CN112480221A - 产气荚膜梭菌毒素抗原浓缩工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及疫苗生产技术领域，具体涉及一种产气荚膜梭菌毒素抗原浓缩工艺，包括如下步骤：将产气荚膜梭菌培养获得的上清液使用超滤系统进行浓缩，浓缩时进口压力0.1～0.15MPa、回流压力0～0.05MPa，浓缩倍数分别为5～10倍。值得注意的是，浓缩前，需先测定产气荚膜梭菌培养的毒素的含量，当毒素的含量≥400MLD/ml时，方可进行浓缩。本发明通过对产气荚膜梭菌毒素抗原的浓缩处理，使得所得的抗原可以达到疫苗生产的需要，同时可以降低疫苗的免疫剂量，便于临床应用，并减少注射母猪的应激反应。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗生产技术领域，具体涉及一种产气荚膜梭菌毒素抗原浓缩工艺。
背景技术
为达到配苗要求，C型产气荚膜梭菌毒素抗原需达到3400MLD/ml，因此需进行浓缩处理。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产气荚膜梭菌毒素抗原浓缩工艺。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
产气荚膜梭菌毒素抗原浓缩工艺，包括如下步骤：
将产气荚膜梭菌培养获得的上清液使用超滤系统进行浓缩，浓缩时进口压力0.1～0.15MPa、回流压力0～0.05MPa，浓缩倍数分别为5～10倍。
值得注意的是，浓缩前，需先测定产气荚膜梭菌培养的毒素的含量，当毒素的含量≥400MLD/ml时，方可进行浓缩。
进一步地，在保证配苗要求的前提下，可适当降低毒素的浓缩倍数，提高浓缩回收率，浓缩倍数优选为5倍。
本发明具有以下有益效果：通过对产气荚膜梭菌毒素抗原的浓缩处理，使得所得的抗原可以达到疫苗生产的需要，同时可以降低疫苗的免疫剂量，便于临床应用，并减少注射母猪的应激反应。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
试验例
1材料
1.1菌种C型产气荚膜梭菌C59-2 F10代基础种子，由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定、保管和供应。
1.2主要培养基及原材料 大豆蛋白胨购自北京双旋微生物培养基制品厂，货号02-19；水解酪蛋白购自sigma，货号N4517-1KG；酵母浸膏购自北京双旋微生物培养基制品厂，货号02-22；葡萄糖购自国药集团化学试剂有限公司，货号10010518；氨水购自武汉市洪山中南化工试剂有限公司，货号2672。
梭菌液体培养基准确称取大豆蛋白胨15g、水解酪蛋白15g、酵母浸膏5g、葡萄糖5g，溶于950ml纯化水，用2mol/LNaOH调pH值至8.0～8.5，加纯化水定容至1000ml，116℃高压灭菌30分钟，冷却后备用。
1.3试验动物16～20g昆明小鼠，购自武汉生物制品研究所。
2方法
2.1菌液的培养
按“产气荚膜梭菌培养工艺的研究”最优生产工艺进行100L细菌发酵罐菌液的培养，共培养4次。具体的：
产气荚膜梭菌C59-2在35～37℃培养条件，1％～5％接种，培养过程中根据培养菌液pH值的变化，补加氨水，使培养液的pH值维持在7.0～7.4，培养6～10小时收获。
2.2毒素含量的测定菌液培养完成后，取样，离心取上清，测定毒素的含量(MLD/ml)。
2.3毒素浓缩试验当毒素的含量≥400MLD/ml时，方可进行浓缩。为了计算毒素浓缩的回收率，在浓缩前未进行灭活和脱毒处理。培养菌液经管式离心机离心，收集上清液，用于浓缩试验。
2.3.1 10L毒素液的浓缩试验将第1次培养获得的上清液分为4份，每份10L，使用超滤系统进行浓缩，浓缩时进口压力0.1～0.15MPa、回流压力0～0.05MPa，使4份毒素液的浓缩倍数分别为5倍、8倍、10倍、15倍。测定不同浓缩倍数的毒素液含量，并计算浓缩回收率。
2.3.2 10L毒素液浓缩重复性试验将第1次培养获得的上清液分为3份，每份10L，分别进行3次浓缩试验。浓缩倍数5～10倍，浓缩时进口压力0.1～0.15MPa、回流压力0～0.05MPa，根据浓缩前后体积、浓缩前后毒素含量，测定浓缩回收率。
2.3.3 70L毒素液浓缩重复性试验第2～4次培养获得的毒素上清，体积均约70L，进行浓缩试验，浓缩倍数5～10倍，浓缩时进口压力0.1～0.15MPa、回流压力0～0.05MPa，根据浓缩前后体积、浓缩前后毒素含量，测定浓缩回收率。
3结果
3.1毒素含量的测定结果用100L发酵罐培养产气荚膜梭菌C59-2，4次培养的毒素含量分别为800MLD/ml、1000MLD/ml、1250MLD/ml、800MLD/ml(表1)。
表1 C型产气荚膜梭菌毒素含量的测定结果
| 上罐次数 | 毒素含量(MLD/ml) |
| 1 | 800 |
| 2 | 1000 |
| 3 | 1250 |
| 4 | 800 |
3.2 10L毒素液的浓缩试验结果浓缩前产气荚膜毒素含量为800MLD/ml，通过超滤浓缩5倍、8倍、10倍和15倍后，其毒素含量分别为3600MLD/ml、5600MLD/ml、6800MLD/ml、8400MLD/ml，均达到了配苗要求(毒素含量应≥3400MLD/ml)，回收率依次92％、87.5％、85％、70.5％，结果见表2。结果表明，随着浓缩倍数的增加，毒素回收率有所下降，因此，在保证配苗要求的前提下，可适当降低毒素的浓缩倍数，提高浓缩回收率。
表2 C型产气荚膜梭菌毒素浓缩效果
| 浓缩后体积(L) | 浓缩倍数 | 毒素含量(MLD/ml) | 回收率(％) |
| 10 | 浓缩前 | 800 | / |
| 2 | 5倍浓缩 | 3600 | 92 |
| 1.25 | 8倍浓缩 | 5600 | 87.5 |
| 1 | 10倍浓缩 | 6800 | 85 |
| 0.67 | 15倍浓缩 | 8400 | 70.5 |
3.3 10L毒素液浓缩重复性试验结果浓缩前毒素含量为800MLD/ml，将该毒素进行了3次浓缩性试验，结果表明，浓缩后回收率均在85％以上(表3)。
表3 10L毒素液浓缩重复性试验结果
3.4 70L毒素液浓缩重复性试验结果3批70L毒素液经浓缩后，毒素含量分别为5400MLD/ml、5800MLD/ml、4600MLD/ml，回收率分别为89.2％、91.5％、87.1％，结果见表4。
表4 70L毒素液浓缩重复性试验结果
4结论本试验例用超滤浓缩对毒素进行了浓缩工艺的研究。结果表明，毒素浓缩5～10倍后，其回收率均不低于85％。随着浓缩倍数的增加，毒素回收率有所下降，因此，在保证配苗要求的前提下，可适当降低毒素的浓缩倍数，提高浓缩回收率。试验确定灭活毒素的浓缩倍数为5～10倍，毒素抗原的浓缩回收率按85％计算。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
Claims (3)
1.产气荚膜梭菌毒素抗原浓缩工艺，其特征在于：包括如下步骤：
将产气荚膜梭菌培养获得的上清液使用超滤系统进行浓缩，浓缩时进口压力0.1～0.15MPa、回流压力0～0.05MPa，浓缩倍数分别为5～10倍。
2.如权利要求1所述的产气荚膜梭菌毒素抗原浓缩工艺，其特征在于：浓缩前，需先测定产气荚膜梭菌培养的毒素的含量，当毒素的含量≥400MLD/ml时，方可进行浓缩。
3.如权利要求1所述的产气荚膜梭菌毒素抗原浓缩工艺，其特征在于：浓缩倍数为5倍。
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|---|---|
| CN (1) | CN112480221A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102266554A (zh) * | 2011-07-19 | 2011-12-07 | 哈药集团生物疫苗有限公司 | 禽流感灭活疫苗的制备方法及其产品 |
| CN103694344A (zh) * | 2013-12-13 | 2014-04-02 | 天津工业大学 | 一种聚合血红蛋白的超滤方法 |
| WO2017095062A1 (en) * | 2015-11-30 | 2017-06-08 | Daewoong Co., Ltd. | Method for producing botulinum toxin |
| CN109954135A (zh) * | 2017-12-25 | 2019-07-02 | 金宇保灵生物药品有限公司 | 牛a型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗及其制备方法 |
| CN111018968A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-04-17 | 兴盟生物医药(苏州)有限公司 | 一种通过超滤浓缩制备高浓度抗体制剂的方法 |
| CN114181925A (zh) * | 2020-09-14 | 2022-03-15 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种重组蛋白酶k工业化纯化及冻干方法 |
-
2020
- 2020-12-02 CN CN202011386359.9A patent/CN112480221A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102266554A (zh) * | 2011-07-19 | 2011-12-07 | 哈药集团生物疫苗有限公司 | 禽流感灭活疫苗的制备方法及其产品 |
| CN103694344A (zh) * | 2013-12-13 | 2014-04-02 | 天津工业大学 | 一种聚合血红蛋白的超滤方法 |
| WO2017095062A1 (en) * | 2015-11-30 | 2017-06-08 | Daewoong Co., Ltd. | Method for producing botulinum toxin |
| CN109954135A (zh) * | 2017-12-25 | 2019-07-02 | 金宇保灵生物药品有限公司 | 牛a型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗及其制备方法 |
| CN111018968A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-04-17 | 兴盟生物医药(苏州)有限公司 | 一种通过超滤浓缩制备高浓度抗体制剂的方法 |
| CN114181925A (zh) * | 2020-09-14 | 2022-03-15 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种重组蛋白酶k工业化纯化及冻干方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| ODENDAAL MW.: "Purification of the alpha toxin of Clostridium perfringens type A by ultrafiltration and gel chromatography", 《ONDERSTEPOORT J VET RES》 * |
| 刘增禄: "A、C、D型牛产气荚膜梭菌三价类毒素疫苗的初步研制及免疫效果评价", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士）农业科技辑》 * |
| 刘泽文: "仔猪大肠埃希氏菌、C型产气荚膜梭菌的灭活及脱毒方法研究", 《安徽农业科学》 * |
| 刘长辉: "不同浓缩处理方法制备鸡传染性支气管炎血凝抗原的效果比较", 《中国兽医杂志》 * |
| 李黎: "猪繁殖与呼吸综合征活疫苗病毒纯化应用技术研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士）农业科技辑》 * |
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