CN109954135A - 牛a型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A灭活类毒素疫苗及其制备方法。本发明使用产毒水平较高、免疫原性良好、培养特性稳定的牛源A型产气荚膜梭菌菌株制备牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗。通过优化培养基配方及培养条件，提高了培养稳定性和基础抗原效价，获得了高MLD水平的α毒素液；通过安全、便捷、高效的α毒素浓缩方式，提升了α毒素回收率，降低了培养成本；使用高含量类毒素抗原制苗而得到一种安全性好、高效力、低免疫剂量的牛A型产气荚膜梭菌类毒素疫苗。

Description

牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域中的疫苗及其制备方法，特别是涉及一种牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗及其制备方法。

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，又称魏氏梭菌，存在于很多健康动物的肠道中，当饲养和环境条件改变时，可引起畜禽的产气荚膜梭菌病，一旦发病，会导致畜禽迅速死亡，病程极短，往往在未得到有效治疗前便死亡。自产气荚膜梭菌在我国发现以来，在全国各个地区的畜禽中出现了一种病程短、发病急、死亡快、死亡率高的疾病(产气荚膜梭菌病)，并且有时候该病的症状不明显，往往在发病治疗之前，畜禽便开始死亡，给我国的畜牧养殖业造成了不可估量的经济损失。

今年以来，对数百份来自规模化奶牛场的猝死牛病料病原分离鉴定，发现95％以上的猝死动物死于A型产气荚膜梭菌。A型产气荚膜梭菌可致人类食源性感染，目前对人类和畜牧业造成的巨大损失是不言而喻的。针对该病的特点，国内外相关部门已给予了足够重视，针对该病已研发出疫苗预防其爆发。A型产气荚膜梭菌分泌的α毒素最多，根据测序结果得知，α毒素是由398个氨基酸组成的单链多肽，其中28个氨基酸为信号肽，其余370个氨基酸为成熟肽，分子量约为43KDa。

目前，国内外关于A型产气荚膜梭菌病的研究大多集中于该病的诊断，但由于各种条件和因素的制约，对该病的诊断和控制并没有达到理想的效果。针对该病的预防，注射疫苗是主要手段，集中于菌体疫苗、类毒素疫苗、α毒素亚单位疫苗，但是可供市场使用的少量疫苗仍停留在菌体疫苗的水平上，因菌体疫苗存在安全性风险及注射剂量大的缺陷，且目前疫苗的数量及免疫效果远不能满足市场需求，因此亟需开发一种安全性好、高效力、低免疫剂量的纯类毒素疫苗来防控畜禽猝死症。

基于牛A型产气荚膜梭菌病发病急、死亡率高、发病后用药治疗效果不明显，因此为了有效预防和控制牛A型产气荚膜梭菌病的发生，研制高效、安全的类毒素灭活疫苗并采取有效措施评价其效力刻不容缓。

发明内容

本发明一个目的是提供一种安全性好、高效力、低免疫剂量的牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗。

本发明所提供的牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗，是以免疫原性良好的牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A菌株作为制苗用菌种，用专用培养基在适宜条件下培养，获得α毒素含量高的A型产气荚膜梭菌培养菌液，菌液经灭活后离心、过滤除菌体，使用膜孔径3-5KD的中空纤维柱浓缩α毒素，制苗，得到牛 A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A灭活类毒素疫苗。

所述免疫原性良好的牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A菌株包括CNM0702株、CNM0708株、CNM0715株、CNM0730株和CNM0732株，其分离于内蒙古呼和浩特土左旗牛场，具有α毒素致死性。这些菌株属于本发明内容。

其中：牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A CNM0708菌株已于2017年11月14日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14880。保藏编号为 CGMCC No.14880的菌株牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A CNM0708属于本发明内容。

所述专用培养基配方为：

将上述成分用水溶解后，调pH值至8.0-8.5，灭菌，使用时加入培养基体积0.5-1％的葡萄糖。

该专用培养基也属于本发明。

所述适宜培养条件为：菌种含量1-2％，36-37℃静置培养5-7小时。

针对A型产气荚膜梭菌培养菌液所述灭活的方法为：使用0.4％-0.8％(V/V)甲醛溶液灭活，37℃灭活2-3天，每日振摇2-3次。

灭活的A型产气荚膜梭菌培养菌液进行离心、过滤除菌体的方法为：先4℃、 6000-8000rpm离心20-30min(优选4℃、8000rpm离心30min)，再使用0.45μm级过滤器对离心上清液进行过滤除去菌体，留滤过液。

用膜孔径3-5KD的中空纤维柱膜浓缩α毒素，可将α毒素浓缩10-20倍。以浓缩 10倍为例，浓缩方法为：使用0.5mol/L氢氧化钠溶液预处理中空纤维2-4小时，连接管路，浓缩过程中进液泵压力及出液压力不得超过0.1KMa，将20000mL含α毒素的滤过液原液浓缩至1000mL时，用pH 7.6-7.8的PBS液进行洗滤，洗滤后总体积达 2000mL时停止，即完成α毒素的10倍浓缩。

用浓缩的牛A型产气荚膜梭菌α毒素可配制氢氧化铝胶苗，配制方法为：制备胶水(胶水是指氢氧化铝胶生理盐水溶液，配方为铝胶：生理盐水体积比为5：1)，高压灭菌后，将α毒素与胶水按体积比4：1-5：1混合，充分摇匀后，无菌分装。

该氢氧化铝胶苗也属于本发明。

本发明的另一目的是提供一种制备上述牛A型产气荚膜梭菌Clostridiumperfringens type A灭活类毒素疫苗的方法。

本发明所提供的制备上述牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗的方法，可包括以下步骤：

制备牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A灭活类毒素疫苗的方法，包括以下步骤：

1)菌液制备：用权利要求7所述牛A型产气荚膜梭菌菌株CNM0708为菌种，按 1-2％(体积比)加入到权利要求8所述专用培养基中，36-37℃下静置培养5-7小时，得到α毒素含量高的A型产气荚膜梭菌培养菌液；

2)菌液灭活：向A型产气荚膜梭菌培养菌液中加入其体积比0.3-0.5％的甲醛溶液，37℃保持2-3天，期间每日搅拌2-3次；

3)除菌体：先在4℃、6000-8000rpm下对灭活的菌液离心20-30min，再使用0.45μm级过滤器对离心上清液过滤去除菌体，留滤过液；

4)浓缩α毒素：使用孔径3-5KD的中空纤维柱将步骤3)除菌体后溶液中的α类毒素浓缩10-20倍；

5)制苗：用浓缩的α类毒素配制氢氧化铝胶苗的方法为：将氢氧化铝胶和生理盐水按体积比5：1制备胶水，高压灭菌后，将浓缩的α类毒素与胶水按体积比4:1-5:1 (优选5：1)混合、摇匀，得到氢氧化铝胶苗；

6)将氢氧化铝胶苗无菌分装，得到牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringenstype A灭活类毒素疫苗。

本发明提供了一种使用产毒水平较高、免疫原性良好、培养特性稳定的牛源A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A菌株CNM0708 CGMCC No.14880制备牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗的方法。通过优化培养基配方及培养条件，提高了培养稳定性和基础抗原效价，获得了高MLD水平的α毒素液；摸索出适宜的灭活、离心及过滤除菌参数，以及一种更安全、便捷、高效的α毒素浓缩方式，即选用膜孔径为3-5KD的中空纤维柱，提升了α毒素回收率，降低了培养成本，获得了较传统硫酸铵浓缩方式更安全(无任何副反应)、低损失率的浓缩抗原；使用高含量类毒素抗原制苗，通过提高配苗用α毒素剂量至适宜水平，获得了一种安全性好、高效力、低免疫剂量的牛A型产气荚膜梭菌类毒素疫苗。将该苗试用于三个不同的种牛、奶牛场，免疫1000多头牛，一免后即可使不同品种牛均产生高效价中和抗体，免疫牛只中和抗体效价水平可达50，且未发生一例有注射反应牛只(均无不良免疫反应)，为我国近年因牛A型产气荚膜梭菌引起的猝死症起到很好的防控效果，大大降低了产后奶牛因季节转换、饲养管理条件改变所致的猝死率，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗的制备方法流程图

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗的制备方法流程图如图1所示，是以免疫原性良好的牛A型产气荚膜梭菌菌株作为制苗用菌种，用专用培养基在适宜条件下培养，获得α毒素含量高的A型产气荚膜梭菌培养菌液，菌液经灭活后离心、过滤除菌，使用膜孔径3-5KD的中空纤维柱浓缩α毒素，制苗，得到牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗。以下以具体实施例说明其关键步骤：

实施例一、牛A型产气菌荚膜梭菌分离、鉴定、菌株筛选

分离病料、筛选产α毒素水平较高、免疫原性良好的牛A型产气荚膜梭菌菌株作为疫苗用菌株，具体方法如下：

1、牛A型产气菌荚膜梭菌分离、鉴定及产α毒素水平检测

针对内蒙古呼和浩特土左旗牛场的猝死后围产期及产后奶牛，采集出血症状明显肠段、肝脏、肾脏等部位病料，分别无菌接种于10％绵羊脱纤血平板进行病料分离，血平板置37℃温箱培养18-24小时；每个平板挑选独立、双溶血环明显、直径大小不同的3-5个菌落继续接种于新鲜的10％绵羊脱纤血平板，进行第二代纯化，37℃温箱培养18-24小时，每个血平板同样选独立、双溶血环明显、直径大小不同的各3-5个菌落接种厌气肝汤进行增菌培养，37℃温箱培养18-24小时将每支纯化菌株培养物离心(4℃、8000rpm离心30min)、离心上清液过滤(用孔径为0.45μm的滤膜)去除菌体，取滤过液(含α毒素)分别进行小白鼠α毒素对比试验(试验方法为：稀释由菌液培养物离心、过滤获得的α毒素液至不同滴度，采用小白鼠尾静脉注射，测定不同滴度的α毒素液对小白鼠的最小致死剂量)。

依据上述对各病料获得的滤过液中α毒素的测定结果，筛选出对应的具有α毒素致死性的菌株，将其中分离于小肠部病料菌株CNM0702株、CNM0708株、CNM0715株及肝脏病料菌株CNM0730株、CNM0732株作为备选菌株，经鉴定(鉴定方法包括：毒素致死性试验、溶血特性、生化试验、血清中和试验法、PCR型特异性鉴定)确定这 5株菌为牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A。

2、菌株免疫原性评价

将备选牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A菌株(CNM0702 株、CNM0708株、CNM0715株、CNM0730株、CNM0732株)繁殖菌种(繁殖方法为：菌种含量2-4％，37℃静置培养12-14小时)、培养菌液(培养方法及培养条件为：菌种含量1-2％，37℃静置培养5-7小时)，使用0.4％-0.8％(V/V)甲醛溶液灭活， 37℃灭活2-3天，每日振摇2-3次，4℃、8000rpm离心30min(6000-8000rpm离心 20-30min均可)，使用0.45μm级过滤器对灭活的A型产气荚膜梭菌进行过滤除菌，获得各菌株对应的A型产气荚膜梭菌α毒素；分别配制氢氧化铝胶苗(配制方法为：制备胶水溶液——胶水是指氢氧化铝胶生理盐水溶液，配方为铝胶：生理盐水体积比为5：1，高压灭菌后，将各α毒素与胶水按体积比5：1混合，充分摇匀至无可见性铝胶颗粒，无菌分装，得到各菌株对应的胶苗。)。将五组胶苗分别接种1.5-2.0kg 大耳白兔5组(每组免疫8只，其中4只用于血清中和试验用，即只用于采血监测抗体，另4只用于攻击毒素，观察攻毒保护结果，1mL/只)，进行免疫后中和效价及攻毒保护试验评价，于免疫后21天采血，进行中和试验及攻毒试验，实验结果如表1 所示，结果5组兔中和效价均≥1，选取2只空白兔作为对照，结果：攻毒对照成立，免疫组攻毒保护率CNM0702株、CNM0708株、CNM0715株、CNM0730株、CNM0732株胶苗分别为75％、100％、100％、75％、100％，均符合疫苗用菌种要求。

表1不同菌株免疫原性对比试验结果(中和效价及攻毒保护数据)

通过稳定性试验同样接种、培养条件，培养3-5代，各菌株毒素水平无下降趋势，表明这些牛A型产气荚膜梭菌菌株CNM0702株、CNM0708株、CNM0715株、CNM0730 株、CNM0732株均可作为本发明疫苗用菌株。实施例以其中CNM0708株的数据作为说明，该菌株命名为牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A CNM0708，已于2017年11月14日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14880。

实施例二、优化牛A型产气菌荚膜梭菌的培养基

本实施例优化牛A型产气菌荚膜梭菌Clostridium perfringens type A的培养过程中的培养基配方，以获得产α毒素水平较高的菌液。

用于培养产气荚膜梭菌的传统培养基是厌气肉肝汤和肉肝胃酶(膜)消化汤，该培养基培养厌氧菌效果好，毒力强，但在实际生产中存在以下问题:成分复杂，难以标准化，其主要成分牛肉等受动物品种、年龄、新鲜程度影响大，造成培养基批次间质量不稳定；制作繁琐，牛肉预处理、煮沸及滤过、胃酶(膜)的活力及消化程度判断，均需要较高的经验值(摘自：中国兽药杂志，2012，47(9):34-37/朱良全等，A型产气荚膜梭菌合成培养基使用参数及培养毒素浓缩工艺研究)。

针对上述缺点，已有文献报导产气菌荚膜梭菌培养基配方(摘自：中国兽药杂志，1994年(第28卷)第1期，蒋玉文等，羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)肠毒血症灭活疫苗复合培养基的研究)，其培养基配方如下：

本发明实验中依据以上配方，将上述成分用蒸馏水溶解后,用2mol Na0H调pH值至8.0-8.5后，分装，116℃蒸汽灭菌40分钟,使用时按培养基总量加入2％营养液(为维生素、微量元素、葡萄糖的混合无菌滤液)，将该培养基配方编号为配方一。本发明实验中使用的各组分均为商购，蛋白胨来自北京奥博星生物技术有限责任公司，酵母浸出粉来自OXOID，粗糊精来自山东聊城，活性炭来自天津市科盟化工工贸有限公司。

使用培养基配方一对牛A型产气荚膜梭菌分离菌株CNM0708及A型参考菌株CVCC37进行培养试验(培养方法及培养条件为：菌种含量1-2％，37℃静置培养5-7 小时)得到培养菌液，用小鼠测定α毒素最小致死量检测培养菌液中的α毒素含量。测定方法为：将菌液4℃、8000rpm离心30min、过滤(用孔径为0.45μm的滤膜)，取离心上清毒素液稀释至不同滴度，采用小白鼠尾静脉注射，测定对小白鼠的最小致死剂量。检测结果显示培养菌液的α毒素含量最高分别达20MLD/mL(CNM0708株)、 100MLD/mL(CVCC37株)。

在配方一的基础上，优化培养基配方，获得配方二及配方三：

配方二：

将上述成分用蒸馏水、纯化水或注射用水溶解后，用2mol Na0H调pH值至8.0-8.5，分装，116℃蒸汽灭菌40分钟，使用时加入培养基体积0.5-1％的葡萄糖。

葡萄糖也属于本发明优化培养基的一部分。因其受高温灭菌时间的影响较大，因此，一般会在小量程容器中配制、高压灭菌，灭菌时间、温度均略低些，使用时另添加。如于大瓶溶液中统一配制、高压灭菌，同时兼顾多组分的灭菌效果及使用效果不好操作。

配方三：

在配方二的基础上，添加3-5％的肝粉或肝块。肝粉或肝块取自健康屠宰牛肝脏，去被膜。本实验所用肝粉或肝块取自内蒙古呼和浩特周边牛场健康屠宰牛。

用配方二及配方三培养(培养方法及培养条件为：菌种含量1-2％，36-37℃静置培养5-7小时，控制参数与配方一的参数一致)牛A型产气荚膜梭菌CNM0708，结果配方二的培养菌液中α毒素含量最高可达40MLD/mL，配方三的培养菌液中α毒素含量最高可达80MLD/mL，α毒素含量较配方一明显提升，是配方一的4倍。

对配方一、配方二、配方三进行A型参考菌株CVCC37增菌(增菌方法为：菌种含量1-2％，37℃静置培养5-7小时)及毒素提升试验(毒素提升试验包括：毒素收获时间优化试验、毒素保存条件优化试验，各3批)，培养5-7小时后收获菌液，使用10％绵羊脱纤血琼脂固体平板(用外购营养琼脂粉制备营养琼脂液，高压灭菌后，待温度冷却至40-50℃，加入10％脱纤绵羊血制得平板)进行菌数(CFU)测定，使用16-20g昆明系小白鼠测定α毒素含量(MLD)。

对比试验结果如表2所示，通过试验数据得出，各种培养基用于参考菌株CVCC37增菌效果无明显差别，但产α毒素水平存在较大差异，优化后的培养基配方，使得培养菌液中α毒素含量明显提升，且稳定性良好，其中优化后的配方二每毫升α毒素含量提升1.5-2倍，优化后的配方三每毫升α毒素含量提升2.5-3倍。对牛A型产气荚膜梭菌CNM0708增菌实验结论与参考菌相同。

表2三种配方培养基增菌及α毒素含量对比试验结果

另外，对比专利文献CN104623651 B“一种家兔魏氏梭菌病的A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的制备方法”中提及的培养基配方(配方四)：

每1000mL去离子水中含：

使用该配方四培养(培养条件和参数与使用配方一相同)A型产气荚膜梭菌CNM0708株和CVCC37株，结果培养CVCC37株的α毒素含量仅达100MLD/mL，培养牛 A型产气荚膜梭菌CNM0708的α毒素含量仅达20MLD/mL。

基于上述试验结果，本发明优化的配方二和配方三能作为培养本发明疫苗用菌株牛A型产气荚膜梭菌的专用培养基配方。对一直以来制备A型产气荚膜梭菌疫苗及参考株CVCC37基础菌液毒素效价不超过100MLD/mL的状况，实现了技术上的突破，为制备高效价类毒素疫苗奠定了坚实的基础，特别是配方三，其对参考株CVCC37基础菌液毒素效价高达250MLD/mL，显示了超乎想象的效果。

实施例三、牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A菌液灭活

1、菌液灭活

A型产气荚膜梭菌培养菌液灭活的方法为：0.4％-0.8％(V/V)甲醛溶液灭活， 37℃灭活2-3天，每日振摇2-3次。

2、无菌、脱毒检验

无菌检验方法：参照《中华人民共和国兽用生物制品规程二OOO版》操作。

脱毒检验方法：用体重16-20g小白鼠4只，其中2只每只腹腔注射脱毒后的菌液0.4mL,观察3-5日，另2只尾静脉注射经离心、过滤后灭活毒素液0.4mL/只，观察24小时，应全部健活。

该菌液的灭活和脱毒检验适用于实施例一所选择的所有牛A型产气荚膜梭菌株在实施例二配方二或配方三培养基上培养得到的菌液，结果均合格。

实施例四、离心、过滤除菌

对灭活的A型产气荚膜梭菌培养菌液进行离心，离心条件为：4℃、6000-8000rpm离心20-30min，取离心上清液；然后使用0.45μm级过滤器对灭活的A型产气荚膜梭菌进行过滤去除菌体，留滤过液。

该离心、过滤除菌操作对实施例三所指的全部灭活的A型产气荚膜梭菌培养菌液都适用，结果均合格。

实施例五、浓缩α毒素

本实施例通过筛选中空纤维柱，提高α毒素回收率，制备高效价抗原。在牛A型产气荚膜梭菌疫苗的使用过程中，为提高免疫效力，降低免疫剂量，尤其是降低围产期奶牛及敏感性较高牛种的免疫应激反应，毒素抗原浓缩成为一条必然路径，寻求一种回收率高、免疫副反应小的浓缩方式是制苗的关键举措。“牛产气荚膜梭菌病灭活疫苗及其制备工艺(专利公开号：CN1269243A)”中采用硫酸铵盐析法浓缩抗原，该方法存在开放性操作，硫酸铵除菌条件受限，及疫苗注射安全性缺陷，致规模化推广存在一定问题。曾有过使用中空纤维浓缩的研究(摘自：中国兽药杂志，2012， 47(9):34-37/朱良全等，A型产气荚膜梭菌合成培养基使用参数及培养毒素浓缩工艺研究)，但是存在浓缩回收率偏低(仅达40-75％)的现象。为降低毒素损失率，提高回收率，需要筛选中空纤维柱规格、优化浓缩工艺，获得回收率达90％以上的中空纤维柱膜最适孔径，从而有效提升抗原效价。

通过对α毒素浓缩可能用到的三种规格(10KD、8KD、3-5KD)的中空纤维柱膜孔径进行试验，并在浓缩过程中对中空纤维柱浓缩前处理、浓缩中控制、洗滤等环节优化操作，使用孔径3-5KD的中空纤维柱浓缩α毒素10-20倍。

以下以浓缩10倍为例说明对A型产气荚膜梭菌培养菌液中α毒素的浓缩方法：使用0.5mol/L氢氧化钠溶液预处理中空纤维柱2-4小时，连接浓缩设备(GE公司中空纤维柱)的管路，浓缩过程中进液泵压力及出液压力不得超过0.1KMa，将20000mL α毒素原液(原液可为经过实施例三灭活或实施例四离心、过滤除菌后得到的滤过液) 浓缩至1000mL时，用pH7.6-7.8的PBS液进行洗滤，洗滤后总体积达2000mL时停止，即完成α毒素的10倍浓缩。

对上述浓缩过程中所使用的中空纤维柱的膜孔径进行筛选试验，结果如表3所示，显示使用3-5KD的中空纤维柱浓缩α毒素回收率可高达90-95％，高于现有文献报导中75％的回收率，大大提高了抗原效价，节约了培养成本。

通过对α毒素浓缩可能用到的三种规格(10KD、8KD、3-5KD)的中空纤维柱膜孔径进行试验，并在浓缩过程中对中空纤维柱浓缩前处理、浓缩中控制、洗滤等环节优化操作，确定使用孔径3-5KD的中空纤维柱浓缩α毒素10-20倍。基于上述试验结果，本发明浓缩过程选择膜孔径3-5KD的中空纤维柱用于浓缩α毒素。

表3中空纤维柱膜孔径筛选试验结果

实施例六、制备疫苗

用膜孔径3-5KD的中空纤维柱浓缩的牛A型产气荚膜梭菌α类毒素配制氢氧化铝胶苗，方法为：

制备胶水(胶水是指氢氧化铝胶生理盐水溶液，配方为铝胶：生理盐水体积比为5：1)，高压灭菌后，将α类毒素与胶水按体积比4：1-5：1(优选5：1)混合，充分摇匀至无可见胶颗料为止，无菌分装，得到牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素氢氧化铝胶苗。

作为对照，同时配制硫酸铵盐析浓缩苗。硫酸铵盐析浓缩方法为：于20000mL未浓缩的牛A型产气荚膜梭菌α毒素中，添加12000g的灭菌硫酸铵，充分搅拌，静置2 小时后，捞出干物质，用0.85％生理盐水回溶至2000mL，即得10倍浓缩液。硫酸铵盐析浓缩苗疫苗配制方法为：将2000mL硫酸铵盐析浓缩牛A型产气荚膜梭菌α类毒素与400mL灭菌氢氧化铝胶充分混合，振摇至无可见胶颗料为止，无菌分装，得到牛 A型产气荚膜梭菌灭活类毒素硫酸铵盐析浓缩苗。

效检兔免疫1mL/只,效检牛免疫2mL/头，对两种浓缩方式制得的疫苗进行免疫效果、安全性对比试验。

免疫效果对比试验结果如表4所示，试验数据显示，中空纤维柱浓缩苗抗体中和效价明显高于硫酸铵盐析浓缩苗。

表4中空纤维柱浓缩苗与硫酸铵浓缩苗免疫效果对比试验结果

安全性对比试验结果如表5所示，试验数据显示，接种后的注射部位中空纤维柱浓缩苗吸收良好，对组织无任何损伤，硫酸铵盐析浓缩苗对注射部位组织有轻微影响，安全性略低。

表5中空纤维柱浓缩苗与硫酸铵浓缩苗安全性对比试验结果

最小免疫剂量试验结果如表6所示，试验数据显示，中空纤维柱浓缩苗最小免疫剂量为2mL。

表6中空纤维柱浓缩苗于6月龄黄牛最小免疫剂量试验结果

免疫持续期试验结果如表7所示，试验数据显示，免疫持续期试验监测中和抗体效价仅达4个月。一免后60天内抗体效价较高，90天和120天中和效价有所下降，但能够满足免疫保护中和抗体水平要求。

表7中空纤维膜浓缩苗于6月龄黄牛免疫持续期试验结果

以上实施例一至实施例六分步探讨了制备牛A型产气荚膜梭菌Clostridiumperfringens type A灭活类毒素疫苗的全流程。依此，以下实施例七以使用牛A型产气荚膜梭菌菌株CNM0708、配方三培养基为例说明牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗的制备过程。实施例七仅为完整描述本发明做出示例，不对实施例一至实施例六及其组合的内容做出限制，依据实施例一至实施例六及其组合的内容借鉴实施例七的描述所做出的实施方案或常规改变均属于本发明公开范围。

实施例七、制备牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A灭活类毒素疫苗

制备牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗的方法，包括以下步骤：

1)培养牛A型产气荚膜梭菌菌株CNM0708 CGMCC No.14880：用专用培养基对牛 A型产气荚膜梭菌菌株CNM0708 CGMCC No.14880在36-37℃下静置培养5-7小时，得到α毒素含量高的A型产气荚膜梭菌培养菌液；

所述专用培养基使用配方三，其中各成分及其在水溶液中的含量为：

将上述成分用水溶解后，调pH值至8.0-8.5，灭菌，使用时加入培养基体积0.5-1％的葡萄糖；

2)菌液灭活：灭活A型产气荚膜梭菌培养菌液，灭活的方法为：使用0.3-0.5 ％甲醛溶液，37℃灭活2-3天，期间每日搅拌2-3次；

3)离心、过滤除菌：先对灭活的A型产气荚膜梭菌培养菌液进行离心，离心条件为：4℃、6000-8000rpm离心20-30min，再对离心上清液使用0.45μm级过滤器对灭活的A型产气荚膜梭菌进行过滤除去菌体，留滤过液；

4)浓缩α毒素：使用孔径3-5KD的中空纤维柱浓缩滤过液中α类毒素10倍，浓缩方法为：使用0.5mol/L氢氧化钠溶液预处理中空纤维2-4小时，连接管路，浓缩过程中进液泵压力及出液压力不得超过0.1KMa，将20000mL含α毒素的滤过液(原液) 浓缩至1000mL时，用pH7.6-7.8的PBS液进行洗滤，洗滤后总体积达2000mL时停止，即完成α类毒素的10倍浓缩；如浓缩20倍，则将20000mLα毒素原液浓缩至500mL 时洗滤，洗滤后总体积达1000mL时停止，即完成α类毒素的20倍浓缩。

5)制苗：用浓缩的牛A型产气荚膜梭菌α类毒素配制氢氧化铝胶苗的方法为：制备胶水(铝胶：生理盐水体积比为5：1)溶液，高压灭菌后，将α类毒素与胶水按体积比4:1-5:1(优选5：1)混合，充分摇匀后，无菌分装，得到牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗。

本实施例制备得到牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗的免疫效果、安全性检验结果请见实施例六的相关描述。

Claims (15)

1.牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗，是以免疫原性良好的牛A型产气荚膜梭菌菌株作为制苗用菌种，用专用培养基培养获得α毒素含量高的A型产气荚膜梭菌培养菌液，菌液经灭活、除菌、α毒素浓缩、制苗，得到牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗。

2.根据权利要求1所述的牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗，其特征在于：所述免疫原性良好的牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A菌株为分离于内蒙古呼和浩特土左旗牛场猝死后围产期及产后奶牛病料、具有α毒素致死性的菌株，命名为CNM0702株、CNM0708株、CNM0715株、CNM0730株和CNM0732株。

3.根据权利要求1或2所述的牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗，其特征在于：所述牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A菌株为CNM0708株，其保藏编号为CGMCC No.14880。

4.根据权利要求1或2或3所述的牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗，其特征在于：所述专用培养基配方为：

将上述成分用水溶解后，调pH值至8.0-8.5，灭菌，使用时加入培养基体积0.5-1％的葡萄糖。

5.根据权利要求1-4所述的牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗，其特征在于：所述浓缩过程使用膜孔径3-5KD的中空纤维柱浓缩α类毒素。

6.牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A菌株，用作牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗生产中的菌种，其特征在于：为分离于内蒙古呼和浩特土左旗牛场猝死后围产期及产后奶牛病料、具有α毒素致死性的菌株，命名为CNM0702株、CNM0708株、CNM0715株、CNM0730株和CNM0732株。

7.保藏编号为CGMCC No.14880的牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens typeA CNM0708。

8.权利要求1至5任一所述牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗生产中的专用培养基，其配方为：

将上述成分用水溶解后，调pH值至8.0-8.5，灭菌，使用时加入培养基体积0.5-1％的葡萄糖。

9.权利要求1-5任一所述的牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗的制备方法，是以所述免疫原性良好的牛A型产气荚膜梭菌菌株作为制苗用菌种，用所述专用培养基在适宜培养条件下培养获得α毒素含量高的A型产气荚膜梭菌培养菌液，菌液经灭活、除菌体、用膜孔径3-5KD的中空纤维柱浓缩α类毒素、制苗，得到牛A型产气荚膜梭菌Clostridiumperfringens type A灭活类毒素疫苗。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述适宜培养条件为：菌种含量1-2％(体积比)，36-37℃静置培养5-7小时。

11.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于：菌液灭活的方法为：使用0.4％-0.8％(V/V)甲醛溶液灭活，37℃灭活2-3天，每日振摇2-3次。

12.根据权利要求9至11任一所述的制备方法，其特征在于：所述除菌体包括离心、过滤除菌过程，方法为：先4℃、6000-8000rpm离心20-30min，再对离心上清液使用0.45μm级过滤器进行过滤去除菌体，留滤过液。

13.根据权利要求9-12任一所述的制备方法，其特征在于：将α类毒素浓缩10倍的方法为：使用0.5mol/L氢氧化钠溶液预处理中空纤维2-4小时，连接管路，浓缩过程中进液泵压力及出液压力不得超过0.1KMa，将20000mL含α毒素的滤过液原液浓缩至1000mL时，用pH7.6-7.8的PBS液进行洗滤，洗滤后总体积达2000mL时停止，即完成α毒素的10倍浓缩。

14.根据权利要求9-13任一所述的制备方法，其特征在于：所述制苗方法为：将氢氧化铝胶和生理盐水按体积比5：1制备胶水，高压灭菌后，将α类毒素与胶水按体积比4:1-5:1(优选5：1)混合、摇匀，得到氢氧化铝胶苗。

15.制备牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗的方法，包括以下步骤：

1)菌液制备：用权利要求7所述牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A菌株CNM0708为菌种，按1-2％(体积比)加入到权利要求8所述专用培养基中，36-37℃下静置培养5-7小时，得到α毒素含量高的A型产气荚膜梭菌培养菌液；

2)菌液灭活：向A型产气荚膜梭菌培养菌液中加入其体积比0.3-0.5％的甲醛溶液，37℃保持2-3天，期间每日搅拌2-3次；

3)除菌体：先在4℃、6000-8000rpm下对灭活的菌液离心20-30min，再使用0.45μm级过滤器对离心上清液过滤去除菌体，留滤过液；

4)浓缩α毒素：使用孔径3-5KD的中空纤维柱将步骤3)除菌体后溶液中的α类毒素浓缩10-20倍；

5)制苗：用浓缩的α类毒素配制氢氧化铝胶苗的方法为：将氢氧化铝胶和生理盐水按体积比5：1制备胶水，高压灭菌后，将浓缩的α类毒素与胶水按体积比4:1-5:1(优选5：1)混合、摇匀，得到氢氧化铝胶苗；

6)将氢氧化铝胶苗无菌分装，得到牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗。