CN114031084A - 硼类化合物修饰的硅胶材料、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以硼类化合物为修饰相，槲皮素为连接臂键合至氨基硅胶的硅胶材料。同时公开了该硅胶材料的制备方法，以氨基硅胶与槲皮素反应制备槲皮素修饰的氨基硅胶(HPS‑NH2@SiO2)；再将HPS‑NH2@SiO2与硼类化合物反应得到硼类化合物修饰的硅胶材料(B‑HPS‑NH2@SiO2)。对材料进行红外、SEM表征，并以人血清免疫球蛋白G/标准磷酸蛋白为模型样品，将硼类化合物修饰的硅胶材料装填至小型SPE柱中用于糖肽、磷酸化肽的富集。表现出良好的富集选择性，富集能力在负责样品体现得到验证。对其进行后修饰接入TiO2，可实现磷酸化肽的有效富集。本发明的B‑HPS‑NH2@SiO2及其衍生材料在亲水模式下实现糖肽/磷酸化肽的特异性富集的应用，在修饰化肽的选择性富集方面具有潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种硼类化合物修饰的硅胶材料及其制备方法，用于亲水模式糖肽特异性富集。
背景技术
糖基化是蛋白质翻译后修饰的重要形式，参与许多生命过程如细胞识别、免疫应答、细胞分化等。蛋白质糖基化的异常表达与许多疾病的发生密切相关，因此对糖蛋白/糖肽的研究是非常重要的。然而，由于糖肽的低丰度、糖基化位点的异质性、非糖肽对糖肽的离子抑制效应，从复杂样品中选择性富集糖蛋白/糖肽一直是蛋白组学的研究的巨大挑战(stationary phases for the enrichment of glycoproteins and glycopeptides)。因此，开发糖肽富集/分离策略以促进从复杂样品中特异性富集糖肽是必要的。目前糖肽富集/分离方法包括：亲和法、肼化学法、硼酸亲和法和亲水相互作用色谱法等(glycopetideenrichment and separation for protein glycosylationanalysis)。
硼酸法富集糖肽是利用硼羟基对糖肽链上顺式二羟基的特异性识别且可逆。碱性条件下，硼羟基与糖肽链上顺式二羟基形成五元环内酯，使材料保留住糖肽；但在酸性条件下，五元环内酯水解成硼羟基和糖肽从而释放糖肽，从而实现糖肽的特异性富集。因此发展新的材料用于糖肽的选择性富集应用前景广阔。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题是提供一种硼类化合物修饰硅胶材料。本发明要解决的另一个技术问题是，提供该硼类化合物修饰硅胶材料的制备方法。本发明还要解决的技术问题是，提供该硼类化合物修饰硅胶材料的应用。
本发明的技术方案是，一种硼类化合物修饰的硅胶材料，具有以下结构式：
本发明硅胶材料的特点是：槲皮素中的吡喃氧取代丙胺底物中的氮；硼类化合物与顺式二羟基特异性结合形成五元环内酯。
本发明的技术路线是：以氨基硅胶与槲皮素反应制备槲皮素修饰的氨基硅胶(HPS-NH2@SiO2)；再将HPS-NH2@SiO2与硼类化合物反应得到硼类化合物修饰的硅胶材料(B-HPS-NH2@SiO2)。
本发明选取了氨基硅胶作为基质，槲皮素为连接臂，硼类化合物作为修饰相从而合成的材料。氨基硅胶上的氮置换槲皮素中吡喃氧得到槲皮素修饰的氨基硅胶(HPS-NH2@SiO2)，再通过硼类化合物能与HPS-NH2@SiO2上槲皮素部分的邻二羟基发生酯化反应形成五元环状酯结构，得到硼类化合物修饰硅胶材料(B-HPS-NH2@SiO2)。
其合成示意图见图1：
其中Boron compounds为硼酸、四羟基硼烷或硼砂。
本发明还提供了一种硼类化合物修饰的硅胶材料的制备方法，包括如下步骤：
a.依次将槲皮素、氨基硅胶按4-6：1-2的质量比置于反应容器中，加入乙醇，70-90℃回流15-48h；
b.用乙醇洗涤产物2-4次、再用甲醇洗涤产物2-4次；
c.70-90℃干燥12-18h得到槲皮素修饰的氨基硅胶(HPS-NH2@SiO2)；
d.再将HPS-NH2@SiO2、硼类化合物分别溶于有机溶剂后再混合，30-80℃下反应充分；HPS-NH2@SiO2与硼类化合物的质量比是4-6：1-2；
e.反应结束后抽滤再依次用二甲基亚砜、甲醇、乙醇洗涤，真空干燥。
根据本发明的一种硼类化合物修饰的硅胶材料的制备方法，优选的是，步骤a所述氨基硅胶和槲皮素的质量比为4-6:1。
根据本发明的一种硼类化合物修饰的硅胶材料的制备方法，优选的是，步骤a所述氨基硅胶的性质是：粒径2-10um，孔径
根据本发明的一种硼类化合物修饰的硅胶材料的制备方法，优选的是，步骤d所述硼类化合物选自以下中的一种：硼酸、四羟基二硼烷、硼砂；HPS-NH2@SiO2与硼类化合物的质量比是4-6：1。
根据本发明的一种硼类化合物修饰的硅胶材料的制备方法，优选的是，步骤d所述反应时间是15-48小时；
步骤d所述的有机溶剂选自二甲基亚砜，或是二氧六环和均三甲苯的混合溶剂；
步骤e中，用于洗涤第二步产物的溶剂依次是二氧六环、甲醇、乙醇。
步骤e的洗涤中，可以用二甲基六环替代二甲基亚砜。四羟基二硼烷的合成采用的溶剂为二氧六环和均三甲苯；硼砂和硼酸的合成采用的是二甲基亚砜。
步骤d所述的有机溶剂可以选自二甲基亚砜，第二种选择是二氧六环和均三甲苯的混合溶剂。二氧六环和均三甲苯的混合比例是10:1-1:10。(体积比)
根据本发明的一种硼类化合物修饰的硅胶材料的制备方法，优选的是，步骤e所述真空干燥时间是50-80℃。真空干燥的时间优选12-24小时。
二甲基亚砜、二氧六环和均三甲苯等溶剂用于溶解槲皮素修饰的氨基硅胶(HPS-NH2@SiO2)以及硼类化合物。溶剂(ml)与氨基硅胶(g)的用量比为2-1:1；溶剂(ml)与硼类化合物(g)的用量比为2-1:1。
本发明还提供了上述硼类化合物修饰的硅胶材料在亲水模式下糖肽的特异性富集的应用。将上述硼类化合物修饰硅胶材料作为富集材料，采用固相萃取(SPE)富集和纯化糖肽。亲水模式下糖肽、磷酸化肽富集后采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)检测。
在本发明的上述应用中，采用柱固相萃取(SPE)模式富集糖肽。将混有材料的上样液装入SPE柱中，糖肽样品上样SPE柱，淋洗液洗出与材料结合的非糖肽，最后用洗脱液将糖肽洗脱下来，收集洗脱液。
在糖肽富集应用中，取适量硼类化合物修饰硅胶材料装填于SPE柱中，用上样液清洗平衡材料；将肽样品溶于上样液中缓慢推入装有材料的SPE柱中，保证材料与糖肽的充分结合。用淋洗液冲洗材料除去非糖肽，用洗脱液洗脱并收集馏分，进行质谱分析。
所述上样液为：ACN/H2O/TFA＝85-92:7-14:1,v/v/v(ACN为乙腈，H2O为水，TFA为三氟乙酸)；
淋洗液为：ACN/H2O/TFA＝85-92:7.9-14.9:0.1,v/v/v(ACN为乙腈，H2O为水，TFA为三氟乙酸)；
洗脱液为：ACN/H2O/TFA＝0-1:97-99:1-3,v/v/v(ACN为乙腈，H2O为水，TFA为三氟乙酸)。
本发明还提供了上述硼类化合物修饰的硅胶材料在磷酸化肽富集方面的应用。对该硼类化合物修饰的硅胶材料进行后修饰接入TiO2，在磷酸化肽富集方面具有良好的应用前景。其原理是TiO2作为两性物质，酸性条件下，钛原子带正点，能结合磷酸化肽；碱性条件下钛原子带负电，释放磷酸化肽。
人血清免疫球蛋白G酶解液中糖肽的分子量及其聚糖结构见表一；α-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的信息见表二。
本发明具有如下优点：
1：原材料价廉易得，合成方法简便，后处理简易。
2：硼类化合物修饰的硅胶材料高选择性的富集糖肽，实现糖肽的有效富集。
3：硼类化合物修饰的硅胶材料可被装填成不同长度、内径的柱子，操作简单，重复性好。
4：硼类化合物修饰的硅胶材料后修饰接入TiO2，在磷酸化肽富集方面的有良好的应用前景。
5：本发明富集得到的糖肽、磷酸化肽可直接通过基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)检测，提高质谱的检测灵敏度。
附图说明
图1为硼类化合物修饰的硅胶材料的制备过程图。
图2为使用实施例1中的硼类化合物修饰的硅胶材料的糖肽富集图。
图3为使用实施例2中的硼类化合物修饰的硅胶材料的扫描电镜图。
图4为使用实施例2中的硼类化合物修饰的硅胶材料的糖肽富集图。
图5为使用实施例3中的硼类化合物修饰的硅胶材料的扫描电镜图。
图6为使用实施例3中的硼类化合物修饰的硅胶材料的糖肽富集图。
图7为使用实施例4中的硼类化合物修饰的硅胶材料的复杂样品(高非糖肽掺入比IgG:BSA＝1:200)的糖肽富集图。
图8为使用实施例5中的硼类化合物修饰的硅胶材料的复杂样品(高非糖肽掺入比IgG:BSA＝1:500)的糖肽富集图。
图9A为使用实施例6中的JR-TiO2-SA-B3-HPS-NH2@SiO2，洗脱液为0.4M氨水时的磷酸化肽富集图。
图9B为使用实施例6中的JR-TiO2-SA-B3-HPS-NH2@SiO2，洗脱液为10％氨水时的磷酸化肽富集图。
具体实施方式
上样液组成如下a-b任一之一所示：
a.ACN/H2O/TFA＝90:9:1,v/v/v(ACN为乙腈，H2O为水，TFA为三氟乙酸)。
b.ACN/H2O/TFA＝92:7:1,v/v/v(ACN为乙腈，H2O为水，TFA为三氟乙酸)。
淋洗液组成如下所示：
ACN/H2O/TFA＝90:9.9:0.1,v/v/v(ACN为乙腈，H2O为水，TFA为三氟乙酸)。
洗脱液组成如下a-c任一之一所示：
a.ACN/H2O/TFA＝0:97:3,v/v/v(ACN为乙腈，H2O为水，TFA为三氟乙酸)。
b.ACN/H2O/TFA＝0:99:1,v/v/v(ACN为乙腈，H2O为水，TFA为三氟乙酸)。
c.0.4mol/L氨水、10％氨水。
肽样品浓度为1mg/ml、1mg/ml、5mg/ml。
所述肽样品为蛋白酶解液。
蛋白为人血清免疫球蛋白G(IgG)、标准磷酸化蛋白质(α-酪蛋白)或牛血清白蛋白(BSA)。
所述的酶为胰蛋白酶。
收集的洗脱液采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)检测。
实施例1
1.称取5g的氨基硅胶、1g的槲皮素、200ml的乙醇于烧瓶中，80℃回流24h。乙醇洗涤3次，甲醇彻底洗涤。80℃干燥24h。得到槲皮素修饰的氨基硅胶(HPS-NH2@SiO2)。
1g HPS-NH2@SiO2于10ml二甲基亚砜超声溶解；0.2g硼酸 、10ml二甲基亚砜超声溶解。将溶有HPS-NH2@SiO2的二甲基亚砜溶液加入溶有硼酸的二甲基亚砜溶液混合均匀后在30℃下反应24h。反应结束后抽滤再用二甲基亚砜、甲醇、乙醇分别洗，60℃真空干燥得到硼酸修饰的硅胶材料(B1-HPS-NH2@SiO2)。
2.糖肽富集：取1mg B1-HPS-NH2@SiO2装填于SPE柱中，用上样液清洗平衡材料，上样液：ACN/H2O/TFA＝92:7:1,v/v/v；将6ug IgG溶于上样液中缓慢推入装有材料的SPE柱中，保证材料与糖肽的充分结合；接着用30ul的淋洗液淋洗2次，淋洗液：ACN/H2O/TFA＝90:9.9:0.1,v/v/v；以除去与材料结合的非糖肽；最后用5ul洗脱液洗两次以洗脱与材料结合的糖肽，洗脱液：ACN/H2O/TFA＝0:99:1，v/v/v。收集洗脱液，用MALDI-TOF分析糖肽富集情况。
B1-HPS-NH2@SiO2的糖肽富集如图2，从图中可知富集糖肽数26条。
实施例2
1.称取5g的氨基硅胶、1g的槲皮素、200ml的乙醇于烧瓶中，80℃回流24h。乙醇洗涤3次，甲醇彻底洗涤。80℃干燥24h。得到槲皮素修饰的氨基硅胶(HPS-NH2@SiO2)。
1g HPS-NH2@SiO2于10ml均三甲苯超声溶解；0.2g四羟基二硼烷 、10ml二氧六环超声溶解。将溶有HPS-NH2@SiO2的均三甲苯溶液加入溶有四羟基二硼烷的二氧六环溶液混合均匀后在80℃下反应24h。反应结束后抽滤再用二氧六环、甲醇、乙醇分别洗，60℃真空干燥得到四羟基二硼烷修饰的硅胶材料(B2-HPS-NH2@SiO2)。
2.材料表征：图3为B2-HPS-NH2@SiO2的扫描电镜图。
3.糖肽富集：取1mg B2-HPS-NH2@SiO2装填于SPE柱中，用上样液清洗平衡材料，上样液：ACN/H2O/TFA＝90:9:1,v/v/v；将6ug IgG溶于上样液中缓慢推入装有材料的SPE柱中，保证材料与糖肽的充分结合；接着用30ul的淋洗液淋洗2次，淋洗液：ACN/H2O/TFA＝90:9.9:0.1,v/v/v；以除去与材料结合的非糖肽；最后用5ul洗脱液洗两次以洗脱与材料结合的糖肽，洗脱液：ACN/H2O/TFA＝0:97:3，v/v/v。收集洗脱液，用MALDI-TOF分析糖肽富集情况。
B2-HPS-NH2@SiO2的糖肽富集如图4，从图中可知富集糖肽数35条。
实施例3
1.称取5g的氨基硅胶、1g的槲皮素、200ml的乙醇于烧瓶中，80℃回流24h。乙醇洗涤3次，甲醇彻底洗涤。80℃干燥24h。得到槲皮素修饰的氨基硅胶(HPS-NH2@SiO2)。
1g HPS-NH2@SiO2于10ml均三甲苯超声溶解；0.2g硼砂、10ml二甲基亚砜超声溶解。将溶有HPS-NH2@SiO2的二甲基亚砜溶液加入溶有硼砂的二甲基亚砜溶液混合均匀后在30℃下反应24h。反应结束后抽滤再用二甲基亚砜甲醇、乙醇分别洗，60℃真空干燥得到硼砂修饰的硅胶材料(B3-HPS-NH2@SiO2)。
2.材料表征：图5为B3-HPS-NH2@SiO2的扫描电镜图。
3.糖肽富集：取1mg B3-HPS-NH2@SiO2装填于SPE柱中，用上样液清洗平衡材料，上样液：ACN/H2O/TFA＝92:7:1,v/v/v；将6ug IgG溶于上样液中缓慢推入装有材料的SPE柱中，保证材料与糖肽的充分结合；接着用30ul的淋洗液淋洗2次，淋洗液：ACN/H2O/TFA＝90:9.9:0.1,v/v/v；以除去与材料结合的非糖肽；最后用5ul洗脱液洗两次以洗脱与材料结合的糖肽。洗脱液：ACN/H2O/TFA＝0:99:1，v/v/v。收集洗脱液，用MALDI-TOF分析糖肽富集情况。
B3-HPS-NH2@SiO2的糖肽富集如图6，从图中可知富集糖肽数34条。
实施例4
取2mg实施例2所合成的材料B2-HPS-NH2@SiO2装填于SPE柱中，用上样液清洗平衡材料，上样液：ACN/H2O/TFA＝90:9:1,v/v/v；将6ug IgG和106ug BSA溶于上样液中缓慢推入装有材料的SPE柱中，保证材料与糖肽的充分结合；接着用50ul的淋洗液淋洗6次，淋洗液：ACN/H2O/TFA＝90:9.9:0.1,v/v/v；以除去与材料结合的非糖肽；最后用5ul洗脱液洗两次以洗脱与材料结合的糖肽。洗脱液：ACN/H2O/TFA＝0:97:3，v/v/v。收集洗脱液，用MALDI-TOF分析糖肽富集情况。
图7为B2-HPS-NH2@SiO2的复杂样品(高非糖肽掺入比IgG:BSA＝1:200)的糖肽富集图，从图中可知富集糖肽数20条。
实施例5
取2mg实施例3所合成的材料B3-HPS-NH2@SiO2装填于SPE柱中，用上样液清洗平衡材料，上样液：ACN/H2O/TFA＝92:7:1,v/v/v；将6ug IgG和265ug BSA溶于上样液中缓慢推入装有材料的SPE柱中，保证材料与糖肽的充分结合；接着用50ul的淋洗液淋洗12次，淋洗液：ACN/H2O/TFA＝90:9.9:0.1,v/v/v；以除去与材料结合的非糖肽；最后用5ul洗脱液洗两次以洗脱与材料结合的糖肽。洗脱液：ACN/H2O/TFA＝0:99:1，v/v/v。收集洗脱液，用MALDI-TOF分析糖肽富集情况。
图8为B3-HPS-NH2@SiO2的复杂样品(高非糖肽掺入比IgG:BSA＝1:500)的糖肽富集图，从图中可知富集糖肽数21条。
实施例6
1.将海藻酸钠(SA)1g用100ml热水溶解(或者直接用油浴锅40℃-50℃热溶)；JR-400阳离子纤维素用100ml去离子水40℃水浴溶解。连续搅拌直至完全溶解。在超声的作用下，将JR-400阳离子纤维素水溶液滴加至海藻酸钠溶液中得到JR-SA。
将0.24g硫酸钛溶于15ml去离子水中搅拌溶解。在硫酸钛水溶液中加入5ml氨水(28wt％)，室温搅拌20min。生成Ti(OH)4沉淀用去离子水洗涤至中性，离心(6000rpm)3次，去除NH4+,SO4 2-。在Ti(OH)4沉淀中加入0.5ml H2O2(30wt％)和适量水，室温下连续搅拌30min，得到透明的橙黄色胶体(过氧钛酸PTA)。PTA胶体与JR-SA室温混合连续搅拌3得到JR-TiO2-SA。
取0.5g实施例3所合成的材料B3-HPS-NH2@SiO2溶于10ml去离子中与JR-TiO2-SA混匀连续搅拌12h。水洗离心分离后重溶于甲苯溶液于75℃反应6h。甲苯、丙酮、甲苯依次洗涤。95℃烘箱中保温2h，使PTA水解，原位生成纳米TiO2。80℃烘干得到JR-TiO2-SA-B3-HPS-NH2@SiO2。
2.磷酸化肽富集：取1mg JR-TiO2-SA-B3-HPS-NH2@SiO2装填于SPE柱中，用上样液清洗平衡材料，上样液：ACN/H2O/TFA＝90:9:1,v/v/v；将6ugα-酪蛋白酶解液溶于上样液中缓慢推入装有材料的SPE柱中，保证材料与磷酸化肽的充分结合；接着用30ul的淋洗液淋洗2次，淋洗液：ACN/H2O/TFA＝90:9.9:0.1,v/v/v；以除去与材料结合的非磷酸化肽；最后用5ul洗脱液分别洗两次以洗脱与材料结合的磷酸化肽。洗脱液：0.4mol/L氨水、10％氨水。收集洗脱液，用MALDI-TOF分析磷酸化肽富集情况。
JR-TiO2-SA-B3-HPS-NH2@SiO2的糖肽富集如图9，从图中可知富集磷酸化肽15条。
对材料进行红外、SEM表征，并以人血清免疫球蛋白G/标准磷酸蛋白为模型样品，将硼类化合物修饰的硅胶材料装填至小型SPE柱中用于糖肽、磷酸化肽的富集。表现出良好的富集选择性，富集能力在负责样品体现得到验证。对其进行后修饰接入TiO2，可实现磷酸化肽的有效富集。本发明的B-HPS-NH2@SiO2及其衍生材料在亲水模式下实现糖肽/磷酸化肽的特异性富集的应用，在修饰化肽的选择性富集方面具有潜在的应用前景。
Claims (10)
1.一种硼类化合物修饰的硅胶材料，其特征在于：具有以下结构式：
2.权利要求1所述的一种硼类化合物修饰的硅胶材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
a.依次将槲皮素、氨基硅胶按4-6：1-2的质量比置于反应容器中，加入乙醇，70-90℃回流15-48h；
b.用乙醇洗涤产物2-4次、再用甲醇洗涤产物2-4次；
c.70-90℃干燥12-18h得到槲皮素修饰的氨基硅胶(HPS-NH2@SiO2)；
d.再将HPS-NH2@SiO2、硼类化合物分别溶于有机溶剂后再混合，30-80℃下反应充分；HPS-NH2@SiO2与硼类化合物的质量比是4-6：1-2；
e.反应结束后抽滤再依次用二甲基亚砜、甲醇、乙醇洗涤，真空干燥。
3.根据权利要求2所述的一种硼类化合物修饰的硅胶材料的制备方法，其特征在于：步骤a所述氨基硅胶和槲皮素的质量比为4-6：1。
4.根据权利要求2所述的一种硼类化合物修饰的硅胶材料的制备方法，其特征在于：步骤a所述氨基硅胶的性质是：粒径2-10um，孔径
5.根据权利要求2所述的一种硼类化合物修饰的硅胶材料的制备方法，其特征在于：步骤d所述硼类化合物选自以下中的一种：硼酸、四羟基二硼烷、硼砂；HPS-NH2@SiO2与硼类化合物的质量比是4-6：1。
6.根据权利要求2所述的一种硼类化合物修饰的硅胶材料的制备方法，其特征在于：步骤d所述反应时间是15-48小时；
步骤d所述的有机溶剂选自二甲基亚砜，或是二氧六环和均三甲苯的混合溶剂；
步骤e中，用于洗涤第二步产物的溶剂依次是二氧六环、甲醇、乙醇。
7.根据权利要求2所述的一种硼类化合物修饰的硅胶材料的制备方法，其特征在于：步骤e所述真空干燥温度是50-80℃。
8.权利要求1所述硼类化合物修饰的硅胶材料在亲水模式下糖肽的特异性富集的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：采用柱固相萃取(SPE)模式富集糖肽。将混有材料的上样液装入SPE柱中，糖肽样品上样SPE柱，淋洗液洗出与材料结合的非糖肽，最后用洗脱液将糖肽洗脱下来，收集洗脱液。
10.权利要求1所述硼类化合物修饰的硅胶材料进行后修饰，在磷酸化肽富集方面的应用。
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| 易翔;张剑;翟云云;曾延波;李蕾;: "槲皮素键合纳米硅胶对牛血清蛋白吸附的研究", 化学研究与应用, vol. 22, no. 09, pages 1187 - 1190 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114031084B (zh) | 2023-10-27 |
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