CN111018968A

CN111018968A - 一种通过超滤浓缩制备高浓度抗体制剂的方法

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Publication number: CN111018968A
Application number: CN201911295137.3A
Authority: CN
Inventors: 靳志刚; 常云�
Original assignee: Ease Charm Ltd
Current assignee: Ease Charm Ltd
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2020-04-17
Anticipated expiration: 2039-12-16
Also published as: CN111018968B

Abstract

本发明高浓度抗体制备技术领域，具体涉及一种通过超滤浓缩制备高浓度抗体制剂的方法。该方法包括如下步骤：1)保持进料流速恒定，调节进料压力及回流端压力以保持TMP不变的条件下，初步浓缩抗体蛋白至浓度为50‑95mg/mL；2)在调整进料速度以保持跨膜压力TMP不变的条件下将浓缩抗体蛋白至浓度为180‑250mg/mL或粘度为30mPa.s以上。本发明采用“初浓缩‑洗滤‑再浓缩”的顺序进行样品超滤，首先控制浓度≤95g/L可以大大增加样品在超滤过程中的稳定性，缩短工艺时间，降低工艺难度。而且，在第一阶段保持流速恒定；第二阶段调节进料流速以保持TMP不变，将溶液置换成到目标缓冲液，以减少样品聚体的产生，缓解浓差极化现象，从而缩短工艺时间。

Description

一种通过超滤浓缩制备高浓度抗体制剂的方法

技术领域

本发明高浓度抗体制备技术领域，具体涉及一种通过超滤浓缩制备高浓度抗体制剂的方法。

背景技术

随着生物抗体药治疗的发展，对于皮下高浓度给药的需要越来越迫切。尤其是在对慢性疾病，如肿瘤疾病，的治疗领域，为了改进病人的用药方便和门诊病人的治疗配合度上，需要开发出越来越给药体积小而浓度高的抗体制剂。

在抗体药的生产工艺过程中，超滤浓缩(ultrafiltration/diafiltration,UF/DF)通常是纯化工艺的最后一步。超滤是按照被制备抗体分子大小为基础的膜过滤和换液技术。膜渗滤(DF)是超滤的一种特殊类型，是将缓冲液不断加入到截留液中，使得被纯化的目标蛋白不断地被浓缩，同时又将抗体药从所处的一种蛋白保护或者缓冲体系置换到另外一种缓冲保护体系中。

在生物制药行业中，最主要的UF/DF技术被称为是切向流超滤(TFF)(参考Shiloach J,1988；Van RR 2001)。在这个技术中，目标蛋白溶液在一定压力下，不断循环切向流过超滤膜，得到浓缩。TFF技术对于低或者中浓度的抗体蛋白溶液的制备非常有效的，而且批次之后的差异性也可以得到很好的控制。但是对于需要制备高浓度抗体的情况下，超滤浓缩过程就受到了技术上的挑战(参考Shire S J,2004；Luo R,2006；Shire S J,2009)。

在用TFF技术浓缩抗体制剂的过程中，高浓度的蛋白溶液很可能会造成整体通量的降低和超滤膜的堵塞(参考Liu J,2005,2006&2008；Couto D,2004；Kelby L,2012；Kim KJ,1992；Suki A,1984)。一般改进的做法是增加膜面积或者替换超滤膜，结果造成得率降低。另外的挑战是高浓度的蛋白溶液所造成的高粘度增加趋势。在需要降低粘度需要的应用中，可以采取的措施就是增加超滤工艺过程中温度(参考Winter C.,2009)，然而这个较长时间暴露在相对高温的条件下，蛋白的稳定性就会受到挑战。

例如，专利CN103889555A公开了一种通过超滤制备包含高度浓缩的抗体的组合物的方法，该方法通过调节进料流速，使得施用于超滤膜的进料压力的值提高至超滤膜的的指定最大进料压力的85-100％；同时降低进料速度，以制得浓度超过200g/L甚至是250g/L的抗体。

但该专利公开的浓缩方法存在浓缩时间长、影响抗体浓缩过程的稳定性等问题，具体原因分析如下：①压力控制方式为控制进料压力，这种压力控制方式缺乏灵活性，以及流速恒定，未依据浓缩进程中抗体浓度的变化作出相应调整；均导致浓缩工艺时间延长；②初步浓缩至较高浓度(200g/L)后才进行洗滤，影响样品在超滤过程中的稳定性，而且由于洗滤时样品粘度大、流速慢增加工艺难度，延长工艺时间。

参考文献

1.Shiloach J,et al.Tangential flow filtration.Adv Biotehnol Process(1988),8:97-125.

2.Van Reis R,Zydney A.Membrance separations in biotechnology.CurrOpin Biotechnol(2001),12:208-211.

3.Shire S J,et al.Challenges in the development of high proteinconcentration formulations.J Pharm Sci(2004)93:1390-1402.

4.Luo R,et al.High concentration UD/DF of a monoclonalantibody.Strategy for optimization and scale-up,BioProcess Int.4(2006)44-46.

5.Shire S J.Formulation and manufacturability of biologics.Curr OpinBiotechnol(2009),20:708-714.

6.Liu J,et al.,Reversible self-association increases the viscosity ofa concentrated monoclonal antibody in aqueous solution.Journal ofPharmaceutical Sciences,2005,94:1828-1940.

7.Liu J,Shire S J.Reduced-viscosity concentrated proteinformulations.US Patent Dec.15,2006,US20070116700.

8.Liu J,Steven S.Reduced-viscosity concentrated proteinformulations.US Patent May 24,2008.US20070116700.

9.Couto D.Amy L.Methods of tangential flow filtration and anapparatus therefore.Aug.26,2004.WO2004076695.

10.Kelby L,Jean B.et al.Method for preparing a composition comprisinghighly concentrated antibodies by ultrafiltration.US Patent Aug.31,2012.US9630988.

11.Kim K J,et al.Fouling mechanisms of membranes during proteinultrafiltration.Journal of Membrane Science,1992,68:79-91

12.Suki A,et al.,Flux decline in protein ultrafiltration.Journal ofMembrane Society,1984,21:269-283.

13.Winter C.Process for concentration of antibodies and therapeuticproducts thereof.US Patent Eeb.19,2009,US20090214522.

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种通过超滤浓缩制备高浓度抗体制剂的方法。该方法工艺时间长、操作简单，降低了抗体在浓缩过程中变性的风险、提高了抗体的稳定性。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种通过超滤浓缩制备高浓度抗体制剂的方法，其包括如下步骤：

1)保持进料流速恒定，调节进料压力及回流端压力以保持TMP不变的条件下，初步浓缩抗体蛋白至浓度为50-95mg/mL；

2)在调整进料速度以保持跨膜压力TMP不变的条件下，浓缩抗体蛋白至浓度为180-250mg/mL或粘度为30mPa.s以上。

优选地，在进行步骤2)继续浓缩步骤之前进行如下步骤2P)：

在保持步骤1)流速不变的条件下，先经过洗滤，将抗体蛋白溶液转换到目标缓冲液中，其中缓冲液的置换倍数为4-8。

作为一种制备高浓度抗体制剂的方法，步骤2)之后还包括如下步骤：将浓缩抗体蛋白稀释至浓度为127.5-172.5mg/ml；进一步地，稀释至150mg/mL。

优选地，1)初步浓缩抗体蛋白至浓度为55-95mg/mL、56-95mg/mL、57-95mg/mL、58-95mg/mL、59-95mg/mL、60-95mg/mL、62-95mg/mL、63-95mg/mL、64-95mg/mL、65-95mg/mL、66-95mg/mL、67-95mg/mL、68-95mg/mL、69-95mg/mL、70-95mg/mL、71-95mg/mL、73-95mg/mL、75-95mg/mL、76-95mg/mL、77-95mg/mL、78-95mg/mL、80-95mg/mL、81-95mg/mL、82-95mg/mL、83-95mg/mL、85-95mg/mL，如90mg/mL，95mg/mL。

优选地，步骤1)初步浓缩时超滤跨膜压大于1.0bar。

进一步优选地，步骤1)中所述超滤跨膜压为1.0-1.5bar。

进一步优选地，步骤1)进料流速参数设定为6-10L/m²/min。

更进一步优选为5-10L/m²/min、6-10L/m²/min、6-9L/m²/min、6-8L/m²/min。

优选地，步骤2)浓缩过程中进料流速为2-6L/m²/min；进一步优选为2-5L/m²/min、2-4L/m²/min、3-4L/m²/min、3-6L/m²/min、3-5L/m²/min。

优选地，步骤2)跨膜压恒定保持为0.7-1.2bar。

优选地，步骤2)继续浓缩抗体蛋白至浓度为200-250mg/mL。

优选地，所述通过超滤浓缩制备高浓度抗体制剂的方法是在温度为15-30℃条件下进行的。

进一步优选地，所述浓缩的温度为15-29℃、15-28℃、15-27℃、15-26℃、16-29℃、16-28℃、16-27℃、16-26℃、17-29℃、17-28℃、17-27℃、17-26℃、18-29℃、18-28℃、18-27℃、18-26℃、19-29℃、19-28℃、19-27℃、20-28℃、21-28℃、15-20℃、15-25℃。

优选地，通过调节进样压力和流速的平衡来维持超滤膜承受的压力在其最大承受压力的30％-80％内。

术语解释

1、超滤

超滤是指使用具有合适的物理或化学性质的合成半透膜，主要基于分子大小和形状来区分混合物中的分子，实现不同分子的分离或相似分子的浓缩。

本发明的一个实施方式中，所述超滤过程采用的超滤膜的材质为合成再生纤维素、醋酸纤维素和聚醚砜材质滤膜，截留分子量为10-80kDa。

2、抗体

术语“抗体”指特异识别抗原的蛋白质。抗体可为单克隆或多克隆的。抗体可以多种形式存在，包括，例如，Fv、Fab和F(ab)2以及单链(scFv)或双抗体。此外，抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、人源化抗体等)可用于本发明的方法。制备这些种类的抗体的方法为本领域公知的，并且任何方法可用于本发明，以制备所述抗体及其片段。

作为优选，本发明的抗体可以为单克隆抗体类似药的原液或者成品(如奥马珠单抗、曲妥珠单抗和贝伐珠单抗)的制备。

在本申请内术语“抗体制剂”表示含有高度浓缩抗体的含水缓冲溶液。该抗体制剂可用于治疗、预防、测试或诊断疾病的试剂的制备。

例如，所述抗体可通过以在通常批准的药物生产实践中所需的单位剂量形式与药学上可接受的载体或介质适当合并，特别是与无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、矫味剂、赋形剂、媒介物、螯合剂、防腐剂、粘合剂等适当合并。在这样的制剂中，调节活性成分的量，以得到在预定范围的适当的量。

3、跨膜压

术语“跨膜压力(TMP)”表示驱动流体穿过超滤膜而滤出的压力。TMP的值可如下计算：TMP＝(进口端压力+回流端压力)/2-透过端压力。

在TFF设备中的渗透物侧打开的情况下，TMP为进料压力和截留物质压力的平均值。压力值通常按“巴”或“MPa”或“psi”给出。

4、缓冲液置换倍数

所述缓冲液置换倍数是指抗体蛋白在超滤/浓缩过程中，抗体浓缩液所处的缓冲液体系A被另外一种缓冲液B置换时，B与A的体积比。

5、缓冲液、目标缓冲液

术语缓冲液表示溶液，其中由于添加或释放酸性或碱性物质，pH变化被缓冲物质抵消。可使用导致该效果的任何缓冲物质。

本发明的一个优选实施方案中，“抗体所在缓冲液”为组氨酸缓冲液，或者组氨酸、蔗糖、吐温缓冲液溶液。缓冲液的pH值为4-7.5，优选为6.0。

本发明的一个优选实施方案中，“目标缓冲液”为精氨酸或组氨酸缓冲溶液，缓冲液的pH值为5.5-6.8；优选为6.0。

与现有技术相比，本发明所取得的有益效果是：

(1)采用“初浓缩→洗滤→再浓缩”的顺序进行样品超滤，第一阶段控制浓度≤95g/L可以大大增加样品在超滤过程中的稳定性，尤其对于大规模浓缩工艺(2000L以上)，降低样品在超滤过程中变性的风险，缩短工艺时间，降低工艺难度。

(2)在进行超滤工艺浓缩部分时分两阶段进行，采用“初浓缩→洗滤→再浓缩”的顺序进行样品超滤，第一阶段浓度≤95g/L保持进料流速恒定，调节进料压力及回流端压力以保持TMP((进口端压力+回流端压力)/2-透过端压力)不变；第二阶段浓度≥95g/L时调节进料流速以保持TMP不变(在第二阶段开始浓缩之前进行洗滤，将溶液置换成含有目标缓冲液，以减少样品聚体的产生，缓解浓差极化现象，从而缩短工艺时间；经过比较，本发明提供的方法相比专利CN103889555A，工艺时间总体可缩短2-3倍。

(3)在洗滤时，样品浓度尚未达到较高浓度(≤95g/L)，因此洗滤速度可设置在较高值，进而提高了洗滤效率，缩短了洗滤时间。

(4)本发明的优选方案，是在不超过30度的温度条件下进行，减少了对温度敏感的蛋白产品产生变性的可能性。

附图说明

图1为初步超滤浓缩时跨膜压差与进料流速之间的关系曲线；

图2为高浓度蛋白样品浓缩时跨膜压差与进料流速之间的关系曲线；

图3为本发明实施例1提供的抗体蛋白组合物的二硫键总离子(TIC)LC-MS/MS图谱。

具体实施方式

本发明提供的是一种通过超滤浓缩制备高浓度抗体制剂的方法，首先，需将样品初步浓缩抗体蛋白至浓度为50-90mg/mL；在此步骤中，当进料流速恒定时，跨膜压TMP在一定范围内变化。

如图1所示，当进料流速Feedflow为70.4mL/min时，最优TMP范围为0.7-1.2bar；当进料流速为52.8mL/min时，最优TMP范围为0.7-0.9bar；当进料流速为35.2mL/min时，最优TMP范围为0.5-0.7bar。

因此，确定进料流速Feedflow范围为52.8-70.4mL/min(即6-8L/m²/min)，TMP范围为0.7-1.2bar。作为一个最优实施方式，进料流速Feedflow设定值为52.8mL/min(即6L/m²/min)，TMP值为0.7bar。

其次，在保持流速不变的条件下，设置缓冲液置换倍数为4-8，将抗体所在缓冲液置换为目标缓冲液；

在此步骤中，超滤浓缩过程中蛋白浓度的浓缩范围和蛋白特性变化结果见表1。由表中数据可以看出，浓度增加，最终制备样品的纯度并未发生明显变化，因此确定样品浓缩第一步范围定为50-95mg/mL。

表1.不同蛋白浓度下样品纯度检测结果

第三步，继续浓缩抗体蛋白至浓度为180-250mg/mL或粘度为30mPa.s以上；

此步骤中，在工艺摸索过程中可以看出，如图2所示，随着进样流速的提高，拐点处的TMP值也随之增大，当Feedflow为70.4mL/min，TMP在0.9-1.2bar范围内，斜率衰减较小，为提高工艺效率，故优选TMP值为1.2bar。

当进料流速和TMP确定后，将蛋白初步浓缩到75±5mg/mL。然后换液到目示超滤缓冲液中。在TMP为1.2bar的条件下，调整Feedflow以适应系统压力，将换液后的样品进行再浓缩，目标浓度为>180mg/mL。

最后，将浓缩后的蛋白进行稀释至目标浓度范围140-180mg/mL。

表2为其中一个实施方式，即稀释至140-180mg/mL时的蛋白含量及特性检测结果。

表2高浓度蛋白含量和特性检测结果。

样品名称	浓度(mg/mL)	纯度，SEC(％)	CEX(％)
				S POOL	177.42	99.7	主峰＞75

实施例1

试验样品起始浓度为18.03mg/mL。

1)初浓缩：编写程序，设置参数为：温度为室温，进样流速8L/m²/min，TMP 1.2bar，目标浓度75±5mg/mL；

2)六倍体积换液：设置换液倍数为6，将样品置换至pH为6.0的精氨酸缓冲液中；

3)再浓缩：设定TMP为1.2bar，调整流速以适应系统压力，避免超压，将样品进行再浓缩，目标浓度为180mg/mL；

4)稀释浓度至150mg/mL。

本发明提供的方法其中一个优势就是工艺时间明显缩短，为了证明这一点，将生产规模为2000L的起始浓度为18.03mg/mL的样品采用本发明的方法与现有技术专利CN103889555A进行比较，时间比较如下表3：

性能测试

1、储存稳定性

为了更好的体现本发明提供的浓缩纯化方法的优点，依次对实施例1样品浓缩过程中及最终样品在不同温度条件下稳定性进行考察。结果如下表4所示。

表4.高浓度蛋白制备过程和制备样品储存的稳定性结果

2、高浓度单抗样品的纯度及稳定性检测

对用发明的实施例1提供的超滤浓缩工艺纯化的单抗蛋白产品(抗IgE单克隆抗体LR008)，进行了进一步的物化、生物活性检测，经过对比研究表明，本发明的超滤浓缩工艺对制备的高蛋白产品的特性没有任何的不良影响，产品的进一步大规模生产的结果也证实了本发明工艺的稳定性和可行性。相关检测结果如下表5-表7。

从纯化产品的纯度、降解产物含量、电荷异构体等电点和蛋白效价指标上，都可以看出，本发明的超滤、浓缩工艺满足产品质量要求。

表5单抗蛋白产品的纯度和降解产物分析，CE-SDS结果

表6单抗蛋白产品的电荷异构体检测结果(cIEF)

批号	生产规模(L)	主峰pI值
			Lot1	2,000	7.12
Lot2	2,000	7.12
			Lot3	2,000	7.09
Lot4	2,000	7.08
			Lot5	2,000	7.10

表7单抗蛋白产品的效价检测结果(结合和中和活性检测)

同样，用本发明技术制备的单抗蛋白，经过进一步的分析检测，结果表明，连续不同批次的蛋白分子量、N-端糖型比例、蛋白二级结构组成在物化特征和高级结构上，都保持着一致性、稳定性，参考表8至表10。如图3所示，用本发明方法制备的高浓度蛋白制剂的二硫键分析结果都与理论数目相匹配。

表8单抗蛋白产品的质谱检测完成分子量(Q-TOF)

表9单抗蛋白产品的N-糖分析

批号	生产规模(L)	A1/M3B	F(6)A1	G0	G0F	Man5	G1Fa	G1Fb
									Lot1	2,000	1.5	7.5	1.8	81.1	6.1	1.1	0.9
Lot2	2,000	2.0	7.7	2.3	78.3	7.4	1.3	1.0
									Lot3	2,000	1.9	7.4	2.2	76.4	7.7	2.4	1.4
Lot4	2,000	1.9	7.4	2.2	76.4	7.7	2.4	1.4
									Lot5	2,000	0.9	7.2	0.8	82.6	5.3	1.7	1.2

表10单抗蛋白产品的圆二色(CD)蛋白二级结构分析

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种通过超滤浓缩制备高浓度抗体制剂的方法，其包括如下步骤：

2)在调整进料速度以保持跨膜压力TMP不变的条件下浓缩抗体蛋白至浓度为180-250mg/mL或粘度为30mPa.s以上。

2.根据权利要求1所述的方法，在进行步骤2)继续浓缩步骤之前进行如下步骤2P)：

3.根据权利要求1所述的方法，步骤2)之后还包括如下步骤：将浓缩抗体蛋白稀释至浓度为127.5-172.5mg/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，步骤1)进料流速参数设定为6-10L/m²/min。

5.根据权利要求1所述的方法，步骤1)初步浓缩时超滤跨膜压大于1.0bar。

6.根据权利要求1所述的方法，步骤2)浓缩过程中进料流速为2-6L/m²/min。

7.根据权利要求1所述的方法，步骤2)跨膜压恒定保持为0.7-1.2bar。

8.根据权利要求1所述的方法，步骤2)继续浓缩抗体蛋白至浓度为200-250mg/mL。

9.根据权利要求1所述的方法，所述通过超滤浓缩制备高浓度抗体制剂的方法是在温度为15-30℃条件下进行的。

10.根据权利要求1所述的方法，通过调节进样压力和流速的平衡来维持超滤膜承受的压力在其最大承受压力的30％-80％内。