CN111426845A

CN111426845A - 一种血清载脂蛋白b测定试剂盒及其制备方法和应用

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Publication number: CN111426845A
Application number: CN202010264565.6A
Authority: CN
Inventors: 刘安娜
Original assignee: China Kemeo Shandong Medical Laboratory Co ltd; Shandong Zhongtuo Medical Laboratory Co ltd; Zhongtuo Biotechnology Co ltd
Current assignee: China Kemeo Shandong Medical Laboratory Co ltd; Shandong Zhongtuo Medical Laboratory Co ltd; Zhongtuo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-04-07
Filing date: 2020-04-07
Publication date: 2020-07-17
Anticipated expiration: 2040-04-07
Also published as: CN111426845B

Abstract

本发明提供一种载脂蛋白B（ApoB）测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；试剂R1中含有以下成分：4‑羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、NaCl、盐酸胍、癸基硫酸钠、四甲基脲、聚乙二醇6000、表面活性剂、防腐剂。试剂R2：4‑羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、羊抗人ApoB抗体包被胶乳颗粒、表面活性剂、稳定剂、防腐剂。本发明同时提供了该试剂盒的制备方法和应用，该试剂盒多种成分互相协同有助于脂蛋白中抗原位点的暴露，促进抗原抗体反应，是一种稳定性强，灵敏度高，重复性好，成本低的液体试剂盒。

Description

一种血清载脂蛋白B测定试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生化试剂测定技术领域，特别涉及一种载脂蛋白B测定试剂盒，还涉及所述载脂蛋白B测定试剂盒制备方法和应用。

背景技术

载脂蛋白是血浆脂蛋白中的蛋白质部分，能够结合和运输血脂到机体各组织进行代谢及利用的蛋白质。大量研究发现载脂蛋白基因发生突变，形成不同等位基因型多态性，并进一步形成不同表型的载脂蛋白，可影响血脂代谢和利用，从而影响高脂血症、动脉粥样硬化、心脑血管疾病等的发生和发展。

载脂蛋白B(apolipoprotein B,ApoB)存在于低密度脂蛋白的表面，载脂蛋白B大约有 90％是分不布在低密度脂蛋白中，所以血清载脂蛋白B，主要代表低密度脂蛋白水平。细胞识别和摄取低密度主要通过识别载脂蛋白B实现，所以载脂蛋白B增多时，即使低密度水平正常，也可能使冠心病发病率增高，通过检测载脂蛋白B，可以预防和警惕冠心病，周围动脉粥样硬化等心血管疾病的发生。载脂蛋白B增加常见于高脂蛋白血症、糖尿病、动脉粥样硬化、心肌梗塞的疾病。载脂蛋白B减少常见于心肌局部缺血和肝功不全等。

目前检测ApoB的方法有法有胶乳免疫比浊法、双抗夹心免疫化学发光法(ILMA)。双抗夹心免疫化学发光法(ILMA)，准确性和灵敏度高，但是仪器设备昂贵，试剂保存不方便，价格高。胶乳免疫比浊法法具有特异性高，操作简单快捷、准确安全、可自动化分析、成本较低的优点，但现有技术中国产试剂盒存在分析灵敏度低，稳定性差，抗体抗原结合不完全等缺点，本发明针对现有ApoB试剂盒的缺点进行改进以满足临床检测以及化学分析的要求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种载脂蛋白B测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒是一种稳定性强，灵敏度高，重复性好，成本低的液体试剂盒。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种载脂蛋白B测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；

试剂R1中含有以下成分：

试剂R2中含有以下成分：

其中所述百分比为体积比。

优选地，所述试剂R1的pH为6.5-7.5。

优选地，所述试剂R2的pH为6.5-7.0。

优选地，所述试剂R1和R2试剂中的表面活性剂选自吐温-20、曲拉通x-100和聚氧乙烯烷基醚EMULGEN 709中的一种或多种。更优选地，表面活性剂为聚氧乙烯烷基醚EMULGEN 709。

优选地，所述试剂R2试剂中的稳定剂为牛血清白蛋白、明胶、海藻糖和丙三醇中的一种或多种。更优选地，稳定剂由牛血清白蛋白、海藻糖和丙三醇组成。

优选地，所述试剂R1和R2试剂中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT和苯甲酸钠中的一种或多种。

优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为1～5:1。更优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为3:1。

上述所述的载脂蛋白B测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：羊抗人载脂蛋白B抗体包被胶乳颗粒的制备方法为：取适量表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒(粒径100nm)，加入到10ml缓冲液中，使胶乳颗粒终浓度为1.0％；然后加入适量羊抗人载脂蛋白B抗体、 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，室温下混合搅拌3小时左右，加入1ml 10g/L的BSA溶液，12000rpm离心40分钟，去除上清，所得沉淀即为羊抗人载脂蛋白B抗体包被胶乳颗粒。再按照比例加入其它物质溶解，制成载脂蛋白B测定试剂盒。

本发明还公开了载脂蛋白B测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中载脂蛋白B的浓度。

本发明试剂盒采用胶乳免疫比浊法，其反应原理为样本中的ApoB可与吸附在胶乳颗粒上的抗ApoB抗体产生抗原抗体的凝集反应，形成免疫复合物，通过测定该免疫复合物吸光度的变化，可算出样本中ApoB的含量。反应具有特异性，使用全自动生化仪进行检测，操作简单、自动化程度高，可减少人为误差，适合大多数临床实验室应用。

有益效果

1)本发明稳定的载脂蛋白B测定试剂盒为液体双试剂，无需复溶配制，开瓶可以直接使用。

2)通过在试剂R2中加入牛血清白蛋白、海藻糖和丙三醇组成复合稳定剂，各组分协同作用，有效地提高了试剂中抗体胶乳颗粒的稳定性，使试剂稳定性能优异，有利于该试剂在市场中进一步的推广。

3)通过加入盐酸胍、癸基硫酸钠、四甲基脲和新型表面活性剂聚氧乙烯烷基醚EMULGEN 709，协同作用使包被抗原位点的脂蛋白变性，有助于抗原位点的暴露，使之能充分地与特异性抗体反应，还可以减轻血清空白的浊度，去除高血脂样本的干扰，显著提高试剂的准确度和抗干扰能力。

4)通过加入聚乙二醇6000，可有效地促进抗原抗体的反应作用，提高试剂的性能。

5)该试剂的准确度、重复性、分析灵敏度、线性范围、稳定性等性能指标卓越，价格便宜，使用方便，有利于该试剂在市场中进一步推广。

附图说明

图1为实施例1线性的相关性曲线；

图2为实施例1和对比例1、2、3、4、5、6、7提供的载脂蛋白B测定试剂进行稳定性试验的浓度变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

本实施例所述试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的迈瑞800全自动生化分析仪，利用终点法进行测定，检测主波长为340nm，副波长700nm，操作如下：

加入生理盐水、样本或校准品2μL，再加入225μL的R1试剂，预孵育5min后，读取吸光度A1。再加入75μL的R2试剂，混匀，5min后读取吸光度A2，

计算ΔA＝(A2-A1)。

载脂蛋白B含量(g/L)＝(ΔA样本÷ΔA校准品)×校准品浓度。

样本要求：

1.不溶血血清。

2.样本稳定性：标本2～8℃保存可稳定3天，-20℃保存可稳定2周。

实施例1

一种常规的载脂蛋白B测定试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2。

试剂R1中含有以下成分：

试剂R1的pH值为7.0。

试剂R2中含有以下成分：

试剂R2的pH值为6.8。

其中所述百分比为体积比。

对比例1

市售的进口Sigma载脂蛋白B测定试剂盒。

对比例2

本对比例采用市售的国家食品药品监督管理局认可的国产的载脂蛋白B检测试剂盒。

对比例3

与实施例1中载脂蛋白B测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有盐酸胍、癸基硫酸钠、四甲基脲，其它与实施例1相同。

对比例4

与实施例1中载脂蛋白B测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有EMULGEN 709，其它与实施例1相同。

对比例5

与实施例1中载脂蛋白A1测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有癸基硫酸钠、四甲基脲，其它与实施例1相同。

对比例6

试剂R1中含有以下成分：

试剂R1的pH值为7.0。

试剂R2中含有以下成分：

试剂R2的pH值为6.8。

其中所述百分比为体积比。

对比例7

试剂R1中含有以下成分：

试剂R1的pH值为7.0。

试剂R2中含有以下成分：

试剂R2的pH值为6.8。

其中所述百分比为体积比。

性能验证

试验一

实施例1、对比例1和对比例2，同时检测了40个临床血清样本，对两组检测结果进行相对偏差和相关性分析，计算相关系数r；以对比例1检测结果作为对照值，分别计算40对数据的相对偏差，相对偏差不超过±10％。检测结果如表1，表2所示。

表1相关性对比实验结果

表2对比例1分别与实施例1和对比例2的相关系数

由表1，表2可以看出，实施例1和对比例1的试剂盒血清测试偏差最大值为-5.13％，两种试剂的相关系数为0.9927，实施例1和对比例1的检测结果非常接近，因此本发明提供的实施例1检测试剂与的进口检测试剂相关性良好，完全可以替代进口试剂；对比例2和对比例1检验结果偏差较大，相对偏差最大值为8.20％，相关系数为0.9754，说明本发明试剂盒准确度优于对比例2。

试验二

精密度试验：实施例1和对比例1、对比例2，对临床样品进行20次检测，计算20次检测结果平均值、标准差和变异系数。结果见表3。

表3精密度检测数据表

由表3可以看出，实施例1、对比例1和对比例2的检测数值标准偏差小，变异系数小，重复性较好，均符合行标要求。实施例1的精密度略好于对比例1和对比例2。实施例1精密度完全可以替代进口试剂且优于国内试剂。

试验三

线性实验：取载脂蛋白B高值样本为2.00g/L，并进行稀释，配制6个不同浓度的样本，依次为2.50g/L、2.00g/L、1.60g/L、1.20g/L、0.80g/L、0.40g/L浓度的样本，用实施例1试剂进行检测，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值。检测结果见表4。

表4线性相关验证实验检测数据表

理论浓度(g/L)	实施例1(g/L)
		0.40	0.41
0.80	0.83
		1.20	1.25
1.60	1.57
		2.00	2.03
2.50	2.49
		相关系数R	0.9987

由表4可以看出，本发明实施例1随稀释浓度呈线性变化，线性相关系数达到0.9987，大于0.990，说明实施例1线性范围较好，能够符合临床病例样本的检测要求。

试验四

低值样本灵敏度检测试验：取具有良好溯源性的质控品稀释出0.50g/L低浓度样本，用实施例1和对比例1、2、6、7试剂进行检测，分别检测5次，求平均值的相对偏差。结果见表5。

表5 0.50g/L样品检测数据表

由表5知，在检测低值样本是，实施例1和对比例7检测结果较好，对比例2偏差较大，当试剂中添加聚乙二醇6000后，试剂灵敏度较好，测试值准确。实施例1和对比例7检测结果优于对比例1。本发明通过添加适量聚乙二醇6000和适当的反应体系，提高了试剂的分析灵敏度，检测低值样本时，检测值稳定准确，对于临床检验有重要意义。

试验五

稳定性实验：对实施例1和对比例1、2、3、4、5、6、7提供的载脂蛋白B测定试剂进行稳定性试验，试验方案为：对实施例1和对比例1、2、3、4、5、6、7提供的试剂，每一例平行包含12组，一起放入2-8℃冰箱中存储，每月检测靶值为1.16±0.20g/L的质控品，每组测试5次，求平均值，并监测质控品测定值的变化，结果见表6。

表6试剂热稳定性验证数据

由表6和图2可以看出，与对比例7基本一致，本发明提供的实施例1试剂在2-8℃条件下12月内基本无显著变化，优于对比例1试剂，稳定性较好；而对比例2试剂在12月内变化明显。说明本发明缓冲液和新型表明活性剂、多种保护剂的加入共同作用，显著提高载脂蛋白B测定试剂盒的稳定性。

试验六

干扰实验：取具有溯源性的质控物质，高值质控物(靶值1.16±0.20g/L)，分别加入表格中甘油的含量。然后分别用实施例1试剂，与对比例1试剂、对比例2试剂、对比例3 试剂、对比例4试剂、对比例5试剂同时对样本中载脂蛋白B的含量进行检测，分别测量5 次求平均值，各组的测定结果见表7。

表7试剂抗干扰验证结果

由表7可以看出，当甘油浓度为1.0ml/L和2.0ml/L时，实施例1试剂未受到明显干扰，对比例1试剂、对比例2试剂受到显著干扰。对比例2试剂当甘油浓度为2.0ml/L，超出质控靶值范围。单种方式抗干扰的对比例3试剂、对比例4试剂、对比例5试剂也受到不同程度的干扰，但是未超出质控靶值范围。这说明仅加入EMULGEN 709的对比例3试剂，加入盐酸胍、癸基硫酸钠、四甲基脲的对比例4试剂以及加入盐酸胍和EMULGEN 709的对比例5试剂抗干扰能力都弱于实施例1。同时证明通过加入盐酸胍、癸基硫酸钠、四甲基脲和EMULGEN 709成分后，多种成分协同作用使实施例1试剂的抗干扰性能显著提高，所以实施例1抗干扰能力更强，优于对比例1试剂，满足临床要求。

综上所述，该试剂盒采用盐酸胍、癸基硫酸钠、四甲基脲，新型表面活性剂，不同的保护剂和悬浮剂，是一种抗干扰性、稳定性强，灵敏度高，重复性好，成本低的液体试剂盒。为本发明试剂盒提供了良好的发展空间，同时增强了本发明试剂盒在市场上竞争力。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims

1.一种载脂蛋白B测定试剂盒，其特征在于，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；

试剂R1中含有以下成分：

缓冲液 20-80mmol/L；

NaCl 9g/L；

聚乙二醇6000 10g/L；

盐酸胍 0.3mmol/L；

癸基硫酸钠 0.3mmol/L；

四甲基脲 0.3mmol/L；

表面活性剂 0.1%-2%；

防腐剂 0.5-1 g/L；

试剂R2中含有以下成分：

缓冲液 20-80mmol/L；

羊抗人ApoB抗体包被胶乳颗粒 20-60mg/L；

聚乙二醇6000 10g/L；

稳定剂 10-40g/L；

表面活性剂 0.1%-2%；

防腐剂 0.5-1g/L；

其中所述百分比为体积比。

2.根据权利要求1所述的载脂蛋白B测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2的缓冲液体系为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、N-氨基甲酰甲基乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中的一种。

3.根据权利要求1所述的载脂蛋白B测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的pH为6.5-7.5，试剂R2的pH为6.5-7.0。

4.根据权利要求1所述的载脂蛋白B测定试剂盒，其特征在于，所述试剂 R1和R2试剂中的表面活性剂选自吐温-20、曲拉通x-100和聚氧乙烯烷基醚EMULGEN 709中的一种或两种。

5.根据权利要求1所述的载脂蛋白B测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2试剂中的稳定剂为牛血清白蛋白、明胶、海藻糖和丙三醇中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的载脂蛋白B测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和R2试剂中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT和苯甲酸钠中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1与试剂R2的体积比为1～5:1，优选地，体积比为3:1。

8.一种权利要求1-7之一所述的载脂蛋白B测定试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：先制成羊抗人载脂蛋白B抗体包被胶乳颗粒的制备方法：取粒径100nm表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，加入到10ml缓冲液中，使胶乳颗粒终浓度为1.0% ；然后加入羊抗人载脂蛋白B抗体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基丁二酰亚胺，室温下混合搅拌3小时，加入1ml 10g/L的BSA溶液，12000 rpm离心40分钟，去除上清，所得沉淀即为羊抗人载脂蛋白B抗体包被胶乳颗粒；再按照比例加入其它物质溶解，制成载脂蛋白B测定试剂盒。

9.一种权利要求1-7之一所述的载脂蛋白B测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中载脂蛋白B的浓度。