DE2405675A1

DE2405675A1 - Verfahren zur inaktivierung von viren und die herstellung von vakzinen

Info

Publication number: DE2405675A1
Application number: DE19742405675
Authority: DE
Inventors: Kostadin Apostolov; Vladimir Damjanovic
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1973-02-07
Filing date: 1974-02-06
Publication date: 1974-08-15
Also published as: JPS49109520A; FR2215946A1; NL7401610A; BE810697A; ES422966A1; IL44143A0; AU6525274A

Description

DR. BERG DIPL.· ENG. STAPF

PATENTANWÄLTE β MÜNCHEN 8O. MAUERKIRCHERSTR. 45

Anwaltsakte 24 766 6. Februar 1974'

Be/Sch

THE Wellcome Foundation Ltd. London / England

"Verfahren zur Inaktivierung von Viren und die Herstellung von Vakzinen"

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inaktivierung von Viren, durch das die Infektionswirkung der Viren zerstört wird, während ihre antigenen Eigenschaften beibehalten werden, und im besonderen betrifft das Verfahren die Inaktivierung von Viren der Myxovirusgruppe.

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Bekannt sind verschiedene Versuche, die infizierenden Eigenschaften, d.h. die Fähigkeit der Verursachung von Krankheiten, von Viren in einer solchen Weise zu verringern oder zu ■ entfernen, daß sie in Vakzinen Verwendung finden könnten.. Dies kann beispielsweise durch Abschwächung der Virulenz bewirkt werden, d.h. durch Schwächen des Virusstamms durch Reihenpassagen, die den Virus in einer solchen Weise ändern, daß er im wesentlichen seine gesamte Pathogenität verliert, ohne daß er seine Fähigkeit aufgibt, eine ausreichende immunogene Reaktion auszulösen. Es ist jedoch die- Immunogenität der abgeschwächten Viren oftmals nicht ausreichend und es besteht immer das Risiko, daß sie in ihren virulenten Zustand wieder zurückkehren können.

Ein weiteres, dem Fachmann bekanntes Inaktivierungsverfahren besteht darin, daß man chemische oder physikalische Mittel verwendet, die die proteinhaltige Grundsubstanz und andere Bestandteile des Virus angreifen und denaturieren, wodurch er seine Fähigkeit zur Vermehrung verliert. So wurde beispielsweise gefunden, daß Angehörige der Myxovirusgruppe in wäßriger Suspension dadurch inaktiviert werden können, daß man die Suspension mit Diäthyläther oder mit einem halogenierten Lösungsmittel in Gegenwart eines hydrophilen Emulgiermittels, wie Polyoxyäthylensorbitanmono-oleat, in ι ontakt bringt. Bei diesem Verfahren wird die äußere Schicht fragmentiert, während die Hämagglutinationsaktivität beibehalten oder sogar erhöht wird. Es werden jedoch auch

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einige andere Eigenschaften des Virus, die auch die Antigenwirkung betreffen, nachteilig zerstört werden und es kann dies die Ursache für viele enttäuschende Ergebnisse sein, wenn Vakzinierungen mit solchen Vakzinen durchgeführt werden.

Es ist weiterhin bekannt, daß Formalin, das Myxoviren und viele andere Virusarten inaktiviert, notwendigerweise die Proteinbestandteile dieser Organismen denaturiert. So wird beispielsweise im Falle des Sendai-Virus ein wesentlicher Teil der hämolytischen Eigenschaft auf diese Weise zerstört. Es kann daher, während die Hämagglutinierungsaktivität, die gewöhnlich mit den immunogenen Eigenschaften der Myxoviren und bestimmter anderer Viren in Verbindung'steht, gewöhnlich beibehalten wird, wenn solche Inaktivierungsverfahren verwendet werden, die Zerstörung oder Teilzerstörung der hämolytischen Aktivität oder irgendeiner anderen antigenen Aktivität für den nicht ausreichenden Schutz verantwortlich zu machen sein, der bei einigen Vakzinen anzutreffen ist, die man durch Inaktivierungen nach bekannten und bevorzugten Verfahren erhalten hat.

Es wurde neuerdings durch Apostolov, K., (J. Gen. Virol., 1972, 15, 227-234) nachgewiesen, daß die Hämolyse mit einer feinkörnigen Schicht assoziiert ist, die als eine "nanogranulare Schicht" bezeichnet wurde. Diese nanogranulare Schicht, die die innerste der die zentralen Komponenten

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einbettenden Virenschichten ist, kann eine Lysis und Verschmelzung mit der Membrane eines roten Blutkörperchens eingehen, nachdem mittels der Stacheln auf der Oberfläche des Virus eine Befestigung erfolgt ist. Danach folgt die Abgabe der inneren Komponenten des Virus in das rote Blutkörperchen unter nachfolgender Hämoglobinabgabe durch die Brüche in dem unstabilen Teil der integrierten Membrane. Es wird daher angenommen, daß der nanogranularen Schicht bei dem Hämolysenverfahren eine sehr große Bedeutung zukommt und daß sie demzufolge für einige der antigenen Eigenschaften des Virus verantwortlich zu machen ist. Es ist daher als wünschenswert anzusehen, daß die nanogranulare Schicht und ebenso irgendeine andere proteinhaltige Komponente, die durch die Einwirkung chemischer Mittel gewöhnlich zerstört werden, nach Inaktivierung unbeschädigt bleiben.

Es wurde nunmehr gefunden, daß eine vollständige Inaktivierung dadurch erreicht werden kann, daß man einen Virus der Wärmebehandlung unterwirft, der zuvor in Gegenwart eines proteinhaltigen Stabilisators gefriergetrocknet wurde. Eine solche Behandlung kann für jede Virusart verwendet werden, vorausgesetzt daß sie zur Gefriertrocknung geeignet ist. So treten beispielsweise häufig bei der Gefriertrocknung von Picornaviren Schwierigkeiten auf und es wird daher empfohlen, das Inaktivierungverfahren der vorliegenden Erfindung nicht bei derartigen Virusarten anzuwenden.

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Es wurde weiterhin gefunden, daß wenn man das Inaktivierungsverfahren dieser Erfindung bei Virusarten verwendet, die eine nanogranulare Schicht aufweisen, der Virus inaktiviert wird, während die Schicht unzerstört bleibt. Dies ist besonders vorteilhaft bei solchen Viren, die zur Hämolyse geeignet sind, weil durch die Behandlung die hämolytische Aktivität» die mit der nanogranularen Schicht solcher Viren in Verbindung steht, durch die Behandlung sogar verbessert werden kann. Es ist dies etwas überraschend, weil bisher die hämolytische Eigenschaft durch verschiedene Autoren (Kohn, A., Virol., 1965, 26, 228 und Apostolov, K., J. Gen. Virol., und angegebene Veröffentlichungen) als wärmeempfindlicher als die Hämagglutinationseigenschaft angesehen wurde.

Die Erfindung betrifft demgemäß ein Verfahren zur Inaktivierung von Viren, wozu man den Virus in Gegenwart eines proteinhaltigen Stabilisators gefriertrocknet und das so erhaltene Virus- und Stabilisatorpräparat bei einer erhöhten Temperatur ausreichend lange erhitzt, um eine vollständige Inaktivierung zu bewirken.

Die genaue_r zur Verwendung vorgesehene Temperatur wird von der Virusart, dessen Inaktivierung man wünscht, abhängen, wobei jedoch vorteilhaft die Temperatur im Bereich von 50 bis 15O⁰G, vorzugsweise von 90 bis 125°C liegt. Weiterhin wird die Zeitdauer, die das Präparat erhitzt wird, von der Temperatur abhängen, bei der die Inaktivierung "durchgeführt

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wird. Es ist klar, daß man mit einer hohen Temperatur weniger Zeit zur Inaktivierung des Virus benötigt als bei einer niederen Temperatur. Wenn man jedoch eine Temperatur im Bereich von 90 bis 125°C auswählt, sollte die Dauer wesentlich geringer als eine Stunde, beispielsweise 5 bis 35 Minuten sein.

Zu geeigneten proteinhaltigen Stabilisatoren, die nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, gehören eine Zubereitung, beispielsweise SPGA, aus Saccharose, Phosphat, Glutamin und insbesondere Albumin (siehe Bovarnick, M.R., J. Bacteriol., 1950, 59, 509). Es ist «jedoch darauf hinzuweisen, daß SPGA bei Verwendung höherer Temperaturen als 115^OC wegen der Karamelisierung der Zuckerkomponente ungeeignet ist. Ähnliche Zubereitungen ohne die Zuckerkomponente, bei denen die Albuminkomponente durch andere Profeine, beispielsweise Gasein, ersetzt ist, können mit oder ohne Phosphat oder Glutaminkomponenten ebenso geeignet sein.

Die bevorzugten proteinhaltigen Stabilisatoren sind Proteinlysate, die wärme- und sauer-abgebaute Gelatine enthalten können, beispielsweise "Sol-U-Pro", und die mit oder ohne Sorbitol verwendet werden können.

Die Menge des proteinhaltigen Stabilisators, die verwendet werden sollte, beträgt normalerweise wenigstens 0,1 <ug pro Hämagglutinationseinheit, beispielsweise 1 bis 30 ,ug pro

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Hämagglutionationseinheit im lalle des Sendai-Virus, etwa 25 mg pro Hämagglutinationseinheit im Falle des Masernvirus und etwa 3 mg pro Hämagglutinationseinheit im Falle des Influenza-Virus. Überschüssige Mengen an proteinhaltigem Stabilisator, beispielsweise um das mehrfache größere Mengen, sind nicht als schädlich anzusehen.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Virus, sofern er nach dem hier beschriebenen Verfahren inaktiviert ist.

Zu Viren, die sich für die Gefriertrocknung eignen, gehören Angehörige der Myxovirus- und Adenovirus-Gruppen. Zu der Myxovirusgruppe gehört im besonderen die Orthomyxovirusgruppe, zu der M. influenzae-A, M. influenzae-B und M.influenzae-C und M-rmultiformae (Newcastle Krankheitvirus) und die Paramyxovirusgruppe, zu der M.parainfluenzae-1 (beispielsweise der Stamm, der als Sendai-Virus bekannt ist), M.parainfluenzae-2 (akuter Laryngotracheobronchitis-Virus), M.parainfluenzae-3 (Hämäadsorptionsvirus), M.parainfluenzae-4 (M. 25 Virus), M.pestigalli (Hühnerpestvirus), M.parotidis (Mumpsvirus), Masernvirus (Hunde-)-Staupevirus, Rinderpestvirus und Virus des Synzytiums der Atemwege.

Wie vorausgehend erwähnt, erhält die Verwendung des Inaktivierungsverfahrens dieser Erfindung die nanogranulare Schicht, während der Myxovirus selbst inaktiviert wird.

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Demgemäß schafft die Erfindung weiterhin einen inaktivierten Myxovirus mit einer im wesentlichen intakten nanogranularen Schicht.

Viren werden gewöhnlich in befruchteten Eiern oder Zellkultursystemen gezüchtet und sie werden durch geeignete Reinigungsverfahren in eine zellfreie Form gebracht. Das den Virus enthaltende Medium, das im wesentlichen frei ist von Zelltrümmern und anderen Verunreinigungen, enthält gewöhnlich Mittel zur Einstellung des p„-Wertes und der osmotischen Bedingungen der Lösung, wie Puffer und anorganische Salze, zum Beispiel Phosphat oder Veronal bzw. Kochsalz 1 ö sungen.

Die Konzentration des lebenden Virus in der Suspension wird gewöhnlich durch Hämagglutinationsuntersuchungen bestimmt. Hierzu stellt man Serienverdünnungen der VinBsuspension her, bis die letzte Verdünnung, die eine 5O#ige Hämagglutination mit dem gleichen Volumen einer O,5#igen Erythocytsuspension liefert, bestimmt ist. Der reziproke Wert ist der Hämagglutinationstiter. Die Konzentration des Virus kann weiterhin dadurch bestimmt werden, daß man eine andere Vireneigenschaft, wie die Ansteckungsfähigkeit oder Komplementbindung, bestimmt. Diese Verfahren können bevorzugt werden, wenn entweder der Virus rote Blutkörperchen nicht agglutiniert oder die Konzentration des Virus normalerweise nicht mittels Hämagglutination gemessen werden kann. Für die Zwecke der

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vorliegenden Erfindung wird die Menge des wirksamen, in der Probe vorhandenen Virus in Hämagglutinationseinheiten ausgedrückt, die den Wert des oben definierten Titers angeben.

Der proteinhaltige Stabilisator kann dann in geeigneten Mengen mit der Virussuspension gemischt und in geeignete Behälter, wie Glasampullen oder Fläschchen, abgefüllt werden. Die erhaltene Suspension kann dann nach bekannten Verfahren gefriergetrocknet werden. Beispielsweise kann die Suspension mit einer Geschwindigkeit von etwa 1°C/Min. eingefroren werden, bis eine Endtemperatur von -30 bis -40⁰C erreicht ist. Die Kammer wird dann abgepumpt und,sobald ein Vakuum von 0,03 bis 0,05 Torr erreicht ist, erhöht man die Temperatur auf einen Bereich von 0 bis -10⁰C und führt das erste Trocknen während 12 bis 20 Stunden' durch. Die Temperatur der Kammer wird dann weiter auf 25 bis 35°C erhöht und das zweite Trocknen wird dann 2 bis 10 Stunden durchgeführt, wonach der Behälter unter Vakuum verschlossen wird.

Das gefriergetrocknete Präparat aus Virus und Stabilisator kann dann in einem flüssigen Bad oder irgendeiner anderen geeigneten Erhitzungsvorrichtung erhitzt werden, um die Inaktivierung des Virus zu bewirken. Der erhaltene Virus kann das Primärvakzin bilden und kann als solches nach geeigneter Untersuchung verwendet werden. Wenn gewünscht, kann das Vak-ζin durch Reinigung oder Konzentration mittels bekannter Verfahren weiter verbessert werden.

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Es wurde festgestellt, daß diese durch Erhitzung inaktivierten Vakzine sehr vorteilhafte Lagereigenschaften im Vergleich zu Vakzinen haben, bei denen der Virus chemisch inaktiviert wurde. Beispielsweise unterliegen häufig Formalin-behandelte Viren, die übliche Komponenten von vielen Vakzinen sind, einer Teilzersetzung nach etwa 2 Jahren durch eine unerwünschte verzögerte Wirkung des verbliebenen Formaldehyds. Andererseits können gefriergetrocknete, durch Wärme inaktivierte Viren viel längere Zeit gelagert werden, ohne daß ein wesentlicher Zerfall eintritt. '

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Vakzin gegen durch virulente, Krankheit-bildende Viren verursachte Infektionen bei empfänglichen Menschen und Tieren, das Partikel eines geeigneten Virus, inaktiviert nach dem vorausgehend definierten Verfahren und immunogen im Hinblick auf die gleiche Krankheit, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.

Viruspartikel können daher durch einfaches Mischen mit einer geeigneten Trägerkomponente, die ein Feststoff, eine Flüssigkeit oder ein Gas sein kann und wünschenswerterweise inert und medizinisch annehmbar ist, entweder vor der Lagerung, vorzugsweise bei gesenkten Temperaturen oder unmittelbar vor Verwendung kombiniert v/erden. Der Träger i:ann weiterhin ein geschlossener Behälter, der die Viruspartikel enthält, sein. V/enn gewünscht,

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können weitere pharmakologisch wirksame Substanzen ebenso in dem Vakzin vorhanden sein, das vorzugsweise -in Form von Dosierungseinheiten oder in Form von mehreren Dosen dargeboten wird, die eine wirksame Dosis für das einzelne bzw. mehrere zur Vakzinierung vorgesehenen Individuen darstellt.

Zur parenteralen Verabfolgung kann das Vakzin in Behältern für Dosierungseinheiten oder mehrere Dosen in wäßrigen oder nicht-wäßrigen Suspensionen dargeboten werden, die Antioxidationsmittel, Puffer und gelöste Stoffe, die das Vakzin mit dem Blut isotonisch machen, enthalten können. Wenn gewünscht, können weiterhin Stabilisatoren, Suspendierungs- und Eindickmittel eingebracht werden.

Zur oralen Verabfolgung können die Viruspartikel mit Verdünnungsmitteln und anderen Trägern dargeboten werden.

Während die oben angegebenen, zur Verwendung vorgesehenen Verabfolgungswege insbesondere bevorzugt werden, werden damit nicht notwendigerweise die Möglichkeiten erschöpft, da möglicherweise örtliche und rektale Verabfolgungen vorgesehen werden können. Jedoch werden die Vakzine vorzugsweise parenteral und or.al verabfolgt. Das besonders bevorzugte Verabfolgungsverfahren ist parenteral.

Die vorliegende Erfindung schafft weiterhin ein Verfahren zum Schutz oder zur Behandlung einer Erkrankung bei Menschen und Tieren, wozu man eine wirksame Dosis eines Vakzins

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dem zu behandelnden Mensch oder Tier verabfolgt.

Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung sind der nachfolgenden Beschreibung der Ausführungsformen der Erfindung zu entnehmen, wobei hierdurch die Erfindung in keiner Weise eingeschränkt wird.

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Beispiel 1

Der Sendai-Virusstamm M34996 wurde, wie bei Apostolov, K. u.a. (J. Gen. Virol., 1972, 15, 227-234) beschrieben, hergestellt, außer daß nach Konzentration der Virus, der aus der Allantoinflüssigkeit von 100 Eiern gewonnen wurde, nicht eingefroren, sondern in 4 ml Veronal-gepufferter Kochsalzlösung bei einer Temperatur von 4⁰C suspendiert wurde (die Kochsalzlösung wurde dadurch hergestellt, daß man Natriumbarbiton (0,375 g), Diäthylbarbitursäure (0,575 s)» Natriumchlorid (8,5 g), Magnesiumchlorid-hexahydrat (0,17 g) und Calciumchlorid (0,03 g) in destilliertem Wasser löst und die erhaltene Lösung auf.1 1 bringt).

1 ml Virus suspension wurde mit 39 nil einer 5#igen (Gew. /Vol.) Lösung von 'Sol-U-Pro' in destilliertem Wasser (4°C) gemischt und 1 ml Proben der erhaltenen Virussuspension in Glasfläschchen gebracht. Diese Fläschchen wurden dann in eine Kammer des Gefriertrockners (Modell EF6, Edwards High Vacuum Ltd., Crawley, England) auf vorgekühlte Gefrierkammern (-40⁰G) gestellt und mit einer Geschwindigkeit von 1°C/Min. gekühlt, bis eine Temperatur von -35°G erreicht * war. Die Kammer wurde danach ausgepumpt und,sobald ein Vakuum von 0,03 bis 0,05 Torr erreicht war, wurde die Temperatur der Gefrierkammern auf -5°C erhöht und das erste Trocknen 16 Stunden durchgeführt.

Die Temperatur der Gefrierkammern wurde dann weiter auf 30⁰C

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erhöht und ein zweites" Trocknen während 6 Stunden durchgeführt, wonach die Fläschchen unter Vakuum mit Gummistopfen verschlossen wurden.

Zuletzt wurden die Fläschchen bei 10O⁰C 20 Minuten in ein Wasserbad eingetaucht, wonach die Viren hinsichtlich ihrer hämolytischen (HL), Hämagglutinierungs- (HA) und infektiösen Aktivität untersucht wurden. Eine Probe der Virussuspension, die vor der Gefriertrocknung entnommen wurde, wurde ebenso hinsichtlich dieser Aktivitäten zum Vergleich geprüft .

	Kontroll virus	Behandelter Virus
HA Titer	1024-	1024
⁺ HL Aktivität	0_r38	1,0

⁺ Die HL-Aktivität wird als optischer Dichtewert von Hämaglobin bei 415 nm ausgedrückt.

Der behandelte Virus wurde auf Ansteckbarkeit durch Einimpfen in den Allantoinraum von 10 Tage alten Kücken geprüft. Nach 5 Tagen Bebrüten bei 35°C konnte keine Spur einer Infektion festgestellt werden.

Beispiel 2

Sendai-Virus wurde hergestellt, gefriergetrocknet, erhitzt

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und geprüft, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung von SPGA (hergestellt durch Zugabe von Saccharose (94j7 g),Kaliumdihydrogenphosphat (0,7 g), Dikaliumhydrogenphosphat (1,6 g), Mononatriumglutamat (1,2 g), Rinderalbumin (12,7 g) und 1,3 ml 1#iger Phenolrotlösung zu 1 1 destilliertem Wasser, in Lösung rühren und filtrieren) anstellt einer 5#igen (Gew./Vol.) Lösung von 'SoI-U-Prο' in destilliertem Wasser.

	Kontroll virus	Behandelter Virus
HA Titer	1024	1024
HL Aktivität	0,14	■ 0,25

Die Ansteckbarkeit wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, tmtex'sucht und es wurde keine festgestellt-

Beispiel 3

Der Edfflonston-Stamm von Masernvirus wurde in Verozellen (Schichten von übertragenen Meerkatzen (green monkey)-Nierenzellen) in Gegenwart von Eagle's Medium und 2?/o (Vol./ Vol.) Kalbserum gezüchtet. Wenn die Zellen eine maximale cytopathische Wirkung-(nach 8 Tagen Bebrüten bei einer Temperatur von 37⁰C) aufwiesen, wurde das überstehende Medium abgeerntet und dann zentrifugiert (11 χ 10^G während 30

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Minuten) zur Sammlung des Virus. Der Viruskuchen wurde in 20 ml Eagle's Medium (21°C) erneut suspendiert und 4 ml dieser Suspension wurden weiterhin mit 1 ml einer 25$igen (Gew./Vol.) Lösung von ·SoI-U-Prο' in destilliertem Wasser bei einer Temperatur von 21 G gelöst.

1 ml Proben der erhaltenen Virussuspension wurden in Glasbehälter gegeben und in eine Kammer eines Gefriertrockners auf vorgekühlte Gefrierfächer (-40⁰C) gestellt und mit einer Geschwindigkeit von 1°C/min. gekühlt, bis eine Temperatur von -35°C erreicht war. Die Kammer wurde danach abgepumpt und, sobald ein Vakuum von 0,03 bis 0,05 Torr erreicht war, wurde die Temperatur der Gefrierbehälter auf -5 C erhöht und die erste Trocknung während 16 Stunden vorgenommen.

Die Temperatur der Gefrierbehälter wurde dann weiterhin auf 30⁰C erhöht und eine zweite Trocknung während 6 Stunden durchgeführt, wonach die Glasbehälter unter Vakuum mit Gummistopfen verschlossen wurden.

Die den gefriergetrockneten Virus enthaltenden Behälter wurden dann bei 100⁰C 15 Minuten in einer Sterilisiervorrichtung erhitzt, wonach der Virus auf seine hämolytische (HL), hämagglutinierende (HA) und infektiöse Wirksamkeit untersucht wurde. Eine der Virussuspension vor der Gefriertrocknung entnommene Probe wurde ebenso hinsichtlich ihrer Aktivitäten zum Vergleich untersucht.

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	Kontroll virus	Behandelter Virus
HA Titer	2	2
HL Aktivität	0,019	0,027

Die Ansteckbarkeit des Virus wurde durch Titrieren verschiedener Verdünnungen des Virus in einer Standardmenge von Verozellen in Reagenzgläsern bestimmt. Der Endpunkt war das Glas, das eine lOOpiige cytopathische Wirkung bei der höchsten Verdünnung aufwies. In diesem Falle zeigten Masernviren nach Wärmebehandlung keine Ansteckbarkeit.

Beispiel 4

Influenzavirusvakzinstamm WRL 55 (antigene Zubereitung H^N₂, mit Hämagglutinin Typ 1972) wurde in dem Allantoinsack von 10 Tage alten mit Embryonen besetzten Eiern 54 Stunden bei 35 C gezüchtet. Die abgenommenen AllantoinflüssLgkeiten wurden durch 15 Minuten Zentrifugieren bei 2000 UpM geklärt, wodurch ein 0,8 /um Millipore-Filter filtriert und dann in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, die 5$ Gew./Vol. "Sol-U-Pro" und 7,5^(Gew./Vol.) Sorbitol enthielt, verdünnt. Dieses Material wurde in 6 ml Volumen in Glasbehältern mit einem Fassungsvermögen von 24 ml in einem Kammergefriertrockner (Edwards High Vacuum, Model L 20) nach den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen gefriergetrocknet, ausge-

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nommen daß die Zeiten für die erste und zweite Trocknung 16 bzw. 32 Stunden waren. Die Stabilität des Hämagglutinins dieses gefriergetrockneten Materials wurde hinsichtlich (1) seiner Antigen- und (2) seiner Immunogenwirkung untersucht.

1. Wärmestabilität der Hämagglutinin-antigenen Wirksamkeit Fläschchen mit dem gefriergetrockneten Virus v/urden in ein kochendes Wasserbad gegeben und Proben sofort und nach 15 und 30 Minuten entnommen. Die Proben v/urden mit 6 ml destilliertem Wasser pro Fläschchen aufgefüllt und wie folgt geprüft :

Ihre Ansteckbarkeit wurde durch Impfen der Proben (0,2 Ml) in den Allantoinsack von 1C Tage alten mit Embryo besetzten Eiern gemessen. Hachdem man diese 3 Tage bei 36°C bebrütet hatte, wurden ihre Allantoinflüssigkeiten gesammelt und auf das Vorliegen von Hämagglutinin unter Verwendung von Geflügelerythrocyten untersucht. Die Ansteckbarkeit v/urde in der üblichen V/eise aus dem Anteil der in den Allantoinflüssigkeiten vorgefundenen Hämagglutininmenge bestimmt.

Der Hamagglutinationstiter des getrockneten Materials v/urde dadurch gemessen, daß man es in einer Kunststoffagglut:nationsplatte unter Verv/endung von 0,5$ Geflügelerythrocyten titriert.

Die spezifische antigene Eigenschaft des Eämagglutinins

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wurde in der V/eise bestimmt, daß man sie in einem Hämagglutinations-Hemmtest unter Verwendung von spezifischen Frettchenseren (ferret sera) untersucht. Diese Seren wurden gegen A/Engl/4-2/72 und gegen A/Hongkong/68 hergestellt. Diese Virusstämme haben beide eine H,N₂-Struktur und die Hämagglutinine sind eng verwandt, jedoch solche des 1972- bzw. 1968-Typs.

Eine Probe des nicht erhitzten Virus wurde als Kontrolle bei jedem der Versuche verwendet und die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I angegeben.

Tabelle I

Untersuchung

nicht erhitzter Virus

Virus erhitzt bei 100

15 Min. 50 Mm. Probe Probe Probe Probe ABAB

Ansteckbarkeit Titrierung
(EID,-_n/2 ml)

₅₀

₁₀

7.1

Hämagglutina-

tionstiter

(HAU/ml)

16

Antigene
Spezifität

1972

H₅N₂ H₅N₂ H₅N₂

Diese Ergebnisse zeigen, daß man durch 15 oder 30 Minuten langes Erhitzen bei 100° in dem gefriergetrockneten Zustand

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einen Verlust an Virusansteckbarkeit erreicht, daß aber der Hämagglutinationstxter und die Fähigkeit des Hämagglutinins mit spezifischen Antiseren in Hämagglutinationshemmtests zu reagieren, unbeeinträchtigt waren.

2. Wärmestabilität der Hämagglutinin-immunogenen Wirksamkeit Die Immunogenwirksamkeit des erhitzten Hämagglutinins wurde weiterhin untersucht. Ein weiterer Ansatz von WRL55~Vakzin wurde genau, wie oben beschrieben, hergestellt. 44 'Vakzinbehälter (Fläschchen) wurden in einem kochenden Wasserbad 15 Minuten erhitzt und die gleiche Anzahl von Röhrchen als unerhitzte Kontrollen gehalten. Die Proben wurden mit destilliertem Wasser (6 ml/ij'läschchen) aufgefüllt und dann auf das 200-fache durch Zentrifugieren in einem Spinco SV/ Rotor bei 26000 UpM 1 Stunde zentrifugiert. Die so erhaltenen Kuchen wurden jeder in einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (o,9 ml) suspendiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben.

	Tabelle II	Anfangs- vakzin	Konzentrier tes Vakzin
		16 16	1920 2560
Untersuchung	Erhitzung 100⁰C	₁₀6.35 <1C°
Hamagglutinations- titer (HAU/ml)	nicht erhitzt erhitzt
Titrierung der An steckbarke it (EID₅₀/2 ml)	nicht erhitzt erhitzt

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Um die immunogene Wirkung der konzentrierten Materialien zu untersuchen, wurden Proben (0,3 ml) in die Muskeln von ^LY bis 5 Wochen alten Küken (3 Küken pro Konzentrat) eingespritzt. Drei Wochen später wurden Blutproben entnommen und die Seren durch den Hamagglutxnationshemmtest unter Verwendung des homologen Virus als Antigen untersucht. Innerhalb der Versuchsfehlergrenzen konnten keine Unterschiede hinsichtlich der Immunogenwirkung der erhitzten und nicht erhitzten Virusproben festgestellt werden.

Beispiel 3

Das Verfahren der Beispiele 1 und 2 wurde mit dem infektiösen Hundehepatitisvirus untersucht. Der erhaltene nicht aktivierte Virus wurde aufgefüllt und Meerschweinchen injiziert. Nach mehreren Tagen wurde den Meerschweinchen Blut entnommen und das Serum durch Neutralisierungsuntersuchungen auf das Vorliegen von Antikörpern analysiert, wobei eine positive Analyse erhalten wurde.

-Patentansprüche-

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Claims

Patentansprüche :

1. Verfahren zur Inaktivierung eines Virus, dadurch gekennzeichnet , daß man den Virus in Gegenwart eines proteinhaltigen Stabilisators gefriertrocknet und das so erhaltene Präparat aus Virus und Stabilisator auf eine erhöhte Temperatur ausreichend lange erhitzt, um die vollständige Inaktivierung zu bewirken.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man auf eine Temperatur von 5C bis 15O°G erhitzt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet , daß man auf eine Temperatur von 90 bis 125°C 5 bis 35 Minuten erhitzt.

4-, Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man auf 100⁰G 20 Minuten erhitzt.

5· Verfahren gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stabilisator ein Proteinlysat verwendet, das sauer-abgebaute Gelatine enthält.

6. Verfahren gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, da -

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durch gekennzeichnet, daß man als Stabilisator ein Proteinlysat· verwendet, das wärme-abgebaute Gelatine enthält.

7· Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Proteinlysat in Gegenwart von Sorbitol verwendet.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4-, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zubereitung von Albumin, Zucker, Phosphat und Glutamin verwendet.

9· Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man 1 /ug bis JO mg proteinhaltigen Stabilisator pro Hämagglutinationseinheit verwendet.

10. Verfahren gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, d a durch gekenn ze ichnet, daß man einen Adenovirus verwendet.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9? dadurch gekennzeichnet, daß man einen Myxovirus verwendet.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch g e -

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kennzeichnet, daß man einen zur Hämolyse geeigneten Myxovirus verwendet.

13. Vakzin, verwendbar bei Menschen und Tieren gegen durch virulente Krankheits-bildende Viren verursachte Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß es Partikel eines geeigneten Virus enthält, die nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 inaktiviert und immunogen im Hinblick auf die gleiche Krankheit sind, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

14. Virus, sofern er nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 inaktiviert ist.

15· Inaktivierter Myxovirus mit einer im wesentlichen intakten nanogranularen Schicht.

16. Virus gemäß Anspruch 15 ₅ dadurch gekennzeichnet , daß er zur Hämolyse geeignet ist.

17. Sendai-Virus gemäß einem der Ansprüche 14 bis l6.

18. Virus gemää Anspruch 17» dadurch gekennzeichnet , daß der Stamm M34996 verwendet ist.

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NACHGEREIGHT

19. Masernvirus gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16.

20. Virus gemäß Anspruch I₉, dadurch gekennzeichnet , daß der Edmonston-Stamm Verwendung findet.

21. Influenza-Virus gemäß einem der Ansprüche 14

oder 15.

22. Virus gemäß Anspruch 21, dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t , daß der Stamm WRL55 in einer antigenen Zubereitung von H₃N₃ mit Hämagglutinin des 1972-Ty_PS verwendet wird.

23. Infektiöser Hundeheptatitisvirus gemäß Anspruch 14.

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