CN114965983A - 一种试剂组、试剂盒及利用其进行免疫检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种试剂组、试剂盒及利用其进行免疫检测的方法。还公开了一种胶乳增强免疫比浊法试剂的制备方法,其包括以下步骤:将大粒径和小粒径胶乳微球分别活化后,将抗待测物的抗体加入大粒径胶乳微球中,待测物蛋白复合物加入小粒径胶乳微球中,进行偶联反应;反应液分别经封闭、离心、复溶和重悬后,即得包含抗体偶联的大粒径胶乳微球的R1试剂,和,包含待测物偶联的小粒径胶乳微球的R2试剂。本发明的试剂盒包括:所述R1试剂、R2试剂和校准品。本发明充分发挥了不同粒径胶乳微球的优势,极好地克服了现有方法存在的低值灵敏度和检测线性范围无法兼顾的问题,具有测值准确,操作简单、快速,可用于门急诊检测且仪器适用面广等优点。
Description
技术领域
本发明属于医学检测领域,具体地,涉及一种试剂组、试剂盒及利用其进行免疫检测的方法。
背景技术
胶乳增强免疫比浊法(Latex enhanced turbidimetric immunoassay,LETIA)通过共价偶联或物理吸附等方式,将抗体或抗原偶联到纳米尺寸的胶乳微球表面,形成胶乳微球-抗体或胶乳微球-抗原复合物。所述复合物与样本中的待测抗原或待测抗体高度特异性免疫结合反应,使胶乳微球表面的抗体或抗原与标本所含的待测物反应而形成微球聚集体,在反应过程中起到增强信号的作用,可以将检测的灵敏度提高好几个数量级,达到准确的定量效果。
胶乳增强免疫比浊可采用竞争法和非竞争法两种模式,竞争法可用于大分子待测物,也可用于小分子待测物,而非竞争法一般仅用于检测含有多个抗原表位的蛋白类待测物。小分子待测物由于分子量的限制,一般难以建立非竞争免疫比浊检测方法,而只有采用竞争免疫比浊的方式实施检测。竞争法胶乳增强比浊法是指样本所含待测物与检测体系固定量的待测物竞争结合限量的抗待测物抗体,使免疫反应体系在某特定波长下的吸光值(A)发生变化,通过测定该变化计算样本中小分子待测物的浓度,达到疾病诊断、筛查、监测等临床目的。
胶乳免疫比浊试剂中,灵敏度高低,直观的表现为吸光度信号值变化率高低及其测试重复稳定性,可以间接的通过最低检测限(Limit of Detection,简称LOD)来表述,即LOD越低,灵敏度越高。而线性范围是指按说明书使用可准确测量的范围,是衡量试剂盒质量的重要指标,也是保证使用和鉴定试剂盒的关键指标之一。
表面带有羧基官能团的聚苯乙烯(PS)纳米胶乳微球是LETIA试剂常用的载体,目前市售的胶乳增强免疫比浊法试剂主要是用单一粒径胶乳微球。选择粒径小的胶乳微球,微球的蛋白载量大,可以偶联更多的免疫结合试剂,往往可以获得更宽的待测物测量浓度范围,精密度和线性相对较好,检测的线性范围可覆盖高值区域。然而,小粒径微球的凝集导致的A值增量相对较小,检测灵敏度也相应较低,对于样本中含量极微的待测物,尤其是对于样本中含量极微且需要采用竞争免疫分析方式检测的小分子待测物,使用小粒径微球常常难以实现高灵敏检测,测值不准确,变异系数(CV)值过大。而选择粒径大的微球,所需的抗体量较少,能够有效增加吸光度信号值,成倍提高试剂灵敏度,有利于低值的检测以达到灵敏度的要求,但是会导致试剂空白过高,精密度和线性相对较差,微球检测的线性范围不够,因此高值检测不准确,而且大粒径胶乳通常会降低试剂线性范围和抗原过剩能力,且大粒径胶乳生产工艺更难控制。
发明内容
为克服现有技术的胶乳增强免疫法存在低值灵敏度和检测线性范围无法兼顾的问题,本发明提供了一种提高胶乳增强免疫比浊法线性范围和灵敏度的方法,该方法选用两种平均粒径不同的羧基化胶乳微粒,利用化学交联法使两种不同粒径大小的荧光微球同时偶联抗原复合物和抗体,充分发挥不同粒径胶乳微球的优势,极好地克服了胶乳增强免疫法存在的低值灵敏度和检测线性范围无法兼顾的问题。本发明还提供一种具有高灵敏度和宽线性范围的试剂及试剂盒,其包括:试剂1(R1)、试剂2(R2)和校准品,具有测值准确,操作简单、快速,可用于门急诊检测且仪器适用面广等优点。
为解决上述技术问题,本发明使用的技术方案之一为:一种胶乳增强免疫比浊法试剂的制备方法,所述方法包括以下步骤:
(1)大粒径胶乳微球和小粒径胶乳微球分别与活化缓冲液混匀后加入活化剂进行活化;
(2)将抗待测物的抗体加入活化后的大粒径胶乳微球中,将待测样本与蛋白制备成待测物蛋白复合物后加入活化后的小粒径胶乳微球中,分别进行偶联反应;
(3)向偶联反应后的反应液中加入封闭液进行封闭,封闭后弃上清,固形物分别用缓冲液复溶并重悬,即得包含抗体偶联的大粒径胶乳微球的R1试剂,和,包含待测物偶联的小粒径胶乳微球的R2试剂;
其中,所述的胶乳微球为疏水微球,表面带有负电荷的羧基;所述的大粒径胶乳微球固体含量为5%-10%;粒径为275-310nm;所述的小粒径胶乳微球固体含量为5%-10%;粒径为70-90nm。
在一些实施方案中,步骤(1)中,所述的活化缓冲液为MES缓冲液;和/或,所述的活化剂为NHS和EDC;和/或,胶乳微球:NHS:EDC的总质量比为7:10:1;和/或,所述活化的温度为37℃,反应时间为30-60min;和/或,步骤(3)中,封闭后通过离心弃上清;
在一些优选的实施方案中,所述胶乳微球为羧基聚苯乙烯胶乳微球;和/或,所述的大粒径胶乳微球固体含量为10%,粒径为275nm;和/或,所述的小粒径胶乳微球固体含量为5%,粒径为70nm;和/或,步骤(1)中,所述MES缓冲液的浓度为20mmol/L,pH值为6.1;和/或,步骤(3)中,所述的离心的转速为16,000rpm,时间为40min。
在一些实施方案中,步骤(2)中所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体中的任意一种;所述的待测物蛋白复合物为药物与钥孔血蓝蛋白的复合物;和/或,所述偶联反应的温度为25℃,反应时间为10-90min;优选地,所述的待测物为他克莫司、雷帕霉素或环孢霉素。
在一些实施方案中,所述的抗体经缓冲液稀释后的浓度为0.5-5mg/mL;优选1mg/mL;和/或,所述的待测物蛋白复合物经缓冲液稀释后的浓度为20-100μg/mL;优选50μg/mL。
在一些实施方案中,步骤(3)中,所述的封闭液为牛血清白蛋白、甘氨酸或乙醇胺;和/或,所述封闭的温度为37℃,时间为30-60min,优选在震荡的条件下封闭,例如120rpm。
在一些实施方案中,步骤(3)中,复溶抗体偶联的大粒径胶乳微球所用的缓冲液(本发明中又称为R1缓冲液)的成分包括:
-50-100mmol/L HEPES或Tris或PBS;优选100mmol/L HEPES;
-1%NaCl;
-防腐剂:0.1%NaN3或Procline300或硫柳汞;优选0.1%Procline300;
-保护剂:1-5%海藻糖和0.1-0.5%甘氨酸;优选2%海藻糖和0.2%甘氨酸;
pH值为7.0-8.0;优选pH值为7.4;和/或,
复溶待测物蛋白复合物偶联的小粒径胶乳微球所用的缓冲液(本发明中又称为R2缓冲液)的成分为:
-50-100mmol/L HEPES或Tri或PBS;优选50mmol/L HEPES;
-3%PEG,分子量为6,000-20,000;优选分子量为8,000;
-防腐剂:0.1%NaN3或Procline300或硫柳汞;优选0.1%Procline300;
-保护剂:1%甘油和2%蔗糖;
pH值为6.5-8.5;优选pH值为8.0。
本发明使用的技术方案之二为:一种用于胶乳增强免疫比浊法的试剂组,所述的试剂组包括通过如技术方案之一所述的方法制得的包含抗体偶联的大粒径胶乳微球的R1试剂,和,用于制备含待测物蛋白复合物偶联的小粒径胶乳微球的R2试剂的各组分。
本发明使用的技术方案之三为:一种用于胶乳增强免疫比浊法的试剂盒,所述的试剂盒包括如技术方案之二所述的试剂组;优选还包括校准品;所述的校准品为含有已知浓度的待测物的标准溶液或冻干品,用于建立校准曲线。
本发明使用的技术方案之四为:一种利用胶乳增强免疫比浊法来检测样本的方法,所述方法包括以下步骤:(1)根据如技术方案之一所述的方法制备R1试剂和/或R2试剂;(2)将(1)制备的R1试剂,或如技术方案之二所述的试剂组或如技术方案之三所述的试剂盒中的R1试剂与(1)制备的R2试剂混合,例如按1:1的比例混合,在400-800nm例如546nm波长下测定吸光度,根据校准曲线计算待测样本的浓度。
本发明使用的技术方案之五为:如技术方案之二所述的试剂组或如技术方案之三所述的试剂盒在制备胶乳增强免疫比浊制剂中的应用。
本发明具有如下技术效果或优点:
本发明的技术方案是将抗待测物的抗体交联在大粒径聚苯乙烯胶乳微球表面,与包被在小粒径聚苯乙烯胶乳微球的待测物蛋白复合物反应,带动聚苯乙烯胶乳微球聚集产生一定浊度,而全血中的待测物将竞争地结合聚苯乙烯微球表面的单克隆抗体,因此,反应体系的浊度大小与样本中的待测物在一定范围呈负相关,可以用全自动生化仪在400-800nm波长下可定量标本中的小分子待测物浓度。
大粒径胶乳微球交联的单克隆抗体有利于低值的检测以达到灵敏度的要求,小粒径胶乳微球包被的待测物蛋白复合物使得检测的线性范围可覆盖高值区域,因此,本发明可同时满足对高灵敏度和宽检测线性范围的要求。
本发明选用了两种平均粒径不同的羧基化胶乳微粒,利用化学交联法使两种不同粒径大小的荧光微球同时偶联待测物蛋白复合物和抗体,充分发挥不同粒径胶乳微球的优势,极好的克服了胶乳增强免疫法存在的低值灵敏度和检测线性范围无法兼顾的问题。
具体实施方式
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题,总体思路如下:
将待测物偶联于蛋白,得到蛋白-待测物复合物,再通过所述蛋白所含的反应官能团与所述胶乳微球的表面官能团进行化学偶联,将所述蛋白-待测物偶联于所述胶乳微球表面,完成待测物对胶乳微球的间接偶联。单一载体分子上含有多个小分子;由于载体-小分子复合物-微球和抗体-胶乳微球的多价性,在适当的条件下载体-小分子复合物-微球与抗体-胶乳微球很容易引发凝集,而标本中的小分子待测物通过占据胶乳微球表面的抗体结合位点而抑制这种凝集反应,根据凝集反应的被抑制程度,可以用全自动生化仪在400-800nm波长下定量标本中的小分子待测物浓度。
下面将结合实施例、对照例及实验数据对本发明的一种提高胶乳增强免疫比浊法线性范围和灵敏度的方法进行详细说明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1:他克莫司测定试剂盒(乳胶增强免疫抑制法)
他克莫司-蛋白复合物的制备方法:称取他克莫司加入DMF溶解,再溶解于KLH。使用洗脱液过柱Sephadex G50,根据核酸蛋白定量检测仪的出峰信号收集第一峰为目标产物,装入透析袋中准备透析。透析完成后,收集产物。具体步骤参考(Feng-Bo Wu,Yun-YunYang,Xue-Bin Wang,et al.,Asample processing method for immunoassay of wholeblood tacrolimus.Analytical Biochemistry.2019,576,13-19)。
校准品的制备方法如下:
将新鲜抗凝牛全血进行超声破壁后过滤,加入0.1%庆大霉素和0.02%硫酸链霉素作为防腐剂,再按照需要添加他克莫司纯品。得到不同浓度的他克莫司校准品
他克莫司抗体偶联的胶乳微球的制备方法如下:
1.取1个1mL离心管,加入10%胶乳微球(JSR,#P0322,粒径250-370nm)平均粒径为310nm 0.1mL(即10mg),使用0.9mL活化缓冲液(20mmol/L MES,pH 6.1)稀释,即使得微球浓度为1%;
2.加入活化剂(100mg/mL NHS液:10mg/mL EDC液=142μL:142μL),充分摇匀;
3.加入他克莫司单抗1mg,立刻摇匀,然后置于恒温摇床(25℃,120rpm)反应90min;
4.间隔超声1min后,加入10%甘氨酸5mL,混匀,继续置于恒温摇床(37℃,120rpm)封闭30min;
5.封闭结束后,进行离心;
6.离心完成后,弃去上清,沉淀用10mL储存Buffer(100mmol HEPES,1%NaCl,0.1%Procline300,2%海藻糖和0.2%甘氨酸,pH值为7.4)分散,悬浮超声5min后置于2-8℃保存;
他克莫司蛋白复合物偶联的胶乳微球的制备方法如下:
1.取1个1mL离心管,加入5%胶乳微球(JSR,#0011,粒径70-110nm)平均粒径为90nm 0.2mL(即10mg),使用0.8mL活化缓冲液(20mmol/L MES,pH6.1)稀释,即使得微球浓度在1%;
2.加入活化剂(100mg/mL NHS液:10mg/mL EDC液=714μL:714μL),充分摇匀;
3.加入他克莫司蛋白复合物100μg,立刻摇匀,然后置于恒温摇床(25℃,120rpm)反应10min;
4.间隔超声1min后,加入10%乙醇胺5mL,混匀,间隔超声5min,继续置于恒温摇床(37℃,120rpm)封闭60min;
5.封闭结束后,进行离心;
6离心完成后,弃去上清,沉淀用12mL储存Buffer(50mmol/L HEPES,3%PEG8000,1%甘油,2%蔗糖,0.1%Procline300,pH值为8.0)分散,悬浮超声5min后置于2-8℃保存;
他克莫司测定方法如下:
测定样本之前,先使用萃取剂从全血中提取他克莫司:将300μL全血样本或校准品转移到含300μL萃取剂的1.5mL EP管中,涡旋仪上充分震荡10sec后,42℃水浴10min,离心处理,离心完成后,将离心管上清液倒出于干净的离心管内,并进行上机检测。
检测前,按下表数据设置设备参数:
表1:测定样本前,设备设置参数
按下表数据设置检测参数:
表2:测定样本前,设置检测参数
实施例2
在实施例1的基础上,将他克莫司单抗换为他克莫司多抗,其他组分和工艺与实施例1相同。
实施例3
在实施例1的基础上,抗体包被胶乳微球粒径(JSR,#0221,粒径220-330nm)平均粒径为275nm,其他组分和工艺与实施例1相同。
实施例4
在实施例1的基础上,他克莫司蛋白复合物包被胶乳微球(JSR,#0001,粒径50-90nm)平均粒径为70nm,其他组分和工艺与实施例1相同。
实施例5
在实施例1的基础上,抗体不经过活化交联直接混匀于R1缓冲液中,其他组分和工艺与实施例1相同。
实施例6
在实施例1的基础上,抗原复合物不经过活化交联直接混匀于R2缓冲液中。其他组分和工艺与实施例1相同。
实施例7
在实施例1的基础上,试剂R1:R2的体积比为1:2(实施例7-1)或2:1(实施例7-2)。其他组分和工艺与实施例1相同。
各实施例检测试剂盒的各项性能测试:
1.线性关系检测方法:用接近线性范围上限的高浓度样本和接近线性范围下限的低浓度样本,混合成6个稀释浓度(Xi),每个浓度测定三次取平均值(Yi),以稀释浓度(Xi)为自变量,以检测结果均值(Yi)为因变量求出线性回归方程,并计算线性回归的相关系数(r)。线性关系检测,具体检测数据见表3。
表3:线性关系检测数据
由上述表3的检测数据可知,采用大粒径微球包被抗体,抗原复合物没有活化交联于小粒径微球中而是直接混匀于R2缓冲液中(实施例6),以及R1:R2体积比为1:2(实施例7-1)和R1:R2体积比2:1(实施例7-2)三组样本的线性系数明显小于其他组,证明本发明提供的检测方法,可以明显提高检测的线性关系。
2.灵敏度检测:用校准品A作为样本测试试剂(盒),在测试波长546nm(主)、1cm光径、37℃条件下,记录R2加入后约5min(t)后的吸光度(A2),A2测试结果即为试剂空白吸光度测定值,吸光度差值(ΔA);用试剂(盒)测试空白样本(校准品A),重复测试20次。计算20次测试结果浓度的平均值和标准差,计算平均值+2标准差即为空白限。灵敏度检测的具体数据见表4和表5。
表4:试剂吸光度差值
实施例 | 吸光度差值 |
实施例1 | ≥1.5 |
实施例2 | ≥1.5 |
实施例3 | ≥1.5 |
实施例4 | ≥1.5 |
实施例5 | ≥1.0 |
实施例6 | ≥1.5 |
实施例7-1 | ≥1.0 |
实施例7-2 | ≥1.0 |
表5:空白样本(校准品A)20次测试的空白限
由上述表4和表5的检测数据可知,采用小粒径微球包被抗原复合物,抗体没有活化交联于大粒径微球中而是直接混匀于R1缓冲液中(实施例5),以及R1:R2体积比为1:2(实施例7-1)和R1:R2体积比2:1(实施例7-2)三组样本的吸光度和空白限明显差于其他组,证明本发明提供的检测方法,可以用于检测多种抗体,检测灵敏度高。
表6:精密度检测数据
由上述表6的检测数据可知,仅采用大粒径微球包被抗体,抗原复合物没有活化交联于小粒径微球中而是直接混匀于R2缓冲液中(实施例6),以及R1:R2体积比为1:2(实施例7-1)和R1:R2体积比2:1(实施例7-2)三组样本的精密度明显差于其他组,证明本发明提供的检测方法,可以用于检测多种抗体,且检测精密度高。
4.准确性检测:用不少于30个在检测浓度范围内不同浓度的人源样本,以国外进口产品的检测系统进行比对;每份样本按试剂盒操作方法及比对方法分别检测,用线性回归方程计算两组结果的相关系数及相对偏差。准确度检测的具体数据见表7。
表7:准确度检测数据
由上述表7的检测数据可知,仅采用单一粒径微球(实施例5和6),以及R1:R2体积比为1:2(实施例7-1)和R1:R2体积比2:1(实施例7-2)四组样本的精密度明显差于其他组,证明本发明提供的检测方法,可以用于检测多种抗体,且检测准确度高。
综上,本发明不仅提高了检测的灵敏度,还可以明显提高检测的线性范围。
Claims (10)
1.一种胶乳增强免疫比浊法试剂的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)大粒径胶乳微球和小粒径胶乳微球分别与活化缓冲液混匀后加入活化剂进行活化;
(2)将抗待测物的抗体加入活化后的大粒径胶乳微球中,将待测样本与蛋白制备成待测物蛋白复合物后加入活化后的小粒径胶乳微球中,分别进行偶联反应;
(3)向偶联反应后的反应液中加入封闭液进行封闭,封闭后弃上清,固形物分别用缓冲液复溶并重悬,即得包含抗体偶联的大粒径胶乳微球的R1试剂,和,包含待测物偶联的小粒径胶乳微球的R2试剂;
其中,所述的胶乳微球为疏水微球,表面带有负电荷的羧基;所述的大粒径胶乳微球固体含量为5%-10%,粒径为275-310nm;所述的小粒径胶乳微球固体含量为5%-10%,粒径为70-90nm。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的活化缓冲液为MES缓冲液;和/或,所述的活化剂为NHS和EDC;和/或,胶乳微球:NHS:EDC的总质量比为7:10:1;和/或,所述活化的温度为37℃,反应时间为30-60min;和/或,步骤(3)中,封闭后通过离心弃上清;
优选地,所述胶乳微球为羧基聚苯乙烯胶乳微球;和/或,所述的大粒径胶乳微球固体含量为10%,粒径为275nm;和/或,所述的小粒径胶乳微球固体含量为5%,粒径为70nm;和/或,步骤(1)中,所述MES缓冲液的浓度为20mmol/L,pH值为6.1;和/或,步骤(3)中,所述的离心的转速为16,000rpm,时间为40min。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体中的任意一种;所述的待测物蛋白复合物为药物与钥孔血蓝蛋白的复合物;和/或,所述偶联反应的温度为25℃,反应时间为10-90min;优选地,所述的待测物为他克莫司、雷帕霉素或环孢霉素。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的抗体经缓冲液稀释后的浓度为0.5-5mg/mL,优选1mg/mL;和/或,所述的待测物蛋白复合物经缓冲液稀释后的浓度为20-100μg/mL,优选50μg/mL。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述的封闭液为牛血清白蛋白、甘氨酸或乙醇胺;和/或,所述封闭的温度为37℃,时间为30-60min,优选在震荡的条件下封闭,例如120rpm。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,复溶抗体偶联的大粒径胶乳微球所用的缓冲液的成分包括:
-50-100mmol/L HEPES或Tris或PBS;优选100mmol/L HEPES;
-1%NaCl;
-防腐剂:0.1%NaN3或Procline300或硫柳汞;优选0.1%Procline300;
-保护剂:1-5%海藻糖和0.1-0.5%甘氨酸;优选2%海藻糖和0.2%甘氨酸;
pH值为7.0-8.0;优选pH值为7.4;和/或,
复溶待测物蛋白复合物偶联的小粒径胶乳微球所用的缓冲液的成分为:
-50-100mmol/L HEPES或Tri或PBS;优选50mmol/L HEPES;
-3%PEG,分子量为6,000-20,000;优选分子量为8,000;
-防腐剂:0.1%NaN3或Procline300或硫柳汞;优选0.1%Procline300;
-保护剂:1%甘油和2%蔗糖;
pH值为6.5-8.5;优选pH值为8.0。
7.一种用于胶乳增强免疫比浊法的试剂组,其特征在于,所述的试剂组包括通过如权利要求1-6中任一项所述的方法制得的包含抗体偶联的大粒径胶乳微球的R1试剂,和,用于制备含待测物蛋白复合物偶联的小粒径胶乳微球的R2试剂的各组分。
8.一种用于胶乳增强免疫比浊法的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包括如权利要求7所述的试剂组;优选还包括校准品;所述的校准品为含有已知浓度的待测物的标准溶液或冻干品,用于建立校准曲线。
9.一种利用胶乳增强免疫比浊法来检测样本的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:(1)根据如权利要求1-6任一项所述的方法制备R1试剂和/或R2试剂;(2)将(1)制备的R1试剂,或如权利要求7所述的试剂组或权利要求8所述的试剂盒中的R1试剂与(1)制备的R2试剂混合,例如按1:1的比例混合,在400-800nm例如546nm波长下测定吸光度,根据校准曲线计算待测样本的浓度。
10.如权利要求8所述的试剂组或权利要求9所述的试剂盒在制备胶乳增强免疫比浊制剂中的应用。
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