CN114137221A - 一种肌红蛋白检测试剂配置方法及检测方法 - Google Patents

一种肌红蛋白检测试剂配置方法及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肌红蛋白检测试剂配置方法及检测方法，包括缓冲液R1，胶乳试剂R2‑3。其中，胶乳试剂R2‑3的制备包括：抗体氧化、胶乳颗粒清洗、胶乳颗粒活化、抗体标记、封闭、封闭结束后开始离心。将筛选好的肌红蛋白抗体标记在特定粒径的胶乳微球上，血清等样本中的肌红蛋白与标记了抗体的胶乳微球发生抗原抗体反应，在特定波长下检测其吸光度，吸光度的变化程度与样本中的肌红蛋白含量呈一定的线性关系。解决现有的胶乳免疫比浊试剂盒主要用单一粒径胶乳和抗体偶联，导致分析灵敏度低、抗体利用率低、线性范围窄等缺点。

Description

一种肌红蛋白检测试剂配置方法及检测方法
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，特别是涉及一种肌红蛋白检测试剂配置方法及检测方法。
背景技术
肌红蛋白(Myoglobin,Mb)是一种小分子色素蛋白，由珠蛋白与正铁血红素(Heme)结合而成，可与氧成可逆性结合，形成MbO2，MbO2称为氧合肌红蛋白，Mb称为脱氧肌红蛋白。在肌细胞内有转运和贮存氧的作用。在心肌受损时即从心肌细胞中弥散出来进入血液循环。肌红蛋白只存在于心肌及骨骼肌内，其他组织包括平滑肌内都不含有此种蛋白。
因为Mb是个较小分子的球蛋白，于肌红蛋白的分子量仅为17500，心肌或骨骼肌损伤时Mb可以从肌肉组织漏到循环血中去，而且能通过肾小球滤过，出现在尿中。因此血清和尿中Mb测定可用于某些肌病和心脏病的诊断，如急性肌损伤、急慢性肾衰竭、严重的充血性心力衰竭、长时间休克，神经肌肉病如肌营养不良、肌萎缩、皮肌炎，及各种原因引起的肌病。血清Mb在心梗早期明显升高，它比血清肌酸激酶同工酶升高的灵敏度还要高。因此，高灵敏度的肌红蛋白的检测在诊断心肌损伤疾病方面的及时性、进程、预后及治疗效果方面具有广泛的临床意义。
目前肌红蛋白的免疫检测方法主要有胶体金免疫层析法，酶联免疫测定法和化学发光免疫测定法等，胶体金法虽然操作简便，特异性好，可单份检测，但是难以定量，酶联免疫法灵敏度高，特异性好，可定量，适合大批量检测，但重复性差，仪器测定范围窄，操作复杂，化学发光法是当今最为敏感的微量免疫测定法，但是成本要求高，而胶乳免疫比浊法使用的全自动生化分析仪，自动化程度高，因其使用方便，操作简单、定量准确、检测快速等优点逐渐在医学检验中兴起，因现有的胶乳免疫比浊试剂盒主要用单一粒径胶乳和抗体偶联，这往往存在分析灵敏度低、抗体利用率低、线性范围窄等缺点。为了解决上述技术的缺点，本发明提出一种用两种不同粒径胶乳颗粒制备的肌红蛋白测定试剂，从而提高低浓度样本检测灵敏度，拓宽检测范围。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肌红蛋白检测试剂配置方法及检测方法，提出一种用两种不同粒径胶乳颗粒制备的肌红蛋白测定试剂，从而提高低浓度样本检测灵敏度，拓宽检测范围。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种肌红蛋白检测试剂配置方法，包括以下几个步骤：
(1)缓冲液R1的配制：按下表比例配置缓冲过液，调节PH至8.0±0.05，定容至1L容量瓶，用0.22um滤膜过滤，贴上标签，置于2-8℃保存；
缓冲液R1的配方
Figure BDA0003334002360000021
Figure BDA0003334002360000031
(2)胶乳试剂R2-3的制备：
(2-1)抗体氧化：取15ml抗人肌红蛋白抗体3mg/ml与20ml0.005mmol/L的高碘酸钠溶液室温混合10min后备用；
(2-2)胶乳颗粒清洗：量取固含为10％的苯乙烯胶乳颗粒0.5ml加至3.0ml的清洗缓冲液中，离心，20000转/分钟，30分钟，去上清，用3.0ml活化缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声；
(2-3)胶乳颗粒活化：量取2％的EDAC 0.1ml和4％NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)0.2ml的活化剂加入到上述清洗好的胶乳微粒中，混匀，对胶乳微粒进行活化，37℃活化0.5h；(EDAC和NHS为双官能团交联剂)
(2-4)抗体标记：将(2-1)步骤中氧化后的抗人肌红蛋白抗体加入到(2-3)步骤活化好的胶乳颗粒溶液中，37℃摇床混匀2h；
(2-5)封闭：对(2-4)步骤中标记结束后开始离心，20000转/分钟，30min，去上清，取5.0ml的封闭缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声，然后进行封闭，时间为1h；
(2-6)封闭结束后开始离心，20000转/分钟，30分钟,去上清，加入150ml胶乳保存液，超声重悬后得到乳白色溶液即为试剂R2-3。
2、根据权利要求1所述一种肌红蛋白检测试剂配置方法，其特征在于：步骤(2-2)中苯乙烯胶乳颗粒为50nm苯乙烯胶乳颗粒和150nm苯乙烯胶乳颗粒混合物，混合比例为4:1。
进一步地，步骤(2-2)中所用清洗缓冲液和活化缓冲液为磷酸盐缓冲液，根据用量需要等比方法用量。
进一步地，步骤(2-5)中所用的封闭缓冲液为1％BSA。
进一步地，步骤(2-1)中抗人肌红蛋白抗体包括兔、羊、鼠、鸡、鸭来源的单克隆抗体或多克隆的非亲和的IgG抗体、亲和的IgG抗体或IgY抗体中的一种或两种。
一种肌红蛋白检测试剂的测试方法，包括以下几个步骤：
(1)肌红蛋白标准品的配制：用含有1％BSA、0.1％NaN3的Hepes缓冲液配制100、200、400、800ng/ml的肌红蛋白，除菌过滤；
(2)多点定标，以样条函数Spline作为计算方法，以标准品的浓度为横轴，以吸光度△A数值为纵轴，绘制标准曲线，根据样品的△A值计算浓度；
试剂R1和试剂R2-3的使用和添加方式：
Figure BDA0003334002360000041
测定管中为待检测样品，对比绘制的标准曲线，得出样品中肌红蛋白的实际浓度值。
吸光度检测仪器为日立7180全自动生化分析仪；温度：37℃；比色杯：1cm；分析方法为两点终点法；测光点：19-34；主副波长：570/0。
其中空白管中放入纯水作为空白对照组，各个浓度的肌红蛋白标准品进行上表操作步骤进行检测，得出△A，绘制出标准曲线，然后将样本按照同样的操作步骤进行检测，所得△A对比标准曲线可得出样品中肌红蛋白的浓度。
实验原理：将筛选好的肌红蛋白抗体标记在特定粒径的胶乳微球上，血清等样本中的肌红蛋白与标记了抗体的胶乳微球发生抗原抗体反应，在特定波长下检测其吸光度，吸光度的变化程度与样本中的肌红蛋白含量呈一定的线性关系。
本发明用高碘酸钠氧化过的抗人肌红蛋白抗体，其原理是高碘酸钠可以将肌红蛋白抗体Fc片段上的羟基氧化成醛基，而醛基可以快速的和活化过的苯乙烯胶乳颗粒表面氨基结合，使抗人肌红蛋白抗体定向连接于苯乙烯胶乳颗粒上。
由碳化二亚胺(EDAC)活化过的苯乙烯胶乳颗粒，其是由碳化二亚胺与苯乙烯胶乳颗粒上的羧基发生反应后再与二胺或二酰肼类分子反应，胶乳表面生成氨基，氨基可与醛基快速反应进行交联。
本发明具有以下有益效果：
解决现有的胶乳免疫比浊试剂盒主要用单一粒径胶乳和抗体偶联，导致分析灵敏度低、抗体利用率低、线性范围窄等缺点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：根据表1绘制完成的标准曲线图。
具体实施方式
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
一种肌红蛋白检测试剂配置方法及检测方法，包括以下几个步骤：
(1)缓冲液R1的配制：按下表比例配置缓冲过液，调节PH至8.0±0.05，定容至1L容量瓶，用0.22um滤膜过滤，贴上标签，置于2-8℃保存；
Figure BDA0003334002360000061
(2)胶乳试剂R2的制备：
(2-1)抗体氧化：取15ml抗人肌红蛋白抗体3mg/ml与20ml0.005mmol/L的高碘酸钠溶液室温混合10min后备用；抗人肌红蛋白抗体用兔、羊、鼠、鸡、鸭来源的单克隆抗体或多克隆的非亲和的IgG抗体、亲和的IgG抗体或IgY抗体中的一种或两种。
(2-2)胶乳颗粒清洗：量取固含为10％的苯乙烯胶乳颗粒0.5ml加至3.0ml的清洗缓冲液中，离心，20000转/分钟，30分钟，去上清，用3.0ml活化缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声；本步骤所用清洗缓冲液和活化缓冲液均为磷酸盐缓冲液；可根据用量需要等比方法用量；
(2-3)胶乳颗粒活化：量取2％的EDAC 0.1ml和4％NHS 0.2ml的活化剂加入到上述清洗好的胶乳微粒中，混匀，对胶乳微粒进行活化，37℃活化0.5h；
(2-4)抗体标记：将(2-1)步骤中氧化后的抗人肌红蛋白抗体加入到(2-3)步骤活化好的胶乳颗粒溶液中，37℃摇床混匀2h；
(2-5)封闭：对(2-4)步骤中标记结束后开始离心，20000转/分钟，30min，去上清，取5.0ml的封闭缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声，然后进行封闭，时间为1h；封闭缓冲液为1％BSA。
(2-6)封闭结束后开始离心，20000转/分钟，30分钟,去上清，加入150ml胶乳保存液，超声重悬后得到乳白色溶液即为试剂R2。
按照上述(2-1)-(2-6)的操作步骤，分别配置R2-1为50nm苯乙烯胶乳颗粒；R2-2为150nm苯乙烯胶乳颗粒；R2-3为50nm和150nm苯乙烯胶乳颗粒混合，混合比例4:1。
(3)肌红蛋白标准品的配制：用含有1％BSA、0.1％NaN3的Hepes缓冲液配制100、200、400、800ng/ml的肌红蛋白，除菌过滤；
(4)测试方法
检测仪器：日立7180全自动生化分析仪。温度：37℃；比色杯：1cm；分析方法：两点终点法；测光点：19-34；主副波长：570/0。反应方向：(+)。校准方式：样条函数Spline。
计算方法：多点定标，以样条函数作为计算方法，以标准品的浓度为横轴，以△A数值为纵轴，可绘制标准曲线，根据样品的△A值可计算其浓度。
试剂R1和试剂R2-3的使用和添加方式：
Figure BDA0003334002360000081
下面主要是验证三种规格苯乙烯胶乳颗粒，哪一种最适合用于R2的配置，分别是R2-1为50nm苯乙烯胶乳颗粒；R2-2为150nm苯乙烯胶乳颗粒；R2-3为50nm和150nm苯乙烯胶乳颗粒混合。
一、线性对比：线性相关系数r：在[100-800ng/ml]范围内用接近线性区间下限的低值标本稀释接近线性区间上限的高值标本，混合成指定不同浓度(Xi)的标本，每个标本重复测定3次，分别计算测定结果的均值(yi)。以稀释浓度(Xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按如下公式计算线性回归的相关系数r，所得结果应符合r＞0.99要求。
Figure BDA0003334002360000091
分别用R2-1、R2-2、R2-3与对照试剂盒参与标准曲线的绘制(每个浓度测3次，△A取平均值)，结果如下：
表1
Figure BDA0003334002360000092
根据表1绘制完成的标准曲线如图1所示，图1由上至下依次为R2-3、R2-1、R2-2和对照试剂盒。从结果可以看出，用两种胶乳颗粒混合的R2-3试剂获得的标准曲线，r最大，线性回归结果最好。
二、检测限：将标准品稀释至不同的浓度，每个样品测10次，通过计算均值和SD值，得到试剂检测的最小检测限(SD≤10为合格)，结果如表2所示：
表2
Figure BDA0003334002360000093
Figure BDA0003334002360000101
从结果可以看出，R2-3的检测限为3ng/ml，检测限最低，灵敏度最高。
三、检测范围：等比例稀释一份高值血清样品(理论浓度为985ng/ml)，用不同的R2试剂每点重复测定3次，通过计算相关系数考察线性相关性，偏差小于1％为符合要求,结果见表3：
Figure BDA0003334002360000102
表3
结果显示，R2-1的线性范围为0-600ng/ml
R2-2的线性范围为0-600ng/ml
R2-3的线性范围为0-1000ng/ml
对照试剂盒的线性范围为0-800ng/ml
R2-3的线性范围表现最优
四、精密度：
采用高低两份质控品，分别用四种试剂连续测定10次，分别计算测定值的平均值和标准差，按(2)式计算批内变异系数(CV)，所得结果应CV应≤8.0％。(结果见表4)
Figure BDA0003334002360000111
式中：SD为标准差，计算公式为
Figure BDA0003334002360000112
dn为同水平各次所测值的偏差，计算公式为
Figure BDA0003334002360000113
xn为同水平各次所测值；
Figure BDA0003334002360000114
为平均值，计算公式为
Figure BDA0003334002360000115
Figure BDA0003334002360000116
表4
各试剂及精密度均在规定范围内，R2-3的变异系数略优于其他三组。
五、准确度：
取高、低两个水平的质控品，用R2-3同一批号试剂重复测定3次，测试结果记为(xi)，按(3)式求出相对偏差(Bi)，3次结果均应符合测定值与质控品靶值相对偏差应≤15.0％；如果3次结果中有2次符合要求，1次不符合要求，应重新连续测试20次，并分别按照(3)式计算相对偏差(Bi)，当大于等于19次结果符合要求，准确度被验证即符合测定值与质控品靶值相对偏差应≤15.0％的要求。
Figure BDA0003334002360000117
式中：xi为测定结果；
T为靶值。
结果如下：(表5)
Figure BDA0003334002360000121
变异系数均小于15％。
六、相关性：随机抽取50例血清样本，分别用R2-3试剂盒对照试剂盒方法检测样本中肌红蛋白含量，用CORREL函数计算其相关系数，相关系数≥0.9，则表明本发明的提出的试剂盒适用于肌红蛋白的检测。
Figure BDA0003334002360000122
Figure BDA0003334002360000131
根据线性对比、检测限、检测范围、紧密度、准确度、相关性的试验并计算，结果表明：R2-1、R2-2、R2-3中R2-3(50nm和150nm苯乙烯胶乳颗粒混合，混合比例4:1)配比效果最好，更加准确的检测肌红蛋白浓度。
本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (6)

1.一种肌红蛋白检测试剂配置方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
(1)缓冲液R1的配制：按下表比例配置缓冲过液，调节PH至8.0±0.05，定容至1L容量瓶，用0.22um滤膜过滤，贴上标签，置于2-8℃保存；
缓冲液R1的配方
Figure FDA0003334002350000011
(2)胶乳试剂R2-3的制备：
(2-1)抗体氧化：取15ml抗人肌红蛋白抗体3mg/ml与20ml0.005mmol/L的高碘酸钠溶液室温混合10min后备用；
(2-2)胶乳颗粒清洗：量取固含为10％的苯乙烯胶乳颗粒0.5ml加至3.0ml的清洗缓冲液中，离心，20000转/分钟，30分钟，去上清，用3.0ml活化缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声；
(2-3)胶乳颗粒活化：量取2％的EDAC 0.1ml和4％NHS 0.2ml的活化剂加入到上述清洗好的胶乳微粒中，混匀，对胶乳微粒进行活化，37℃活化0.5h；
(2-4)抗体标记：将(2-1)步骤中氧化后的抗人肌红蛋白抗体加入到(2-3)步骤活化好的胶乳颗粒溶液中，37℃摇床混匀2h；
(2-5)封闭：对(2-4)步骤中标记结束后开始离心，20000转/分钟，30min，去上清，取5.0ml的封闭缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声，然后进行封闭，时间为1h；
(2-6)封闭结束后开始离心，20000转/分钟，30分钟,去上清，加入150ml胶乳保存液，超声重悬后得到乳白色溶液即为试剂R2-3。
2.根据权利要求1所述一种肌红蛋白检测试剂配置方法，其特征在于：步骤(2-2)中苯乙烯胶乳颗粒为50nm苯乙烯胶乳颗粒和150nm苯乙烯胶乳颗粒混合物，混合比例为4:1。
3.根据权利要求1所述一种肌红蛋白检测试剂配置方法，其特征在于：步骤(2-2)中所用清洗缓冲液和活化缓冲液为磷酸盐缓冲液，根据用量需要等比方法用量。
4.根据权利要求1所述一种肌红蛋白检测试剂配置方法，其特征在于：步骤(2-5)中所用的封闭缓冲液为1％BSA。
5.根据权利要求1所述一种肌红蛋白检测试剂配置方法，其特征在于：步骤(2-1)中抗人肌红蛋白抗体包括兔、羊、鼠、鸡、鸭来源的单克隆抗体或多克隆的非亲和的IgG抗体、亲和的IgG抗体或IgY抗体中的一种或两种。
6.一种肌红蛋白检测试剂的测试方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
(1)肌红蛋白标准品的配制：用含有1％BSA、0.1％NaN3的Hepes缓冲液配制100、200、400、800ng/ml的肌红蛋白，除菌过滤；
(2)多点定标，以样条函数Spline作为计算方法，以标准品的浓度为横轴，以吸光度△A数值为纵轴，绘制标准曲线，根据样品的△A值计算浓度；
试剂R1和试剂R2-3的使用和添加方式：
Figure FDA0003334002350000031
测定管中为待检测样品，对比绘制的标准曲线，得出样品中肌红蛋白的实际浓度值。
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