CH641571A5 - Procede et reactifs pour la determination de l'hemoglobine glucosylee dans le sang. - Google Patents

Procede et reactifs pour la determination de l'hemoglobine glucosylee dans le sang. Download PDF

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CH641571A5
CH641571A5 CH1142879A CH1142879A CH641571A5 CH 641571 A5 CH641571 A5 CH 641571A5 CH 1142879 A CH1142879 A CH 1142879A CH 1142879 A CH1142879 A CH 1142879A CH 641571 A5 CH641571 A5 CH 641571A5
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Stephen D Stroupe
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Description

L'invention a pour objet un procédé pour déterminer l'hémoglo-35 bine glucosylée dans des échantillons de sang, qui consiste à libérer les hémoglobines des érythrocytes par des moyens chimiques ou physiques et à faire réagir l'hémoglobine non glucosylée avec une substance se fixant sur le site allostérique qui réagit avec le site de fixation allostérique de l'hémoglobine non glucosylée et modifie 40 ainsi la distribution entre les formes allostériques des hémoglobines, et à mesurer la variation. De manière inattendue, l'invention fournit des méthodes et des réactifs pour la détermination clinique de l'hémoglobine glucosylée dans des échantillons de sang.
On connaît une grande variété de composés comme substances 45 efficaces pour la fixation sur le site à effet allostérique. Ceux-ci comprennent les organophosphates, sulfates, acides carboxyliques représentés par l'hexaphosphate d'inositol, «J. Biol. Chem.», 246, p. 7168 (1971); le 2,3-diphosphoglycérate, «Nature», 234, p. 174 (1971); Tadénosinetriphosphate, «Biochem. Biophys. Res. Comm.», 26, p. 50 162 (1967); le phosphate de pyridoxal, «Fed. Proc. Fed. Amer. Soc., Expl. Biol.» 28, p. 604 (1969); Thexasulfate d'inositol, «Bio-chemistry», 15, p. 3396 (1976); le pentaphosphate d'inositol, «Can. J. Chem.», 47, p. 63 (1969); le 8-hydroxy-l,3,6-pyrènetrisulfonate, «J. Biol. Chem.», 246, p. 5832 (1971); l'o-iodobenzoate de sodium, 55 «The Journal of Pharmacology and Expérimental Therapeutics», 203, p. 72 (1977). L'homme de l'art spécialisé dans les techniques de l'hémoglobine reconnaîtra une variété de substances à fixation sur le site allostérique comme équivalentes pour la mise en œuvre de l'invention. L'hexaphosphate d'inositol est une substance préférée à 60 fixation sur le site allostérique.
Il est généralement souhaitable de lyser les érythrocytes pour libérer les hémoglobines. Les détergents courants cationiques (par exemple bromure de cétyltriméthylammonium), anioniques (par exemple dodécylsulfate de sodium et désoxycholate de sodium) et 65 neutres (par exemple saponine et octylphénoxypolyéthylèneglycol) sont utiles pour lyser les érythrocytes. Les détergents naturels dans la gamme de concentration d'environ 0,025 à 0,5% en volume sont préférés. L'éclatement mécanique, par exemple par traitement aux
3
641 571
ultrasons et lyse hypotonique, sont également des moyens efficaces pour libérer les hémoglobines des érythrocytes.
La fixation de ligands sur le fer de Thème déplace généralement l'équilibre des isomères allostériques de l'hémoglobine vers la forme relâchée (R). Ainsi, lorsque la fraction se fixant sur Thème de Thé- s moglobine dans l'échantillon d'essai est coordonnée avec un ligand se fixant sur Thème, on observe de plus forts déplacements dans les populations d'équilibre des formes allostériques de l'hémoglobine.
Cette augmentation de déplacement de l'équilibre augmente la précision de la détermination de l'hémoglobine glucosylée. Cette coordi- io nation du ligand se fixant sur Thème pour déplacer l'équilibre des isomères allostériques peut s'appliquer lorsque le fer est sous la forme Fe+2 ou Fe+3 (méthémoglobine).
L'homme de l'art familiarisé avec les techniques de l'hémoglobine reconnaîtra une grande variété de ligands se fixant sur Thème 15 qui se fixe au fer de l'hémoglobine ou de la méthémoglobine.
Par exemple, les isocyanures, tels que les isocyanures d'alkyle en C,-C6 ou de phényle, sont des ligands particulièrement souhaitables à fixer sur Thème de l'hémoglobine à l'état Fe+2. D'autres ligands convenables sont 02 et NO. 20
On préfère généralement avoir un seul ligand fixé sur le fer,
puisque cela entraîne des mesures plus simples du déplacement des formes allostériques. Par exemple, Toxyhémoglobine (glucosylée et non glucosylée) est de préférence désoxygénée par réaction avec le 25 dithionite de sodium ou d'autres agents réducteurs bien connus en désoxyhémoglobine. On fait réagir la désoxyhémoglobine avec un isocyanure d'alkyle tel que Tisocyanure de n-butyle et il en résulte une réaction avec un ligand se fixant sur le site allostérique donnant un déplacement plus définitif de l'équilibre des formes allostériques permettant la détermination de l'hémoglobine glucosylée.
L'hémoglobine est oxydée en méthémoglobine par des techniques connues, voir Antonini et Brunoni, «Hemoglobin and Myoglobin in Their Reactions With Ligands», North Holland Publishing Co., Amsterdam (1971). Ainsi, le ferricyanure de potassium, le 3J nitrite de sodium, l'aniline et la phénylhydrazine sont des réactifs convenables pour oxyder l'hémoglobine en méthémoglobine. L'auto-oxydation en présence de colorants, tels que le bleu de méthylène, oxyde également l'hémoglobine en méthémoglobine.
La méthémoglobine non glucosylée est réactive vis-à-vis des 40 substances se fixant sur le site allostérique décrites pour l'hémoglobine non glucosylée.
L'homme de l'art reconnaîtra une grande variété de ligands se fixant sur Thème qui se fixe à la méthémoglobine. Ces ligands comprennent les cyanates, les thiocyanates, le N-hydroxyacétamide, 45 Timidazole, et leurs dérivés [voir Perutz et coll., «Biochemistry», 17, pp. 3640-3652 (1978)].
D'autres ligands courants sont les fluorures, les azides, les nitri-tes, les cyanures, l'eau, l'ammoniaque, les acétates et les formiates.
L'imidazole à environ 0,1 M est un ligand préféré à utiliser avec so la méthémoglobine.
Dans un mode de mise en œuvre préféré, on ajoute 1 ml d'un réactif 0,1 M imidazole, 0,2 ■ 10_3M ferricyanure de potassium, K3Fe(CN)6, et 0,05% en volume de Triton X-100 (octylphénoxypo-lyéthylèneglycol) dans un tampon pH 6,8 à 10-20 jj.1 de sang complet 55 et on incube le mélange pendant 10 min.
Le ferricyanure de potassium oxyde l'hémoglobine en méthémoglobine; le Triton X-100 est un détergent neutre qui lyse les cellules en libérant les hémoglobines, et Timidazole est coordonné avec le fer en déplaçant l'équilibre des isomères allostériques vers la forme relâchée (R).
Le spectre d'absorption de ce mélange est enregistré à 560 et 635 nm. On ajoute ensuite 2 |il d'une solution d'inositolhexaphos-phate 0,1 M à pH 6,8. Ce dernier réactif réagit sur le site de fixation allostérique de l'hémoglobine non glucoxylée et déplace l'équilibre des isomères allostériques vers la forme cible (T). Le spectre d'absorption à 560 et 635 nm est mesuré à nouveau. La concentration de l'hémoglobine glucosylée se révèle par une diminution de l'absorption à 560 nm et une augmentation de l'absorption à 635 nm.
L'invention concerne également des nécessaires d'essai pour déterminer l'hémoglobine glucosylée dans des échantillons de sang. Le nécessaire comprend, séparément ou en combinaison, un agent de lyse des érythrocytes, un agent oxydant pour oxyder l'hémoglobine en méthémoglobine, un ligand se fixant sur Thème et une substance se fixant sur le site allostérique. Le nécessaire contient généralement des substances témoins ou étalons. Les réactifs peuvent être séparés, combinés en deux réactifs, comme indiqué dans l'exemple 1 ci-après, ou un réactif unique, comme illustré à l'exemple 2. L'homme de l'art familiarisé avec les techniques d'analyse reconnaîtra que ces réactifs peuvent être ajoutés individuellement ou en combinaison, successivement ou simultanément. Un nécessaire d'essai préféré consiste en un réactif 0,1 M imidazole, 0,2- 10_3M ferricyanure de potassium à 0,05% en volume de Triton X-100 et à pH 6,8 et un autre réactif d'inositolhexaphosphate 0,1 M à pH 6,8. Ce nécessaire contient généralement des étalons contenant entre 0 et 100% d'hémoglobine glucosylée, ainsi que des témoins ayant une quantité connue d'hémoglobine glucosylée; les témoins étant dans la gamme normale et certains dans la gamme anormale.
L'invention concerne en outre des réactifs comprenant deux ou plusieurs des substances suivantes: a) un agent de lyse des érythrocytes, b) un agent oxydant pour oxyder l'hémoglobine en méthémoglobine, c) un ligand se fixant sur Thème, d) une substance se fixant sur le site allostérique, dans l'eau ou un tampon aqueux comme diluant, à un pH compris entre environ 6 à 8, de préférence d'environ 6,8. Les combinaisons a+b, a+b+ceta+b+c+d dans un diluant sont des réactifs préférés.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée.
Exemple 1:
Réactif A: 0,1M imidazole, 0,2- 10~3M K3Fe(CN)6,0,05% en volume de Triton X-100 (détergent du type octylphénoxypolyéthylè-neglycol), dans l'eau, à pH 6,8.
Réactif B: inositolhexaphosphate 0,1M (IHP), dans l'eau, à pH 6,8.
A 1,0 ml de réactif A à 25" C, on ajoute 10-20 (il de sang total, on incube pendant 10 min pour permettre la lyse des cellules et l'oxydation de l'hémoglobine en méthémoglobine. On enregistre le spectre visible, à 450-700 nm, en suivant en particulier l'absorption à 560 et 635 nm. On ajoute ensuite 2 jj.1 de réactif B au mélange de réaction. On enregistre un autre spectre comme précédemment.
Les étalons sont préparés à partir de sang total par addition d'hémoglobine glucosylée.
Résultats Courbe d'étalonnage
Hb glucosylée (%)
Pas de IHP
+ IHP
Différence normalisée AA A-ihp
A.560 nm
^635 nm
A560 nm
A635 nm
0
0,664
0,089
0,592
0,123
0,184
5
0,654
0,086
0,588
0,120
0,176
10
0,657
0,089
0,593
0,121
0,169
641 571
Résultats Courbe d'étalonnage
Hb glucosylée (%)
Pas de IHP
+IHP
Différence normalisée AA A-ihp
^560 nm
A«5 nm
A560 nm
A635 nm
15
0,658
0,090
0,596
0,118
0,158
20
0,663
0,095
0,609
0,123
0,144
25
0,651
0,091
0,600
0,117
0,138
50
0,645
0,098
0,611
0,113
0,090
100
0,717
0,123
0,715
0,128
0,012
Calcul: A = A560nm — A635nm Différence normalisée: ±IHP =
A A A-™? - A+ihp
A-ihp
A-ihp
Résultats Courbe d'étalonnage
Pas de IHP
+IHP
AA
^560 nm
A635 nm
^560 nm
^635 nm
A-ihp
Sang total inconnu
0,705
0,098
0,637
0,135
0,173 =>8% Hb glucosylée
Contrôle par la méthode sur colonne (commercialisé par Helena et Isolab)
Helena => 11,2% Isolab => 7,8%
30
Exemple 2:
On utilise l'addition d'un réactif unique en tirant avantage de points isosbestiques pour l'effet IHP pour normaliser la concentration d'hémoglobine.
Réactif C: A 1 volume de réactif B on ajoute 500 volumes de réactif A de l'exemple 1.
A 1,0 ml de réactif C, on ajoute 10 à 20 (il de de sang total. On fait incuber pendant 10 min pour permettre la lyse, l'oxydation d'hémoglobine en méthémoglobine et la réaction de la méthémoglobine avec Timidazole et l'IHP. On enregistre le spectre visible de 450 à 700 nm, en particulier à 476, 560, 635 et 700 nm.
Les longueurs d'onde 476 et 700 nm sont les longueurs d'onde isosbestiques pour l'effet IHP:
A560 — A63S
Hb glucosylée (%)
A470
A560
A635
A700
A A normalisée
0
0,608
0,592
0,123
0,016
0,792
5
0,598
0,588
0,120
0,018
0,807
10
0,602
0,593
0,121
0,020
0,811
15
0,598
0,596
0,118
0,019
0,826
20
0,613
0,609
0,123
0,024
0,825
25
0,603
0,600
0,117
0,022
0,831
50
0,598
0,611
0,113
0,026
0,871
100
0,685
0,715
0,128
0,044
0,916
Sang total
0,653
0,637
0,135
0,030
0,806
inconnu
5%
calcul : A A normalisée =
a476 _ a100
Exemple 3:
Réactif A: tampon bis-tris 50- 10~3M [bis-(2-hydroxyéthyl)-35 iminotris(hydroxyméthyl)méthane], 0,05% en volume de Triton X-100, isocyanure de n-butyle 1 • 10_3M, et 2 mg/ml de dithionite de sodium dans l'eau, à pH 6,8.
Réactif B: inositolhexaphosphate (IHP) 2,5-10_3M dans l'eau, à pH 6,8.
40 On mélange un échantillon purifié d'hémoglobine A avec diverses quantités d'hémoglobine glucosylée purifiée pour donner des échantillons d'hémoglobine contenant des quantités connues d'hémoglobine glucosylée.
On place 100 jil de divers échantillons d'hémoglobine dans une 45 cuvette et on ajoute 1,0 ml de réactif A. On lit l'absorption à 530 et 585 nm après une incubation d'environ 2 min.
Après les lectures initiales à 530 et 585 nm, on ajoute 10 ni de ■réactif B et, après incubation pendant environ 1 min, on lit à nouveau l'absorption à 530 et 585 nm.
Résultats
Hb glucosylée (%)
Pas de IHP
+IHP
Asso _ A585 + IHP
A530
A585
A530
A585
A530 - AS8S - IHP
0
0,529
0,153
0,369
0,261
0,287
5
0,511
0,159
0,363
0,261
0,290
10
0,489
0,174
0,368
0,260
0,343
15
0,478
0,177
0,362
0,258
0,346
20
0,487
0,191
0,377
0,268
0,368
25
0,460
0,191
0,361
0,258
0,383
On ajoute du réactif A contenant en outre 0,05% de détergent (Triton X-100) à 10-20 ni de sang total et on effectue l'analyse comme ci-dessus pour déterminer l'hémoglobine glucosylée inconnue.
Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention.
r

Claims (12)

  1. 641 571
    2
    REVENDICATIONS
    1. Procédé pour déterminer l'hémoglobine glucosylée dans des échantillons de sang, caractérisé en ce qu'on libère l'hémoglobine glucosylée et l'hémoglobine non glucosylée des érythrocytes par des moyens chimiques ou physiques, on traite le mélange par une substance capable de se fixer sur un site effecteur allostérique, de sorte que ladite substance réagit avec le site effecteur allostérique de l'hémoglobine non glucosylée et modifie ainsi la distribution entre les formes allostériques des hémoglobines, et on mesure la variation intervenue.
  2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le reste hème de l'hémoglobine est coordonné avec un ligand se fixant sur Thème.
  3. 3. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce que les hémoglobines sont oxydées en méthémoglobine.
  4. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échantillon de sang est lysé avec un détergent pour libérer les hémoglobines des érythrocytes.
  5. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la variation de distribution des formes allostériques de l'hémoglobine est mesurée par spectroscopie d'absorption dans la gamme de 450-700 nm.
  6. 6. Nécessaire d'essai pour la mise en œuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend des récipients pour contenir séparément ou en combinaison un agent de lyse des érythrocytes, un agent oxydant pour oxyder l'hémoglobine en méthémoglobine, un ligand se fixant sur Thème et une substance se fixant sur le site allostérique de l'hémoglobine non glucosylée.
  7. 7. Nécessaire d'essai selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il contient en outre des étalons ou témoins d'hémoglobine glucosylée.
  8. 8. Nécessaire d'essai selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il contient séparément ou en combinaison un détergent comme agent de lyse des érythrocytes, du ferricyanure de potassium comme agent oxydant, de l'imidazole comme ligand se fixant sur l'hème et de l'hexaphosphate d'inositol comme substance se fixant sur le site allostérique.
  9. 9. Réactif pour la mise en œuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient au moins deux des composants suivants: a) un agent de lyse des érythrocytes, b) un agent oxydant pour oxyder l'hémoglobine en méthémoglobine, c) un ligand se fixant sur Thème, d) une substance se fixant sur le site allostérique, dans un diluant.
  10. 10. Réactif selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il consiste en la combinaison a+b.
  11. 11. Réactif selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il consiste en la combinaison a+b+c.
  12. 12. Réactif selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il consiste en la combinaison a+b+c+d.
    L'hémoglobine existe sous deux formes allostériques, la forme T (ou tendue) et la forme R (ou relâchée). Ces formes ont des propriétés chimiques et physiques différentes et les quantités relatives d'hémoglobine R et T peuvent être déterminées par des techniques reconnues, telles que spectroscopie dans l'ultraviolet, l'infrarouge ou le visible, par résonance magnétique nucléaire et par résonance de spin électronique. Par exemple, Perutz et coll., «Biochem.», N° 17, p. 3641 (1978) décrivent les spectres d'absorption de dérivés de l'hémoglobine, c'est-à-dire la transition R-»T, en fonction de la liaison avec un ligand et avec l'hexaphosphate d'inositol. Le dichroïsme circulaire et la réactivité chimique font partie des autres techniques pour distinguer les formes R et T de l'hémoglobine. Les quantités relatives des formes R et T peuvent être déterminées à la fois par des techniques de point final et des techniques cinétiques.
    On sait que des teneurs élevées en hémoglobine glucosylée sont associées au diabète sucré. L'hémoglobine glucosylée est présente chez les non-diabétiques à une teneur d'environ 5% de l'hémoglobine totale, tandis que les diabétiques présentent 2 à 4 fois cette 5 teneur («Science», 200, 7 avril 1978). La teneur en hémoglobine glucosylée donne une indication de la concentration moyenne de glucose sanguin d'un patient pendant une longue durée. Cet indice n'est pas affecté par des fluctuations à court terme du sucre sanguin (heure par heure) et donne donc un reflet relativement précis de io l'état du contrôle du glucose sanguin chez les diabétiques.
    L'hémoglobine glucosylée est couramment désignée par HbA ou hémoglobine rapide parce qu'elle migre plus rapidement sur une colonne de Chromatographie et, bien entendu, elle est généralement mesurée par Chromatographie ou électrophorèse.
    is II a été découvert que le pourcentage d'hémoglobine glucosylée dans le sang est mesuré en suivant le déplacement des populations à l'équilibre des formes allostériques R et T de l'hémoglobine lorsque Ton fait réagir l'hémoglobine non glucosylée avec une substance se fixant sur un site allostérique. Cette réaction provoque un dêplaee-20 ment de la forme allostérique R vers la forme T dans la fraction non glucosylée de l'hémoglobine. L'hémoglobine glucosylée présente dans l'échantillon de sang ne contribue pas au déplacement de l'équilibre des formes allostériques, puisque la glucosylation bloque les sites de fixation allostérique. Donc, plus le pourcentage d'hémo-25 globine glucosylée dans l'échantillon de sang est élevé, plus le déplacement est faible entre les formes allostériques par réaction des hémoglobines avec une substance se fixant sur les sites allostériques. L'invention tire avantage de la réactivité du site à fixation allostérique qui est accessible dans l'hémoglobine non glucosylée et du dé-30 placement résultant de l'équilibre des formes allostériques du mélange d'hémoglobine glucosylée et non glucosylée qui en résulte lorsque Ton fait réagir une substance se fixant sur le site allostérique avec la fraction d'hémoglobine non glucosylée.
CH1142879A 1978-12-26 1979-12-21 Procede et reactifs pour la determination de l'hemoglobine glucosylee dans le sang. CH641571A5 (fr)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
US05/973,368 US4200435A (en) 1978-12-26 1978-12-26 Determination of glycosylated hemoglobin in blood

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Publication Number Publication Date
CH641571A5 true CH641571A5 (fr) 1984-02-29

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Application Number Title Priority Date Filing Date
CH1142879A CH641571A5 (fr) 1978-12-26 1979-12-21 Procede et reactifs pour la determination de l'hemoglobine glucosylee dans le sang.

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