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром 5,0 - 6,0 lg ЭИД_50/0,2 мл и взятый в эффективном количестве.

2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из стабилизаторов вакцина содержит обезжиренное молоко, и/или лактозу, и/или желатозу, и/или сахарозу.

3. Вакцина пп.1 и 2, отличающаяся тем, что вируссодержащий материал из аттенуированного штамма "Винтерфилд" 84-ДЕП, репродуцированного в культуре клеток фибробластов эмбрионов кур с титром 6,5 - 8,0 lg ТЦД₅₀/мл или на 9 - 11-суточных СПФ-эмбрионах кур с титром 5,0 - 6,01 lg ЭИД_50/0,2 мл, и стабилизатор взяты в соотношении, мас.%:
Вируссодержащий материал - 85 - 95
Стабилизатор - 5 - 15

Images