CN101135687A - 一种用于检测apoA I、apoB的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定血清中的apoA I、apoB的试剂盒。目的是提供的检测试剂盒应具有样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好、抗干扰能力强，基质稳定的特点。提供的技术方案是：一种用于检测apoA I、apoB的试剂盒，其双试剂剂型包括：a.反应剂，主要包括缓冲液、高分子加速剂；b.抗体试剂，主要包括抗apoA I抗血清、抗apoB抗血清和抗血清稀释液；c.液体血清型恒定值校准液，主要包括缓冲液、apoA I抗原、apoB抗原。其单试剂剂型包括：a.抗体液，主要包括抗apoA I抗血清、抗apoB抗血清和反应剂；b.液体血清型恒定值校准液，主要包括缓冲液、apoA I抗原、AapoB抗原。

Description

一种用于检测apoA I、apoB的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种抗体的制备方法以及测定血清成分的试剂盒，特别是抗APOA I、APOB抗体的制备方法及测定血清中的apoA I、apoB的试剂盒，可广泛应用在医学及生物化学技术领域。

背景技术

载脂蛋白A I(apo A I)是apoA族最多的一种组份，apoA I为单一多肽链，由243个氨基酸残基组成，分子量为28300D，是高密度脂蛋白(HDL)的主要载脂蛋白。HDL具有防止动脉粥样硬化的作用，因此，测定血清(浆)中apoA I的含量已成为防止心脑血管疾病的常规检测项目。载脂蛋白B(apoB)是低密度脂蛋白(LDL)的主要蛋白质，而LDL增高是公认的致动脉粥样硬化的危险因子，因此，血清apoB的测定在临床上有着非常重要的作用，联合检测apoA I、apoB对早诊断、早预防、早治疗心脑血管疾病提供了可靠的依据。

已知测定apoA I、apoB的方法有层析法、电泳法、免疫分析法、其中层析法和电泳法操作繁琐，不能进行批量样本分析和直接上全自动生化分析仪等缺点，而免疫分析法中的免疫扩散法、放射免疫分析法、荧光标记免疫分析法、酶标记免疫分析法、化学发光免疫分析法也存在诸多不足之处，如需要特殊的设备，样品需要预处理，不能上全自动生化分析仪进行批量检测分析等。临床上常用的免疫透射比浊法因其样本用量少，可直接在全自动生化分析仪上进行批量样本分析、操作简单受其欢迎，但目前建立的方法及试剂都存在一些缺点和/或不足，主要表现在：一是抗体效价不高，都在1∶16以下，特异性、亲合力、亲和力不好，二是校准血清是以人血清为基质，虽然乙肝表面抗原阴性、HIV检测阴性、丙氨酸氨基转移酶正常的人血清，但这也很难排除没有其他传染病的可能，给操作者带来很大的危险性，而且为冻干品，每批的定值不一，使用前需用水复溶，操作极其不便，而且不同的复溶者复溶后瓶间差异大，复溶后必须冰冻保存，特别是不能反复解冻使用，不但造成试剂浪费，而且质量也得不到保证，测定结果差异大，其稳定性也不好；三是对高脂、黄疸、溶血样本抗干扰能力差。四是采用单点校准液定标，不符合曲线回归方程计算，导致出现高值偏低，低值偏高的现象，所测结果不准确。五是抗血清在短时间内出现沉淀，使上机操作困难，影响检测效果。

另外，检测apoA I、apoB所需的抗apoA I、apoB抗体的制备过程中，抗原的提取方式直接关系到抗体(抗血清)质量的好坏。已知的方法是采用倍比稀释的密度梯度超离心技术收集到apoA I、apoB量极高的HDL和LDL，然后再采用双脱脂法去除脂肪和剩余的杂蛋白，即可得到电泳纯的apoA I和apoB抗原，然后进行免疫。上述方法的缺点是超离心所用的时间较长，而且其脱脂和超离的过程中往往使蛋白发生了变性和改变了蛋白的空间结构，改变了蛋白的免疫原性，从而免疫所得抗血清效价不高。采用双扩散免疫电泳，apoA I效价大于1∶32，apoB效价大于1∶256的机率非常的小。

发明内容

本发明的一个目的是克服上述背景技术的不足，提供一种抗apoA I、apoB抗体制备方法的改进，所述的抗体制备方法在制备过程中应具有无须超速离心处理、制备时间短、抗体的效价高的特点；

本发明的另一个目的是克服上述背景技术的不足，提供一种用于检测apoA I、apoB的试剂盒的改进，所述的检测试剂盒应具有样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好、抗干扰能力强，基质稳定的特点。

为了达到上述目的，本发明人进行了广泛深入的研究，结果通过用特殊的方法提起的apoA

I、apoB抗原经免疫动物后，制得一种与人血清中的apoA I、apoB抗原有高度特异反应性的抗体；并利用该抗体配置成检测试剂，并配以相应的校准液，从而完成了本发明。

本发明提供的技术方案是：

一种制备抗apoA I、apoB抗体的方法，该方法包括apoA I、apoB抗原的提取，动物免疫和抗体纯化，所述的apoA I、apoB抗原的提取步骤是：用脂蛋白沉淀剂与表面活性剂-血清复合物或表面活性剂-血浆复合物混合，使脂蛋白沉淀，沉淀剂、表面活性剂、血清或血浆三者体积配比为1∶2∶1至1∶4∶3；然后弃去上清液，收集沉淀物后洗涤，将洗涤后所得到的沉淀物用脱脂剂脱脂，除去脱脂剂，加入apoA I溶解剂，得apoB，或加入apoB溶解剂，得apoAI，最后将所得apoA I、apoB采用SDS-PAGE电泳凝胶切割，收集含AapoA I、apoB凝胶研碎，提取apoA I、apoB抗原。

所述的动物免疫中，第一次免疫动物时采用的是抗原-表面活性剂复合物，其中抗原用量按50公斤动物体重0.5-5mg，抗原与表面活性剂的体积配比为1∶1至1∶2，且抗原微粒完全被表面活性剂包复。

所述的沉淀剂、表面活性剂、血清或血浆三者体积配比为1∶3∶2；所述的抗原-表面活性剂复合物中，抗原与表面活性剂的体积配比为4∶6。

一种用于检测apoA I、apoB的试剂盒，其双试剂剂型包括：

a、一种使样品中apoA I、apoB抗原位点充分暴露，有利于与抗apoA I、apoB抗体充分结合的反应剂，所述的反应剂包括50-200mmol/L缓冲液、20-80％重量比的高分子加速剂、0.1-5％重量比的防腐剂和0.1-10％重量比的稳定剂，其余为纯化水；

b、抗体试剂，其中分别包括，一种与人血清中的apoA I、apoB抗原有高度特异反应性的抗apoA I抗血清、抗apoB抗血清和抗血清稀释液，抗apoA I抗血清与抗血清稀释液以及抗apoB抗血清与和抗血清稀释液的混合的体积比为1∶1-1∶10；所述的抗血清稀释液包括50-200mmol/L缓冲液、20-80％重量比的高分子加速剂、0.1-5％重量比的防腐剂和0.1-10％重量比的稳定剂，其余为纯化水；

c、一种用来与样品比较，进行结果计算的液体血清型恒定值校准液，包括：20-100mmol/L的缓冲液、0.1-2.5g/LapoA I抗原、0.1-2.5g/LapoB抗原、0.01-2％重量比的抗氧化剂、0.1-5％重量比的防腐剂、0.1-10％重量比的稳定剂、0.1-0.3％重量比的防霉剂，其余是基质；

所述的反应剂包括0.1-10％重量比的表面活性剂，所述的抗体试剂中还包括0.01-5％重量比的抗氧化剂；所述的血清型恒定值校准液中的基质是小牛血清。

一种检测人血清中apoA I、apoB含量的试剂盒，其单试剂剂型包括：

a、抗体液，其中分别包括，一种与人血清中的apoA I、apoB抗原有高度特异反应性的抗apoA I抗血清、抗apoB抗血清和反应剂，抗apoA I抗血清与反应剂以及抗apoB抗血清与反应剂的混合的体积比分别为1∶1-1∶30；所述的反应剂包括50-200mmol/L缓冲液、20-80％重量比的高分子加速剂、0.1-5％重量比的防腐剂和0.1-10％重量比的稳定剂，其余为纯化水；

b、一种用来与样品比较，进行结果计算的液体血清型恒定值校准液，包括：20-100mmol/L的缓冲液、0.1-2.5g/LapoA I抗原、0.1-2.5g/LapoB抗原、0.01-2％重量比的抗氧化剂、0.1-5％重量比的防腐剂、0.1-10％重量比的稳定剂、0.1-0.3％重量比的防霉剂，其余是基质；

所述的抗体液还包括0.1-10％重量比的表面活性剂，以及0.01-5％重量比的抗氧化剂；所述的血清型恒定值校准液中的基质是小牛血清。

所述的反应剂和抗血清稀释液中还可分别包括0.1-0.5％重量比的反应促进剂。

所述的抗体液中还可分别包括重量比为0.1-0.5％的反应促进剂。

所述的液体血清型恒定值校准液中还包括0.01-4％重量比的增效剂。

所述的反应剂和抗血清稀释液中还可分别加入适量的电解质。

由于本发明所提供的制备抗apoA I、apoB抗体的方法，首次提出采用表面活性剂结合沉淀剂直接免疫电泳法提取apoA I和apoB抗原，由于表面活性剂与血清形成复合物，使apoAI和apoB在提取过程中不受沉淀剂或有机溶剂的影响，并且该方法不需超速离心，时间短(从人血清(浆)到apoA I、apoB纯品制备成功，仅需要2个工作日)，避免了因长时间离心破坏抗原的免疫源性和使apoA I、apoB发生脱酰氨基和氧化作用，并改变蛋白质的空间位阻的弊端，从而保证了所得的apoA I、apoB的免疫源性高。通过大量的研究证实：采用本发明所提取的apoA I、apoB抗原(免疫原)所免疫出的抗血清效价，采用双扩散免疫电泳法，apoA I效价大于或等于1∶32，apoB效价大于或等于1∶516。

本发明所提供的试剂盒，它是利用抗原抗体反应，加入反应剂(样品稀释液)，解除样本中抗原周围的电子层和水化层，使抗原位点充分暴露，然后加入apoA I抗体(即抗血清)或apoB抗体(即抗血清)，高特异反应性的apoA I、apoB抗体与样本中相应的apoA I、apoB抗原反应，形成不溶性的抗原-抗体复合物，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的apo A I、apoB含量成正比，在规定波长下测定该不溶性抗原-抗体复合物的吸光度值，与已知恒定的校准液比较，则可计算出样本中apoA I、apoB的含量。此方法及试剂操作简单、样本不用预稀释；所采用的血清型液体恒定值校准液不需每批更改参数、准确度高、重复性好、抗干扰能力强，适用于各种类型的全自动生化分析仪；另外由于用牛血清取代了人血清，使用更加安全方便。

具体实施方式

本发明的有关细节描述如下：

本发明的抗apoA I、apoB是用apoA I、apoB抗原免疫动物而产生的，该抗体具有与人血清中的apoA I、apoB抗原有高度的特异反应性，与其它无关载脂蛋白不发生交叉反应。

对于本发明中用于免疫的动物，可以是成熟健壮的兔子，山羊、绵羊、牛、马等等，这里并无特别限制，条件是只要用apoA I、apoB抗原免疫后能产生具有与apoA I、apoB抗原有高度的特异反应性的抗apoA I、apoB抗体即可。本发明中优选的是绵羊作为免疫对象，最好是同一种直系绵羊。作为用于免疫绵羊的免疫原是用本发明方法中所提出的方法获得。

抗原的提取及抗体(抗血清)制备的优选方法

A.抗原的提取：

本发明提供了一种apoA I、apoB抗原提取的方法，主要是用脂蛋白沉淀剂与表面活性剂-血清复合物或表面活性剂-血浆复合物混合，使脂蛋白沉淀，沉淀剂、表面活性剂、血清或血浆三者比例为1∶2∶1至1∶4∶3(推荐1∶3∶2)；然后弃去上清液，收集沉淀物后洗涤，将洗涤后所得到的沉淀物用脱脂剂脱脂，除去脱脂剂，加入apoA I溶解剂，得apoB，或加入apoB溶解剂，得apoA I，最后将所得apoA I、apoB采用SDS-PAGE电泳凝胶切割，收集含apoA I、apoB凝胶研碎，提取apoA I、apoB抗原。

具体操作步骤为：1、将200ml混合血清与300ml的脂肪族的表面活性剂混匀，使其形成表面活性剂-血清复合物。2、采用已知的肝素锰沉淀剂100ml在搅拌器上慢慢加入到200ml表面活性剂-混合血清或血浆中，使脂蛋白沉淀，收集沉淀物后用生理盐水洗涤。3、脱去脂蛋白中的脂质：用已知的Scanu法进行脱脂，即：将洗涤后的脂蛋白沉淀物加入到预冷的(-15℃)无水乙醇∶无水乙醚(3∶2)的混合液中，不断搅拌，经12小时过夜后，在-10℃至4℃间离心，去上清得沉淀物，再重复脱脂过程一次，3.将上述脱脂后的沉淀物用已知的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺)凝胶电泳，根据apoA I和apoB所在凝胶中的不同位置，分别将两部份凝胶分开，然后将其捣碎，分别使apoAI和apoB析出，最后进行浓缩后真空干燥放-20℃保存。

B、抗体的制备

本发明公开的抗体制备分为两大部份：一是免疫过程；二是抗体的分离。其中：

一、本发明方法只需分4次免疫过程就能完成；第1次：在免疫之前给绵羊腹股沟和腹腔以及背部多处注射少剂量的抗生素，7天后给予注射能降低绵羊免疫能力的物质，如姥鲛烷等3天后，用表面活性剂与apoA I、apoB抗原混合液在绵羊的背部和大腿内两侧采用皮内结合皮下进行多点少剂量注射。apoA I、apoB抗原用量按绵羊的体重而定，一般是50公斤体重抗原用量为0.5-5mg，优选1-2mg。抗原与表面活性剂的体积比为1∶1至1∶2(推荐4∶6)，形成抗原-表面活性剂的复合物，使抗原完全被表面活性剂包复在所述的抗原-表面活性剂复合物中(在振荡器上慢慢振摇得到)，结构不受外境因素影响而发生改变，从而保持完整；另外还能使抗原在体内慢慢地施放，从而达到延长吸收时间的作用。这里的表面活性剂为阴离子表面活性子，作为实例可以是十二烷基硫酸钠(SDS)，浓度为0.01-1％，优选0.1-0.5％的十二烷基硫酸钠。第2次：在第1次免疫后1-8周，优选第3周，用已知方法制得的不完全佐剂(即：取石蜡油6份、羊毛脂4份与5份内含0.1％SDS，不含抗原缓冲液混匀，灭菌即得不完全佐剂)，分别与apoAI、apoB抗原按比例混合，其混合比例为比0.1∶10(V/V)，优选1∶2。将不完全佐剂-抗原的混合物在振荡器上慢慢振摇，促使其成为油包水抗原乳化复合物。将此油包水抗原乳化复合物在绵羊腹部和淋巴节处采用进行5-20点注射，优选10点，其注射剂量为0.05ml-1ml/点，优选0.5ml/点。第3次：在第2次免疫后1-4周，优选第2周，在上述不完全佐剂中加入免疫促进剂，如明矾、杀死的结核分杆菌或卡介苗，即得完全佐剂。然后将其与apoAI、apoB抗原按比例混合，其混合比例为0.1∶10(W/W)，优选1∶2.将不完全佐剂-抗原的混合物在振荡器上慢慢振摇，促使其成为油包水抗原乳化复合物。将此油包水抗原乳化复合物在绵羊腹部和淋巴节处采用进行5-20点注射，优选10点，其注射剂量为0.05ml-1ml/点，优选0.5ml/点。第4次采用与第3次一样的方法对绵羊进行加强一次，间隔7天后，用注射器抽取10ml静脉血测定抗体效价，如apoA I效价大于或等于1∶32，apoB效价大于或等于1∶516，则一次性采取颈动脉放血。

二、抗体分离：将上述颈动脉血放置25-30℃24小时，使红细胞收缩凝固，吸取上清液(即血清)用3000转/分离心30分钟，弃去沉淀物，即得apoA I、apoB抗血清，然后用已知的亲合层析或离子交换层析法对上述apoA I、apoB抗血清进行纯化，从而得到高效价的、高纯度的羊抗人apoA I、apoB抗体(抗血清)。

为保持抗体(抗血清)效价，本发明还加入了0.1-30％重量比稳定剂和0.05-1％重量比防腐剂，作为稳定剂可以是非还原性的糖(如：蔗糖、麦芽糖)、丙三醇或乙二胺四乙酸二钠盐，作为防腐剂可以是叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠等。

本发明提供的检测载脂蛋白apoA I、apoB的试剂盒分为单试剂和双试剂二种。

其中双试剂的试剂盒中包括：

A.反应剂

主要包括50-200mmol/L缓冲液、0.1-10％重量比的表面活性剂、20-80％重量比的高分子加速剂、0.1-5％重量比的防腐剂和0.1-10％重量比的稳定剂，还可酌情加入0.1-0.5％重量比的反应促进剂和适量的电解质。

作为缓冲液可以是磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、PIPES缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液等，本发明优选磷酸盐缓冲液，缓冲液的PH值为5-10，优选7.0-9.0。

作为表面活性剂可以是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂，这里优选非离子表面活性剂，作为实例有：Theist、Tween系列、聚氧乙烯月桂醚系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等，这些表面活性剂可以单独使用，也可以两种或两种以上混合使用，这里不作限制。

作为电解质的实例可以是阴离子或阳离子，本发明优选阳离子中的氯化钠(NaCl)。

作为高分子加速剂的实例可以是聚乙二醇，其分子量在1500-200000中的一种或其混合物，优选聚二醇6000。

作为防腐剂的实例可以是叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠、对羟基苯甲酸酯类、苯酚、广谱抗生素，本发明从环保角度考虑，优选广谱抗菌素。

作为稳定剂的实例可以是乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、牛(或人)血清白蛋白、乙二醇、甘露糖醇、海藻糖等。

作为反应促进剂的实例是溴化己二甲胺。

B.抗体试剂

本发明中的抗apoA I抗体试剂、抗apoB抗体试剂，主要包括经前述方法制备所得的抗apoA I血清、抗apoB血清和抗血清稀释液，抗apoA I血清、抗apoB血清分别用抗血清稀释液按1∶1-1∶10比例稀释，还加入0.01-5％重量比的抗氧化剂。

抗血清稀释液主要包括50-200mmol/L缓冲液、20-80％重量比的高分子加速剂、0.1-5％重量比的防腐剂和0.1-10％重量比的稳定剂，还可酌情加入0.1-0.5％重量比的反应促进剂和适量的电解质。

作为抗氧化剂的实例可以是柳氮磺胺吡啶、丁基羟基茴香醚、硫代二丙酸二月桂酯、二丁基羟基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、磷脂等。

作为抗氧化剂可以先溶解在丙二醇或乙醇中(抗氧化剂与丙二醇或乙醇的重量比＝1∶5)，然后加入到抗apoA I试剂和apoB抗体试剂中。

C.液体血清型恒定值校准液

校准液是决定试剂准确度的重要因素之一。载脂蛋白apoA I、apoB在液体状态下，会自发氧化，使校准液的值在短时间内发生很大的下降，所以必须使用抗氧化剂来减缓或阻止载脂蛋白apoA I、apoB的氧化速度，但是由于时间过长或某些客观的因素，抗氧化剂本身也发生了还原，使其抗氧化效果下降。经研究发现：抗氧化剂被还原的同时，产生了一定量的自由基，为了提高校准液在液体状态下的稳定性，我们在其中加入适量的增效剂，使增效剂与抗氧化剂还原产生的自由基作用，使抗氧化剂得以再生，从而提高了校准液的稳定性。

本发明首次采用抗氧化剂的再生技术来稳定载脂蛋白校准液，使校准液的值在2-8℃一年几乎保持不变。另外，为方便操作，每批测试不用更改参数，本发明采用了“恒定”的校准液定值(恒定：指每个批次的定值都保持不变)，本发明的apoA I定值为：第1点：0.1-0.6g/L，优选0.55g/L；第2点0.7-1.1g/L，优选1.10g/L；第3点1.2-1.7g/L，优选1.6g/L；第4点1.8-2.5g/L，优选2.2g/L。

apoB的定值为：第1点：0.1-0.6g/L，优选0.50g/L；第2点0.7-1.1g/L，优选1.00g/L；第3点1.2-1.7g/L，优选1.5g/L；第4点1.8-2.5g/L，优选2.0g/L。

作为恒定值的校准液主要包括：20-100mmol/L的缓冲液、0.1-2.5g/L apoA I抗原、0.1-2.5g/L apoB抗原、0.01-2％重量比的抗氧化剂、0.1-5％重量比的防腐剂、0.1-10％重量比的稳定剂、0.1-0.3％重量比的防霉剂，还可加入0.01-4％重量比的增效剂和适量小牛血清。

作为缓冲液的实例有PBS、Tris、TAPS、、HEPPS、CHES、CAPS、CAPSO、POPSO、Tricie、甘氨酸、双甘氨肽、二甘氨酸、硼酸盐等缓冲液等。

作为抗氧化剂的实例有：柳氮磺胺吡啶、丁基羟基茴香醚、硫代二丙酸二月桂酯、二丁基羟基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、磷脂等。抗氧化剂可以先溶解在10-100ml丙二醇或乙醇中，然后加入到校准液中。

作为增效剂的实例有柠檬酸、酒石酸、抗坏血酸等。

作为防腐剂的实例有叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠、对羟基苯甲酸酯类、苯酚、广谱抗生素、山梨酸及其盐类等。

作为稳定剂的实例可以是乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、牛(或人)血清白蛋白、丙三醇、单糖、多糖等。

作为防霉剂的实例有丙酸钠、过氧乙酸及其盐类、百里酚等。

其中单试剂的试剂盒中包括：

A.抗体液

主要包括经前述方法制备所得的抗apoA I抗血清、抗apoB抗血清和反应剂，抗apoA I抗血清与抗apoB抗血清分别和反应剂按1∶1-1∶30体积比例稀释，还分别加入重量比为0.01-5％的抗氧化剂。

反应剂主要包括50-200mmol/L缓冲液、0.1-10％重量比的表面活性剂、20-80％重量比的高分子加速剂、0.1-5％重量比的防腐剂和0.1-10％重量比的稳定剂；还可加入0.1-0.5％重量比的反应促进剂和0.1-40％重量比的电解质、

B、校准液

校准液主要包括：20-100mmol/L的缓冲液、0.1-2.5g/L apoA I抗原、0.1-2.5g/L apoB抗原、0.01-2％重量比的抗氧化剂、0.1-5％重量比的防腐剂、0.1-10％重量比的稳定剂、0.1-0.3％重量比的防霉剂，还可加有0.01-4％重量比的增效剂和适量小牛血清。

可知：单试剂、双试剂中的反应剂均相同；

抗apoA I、apoB抗体制备方法实施例：

实施例1

一、抗原提取

1、将200ml混合血清与300ml的脂肪族的表面活性剂混匀，使其形成表面活性剂-血清复合物。2、采用已知的肝素锰沉淀剂100ml在磁力搅拌器上慢慢加入到200ml表面活性剂-混合血清或血浆中，使脂蛋白沉淀，收集沉淀物后用生理盐水洗涤3次。3、脱去脂蛋白中的脂质：用已知的Scanu法进行脱脂，即：将洗涤后的脂蛋白沉淀物加入到预冷的(-15℃)无水乙醇∶无水乙醚(3∶2)的混合液中，不断搅拌，经12小时过夜后，在-10℃(或4℃)离心(2000r/min)，去上清得沉淀物，再重复脱脂过程一次，3.将上述脱脂后的沉淀物用已知的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺)凝胶电泳，根据apoA I和apoB所在凝胶中的不同位置，分别将两部份凝胶分开，然后将其捣碎，分别使apoAI和apoB析出，最后进行浓缩后真空干燥放-20℃保存。

二、动物免疫

第1次：在免疫之前给动物多处注射少剂量的抗生素，7天后给予注射能降低免疫能力的物质，3天后，在动物的背部和大腿内两侧采用皮内结合皮下进行多点少剂量注射抗原-表面活性剂复合物，其中抗原用量按50公斤动物体重0.5mg；

第2次：在第1次免疫后1-8周，在动物腹部和淋巴节处注射不完全佐剂与apoA I、apoB抗原油包水抗原乳化复合物；

第3次：在第2次免疫后1-4周，在动物腹部和淋巴节处注射完全佐剂与apoA I、apoB抗原油包水抗原乳化复合物；

第4次采用与第3次一样的方法对动物进行加强注射一次，间隔7天后，用注射器抽取10ml静脉血测定抗体效价，如apoA I效价大于或等于1∶32，apoB效价大于或等于1∶516，则一次性采取颈动脉放血。

在上述四次动物免疫时，其第一次免疫动物过程所采用的抗原-表面活性剂复合物中，抗原与表面活性剂的体积配比为4∶6，且抗原微粒完全被表面活性剂包复(在振荡器上慢慢振摇得到)。

实施例2基本与实施例1相同，只是第一次免疫中注射抗原-表面活性剂复合物时，其中抗原用量是按50公斤动物体重2mg。

实施例3基本与实施例1相同，只是第一次免疫中注射抗原-表面活性剂复合物时，其中抗原用量是按50公斤动物体重5mg。

apoA I、apoB检测试剂盒的实施例

实施例4(双试剂)

试剂1.apoA I反应剂包括：

磷酸盐缓冲液                     100mmol/L

聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂)       5％

NaCl(电解质)                     0.5％

PEG-6000(高分子加速剂)           80％

广谱抗生素(防腐剂)               0.3％

溴化己二甲胺(反应促进剂)         0.3％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)         0.5％

牛血清白蛋白(稳定剂)             0.5％

其余为纯化水

试剂2：apoA I抗体试剂

apoA I抗血清稀释液            1000ml

羊抗人apoA I抗血清            1000ml

丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)5％

其中，apoA I抗体稀释液包括：磷酸盐缓冲液100mmol/L

NaCL(电解质)                  0.5％

PEG-6000(高分子加速剂)        80％

广谱抗生素(防腐剂)            0.3％

溴化己二甲胺(反应促进剂)      0.3％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)      0.5％

牛血清白蛋白(稳定剂)          5％

其余为纯化水

试剂1：apoB反应剂包括：

磷酸盐缓冲液                  100mmol/L

TWeen-20(表面活性剂)          5％

PEG-6000(高分子加速剂)        80％

广谱抗生素(防腐剂)            0.3％

溴化己二甲胺(反应促进剂)      0.3％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)      0.5％

牛血清白蛋白(稳定剂)          5％

其余为纯化水

试剂2：apoB抗体试剂

apoB抗体稀释液                1000ml

羊抗人apoB抗血清              1000ml

丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)      0.04％

其中apoB抗血清稀释液包括磷酸盐缓冲液         100mmol/L

PEG-6000(高分子加速剂)                       80％

广谱抗生素(防腐剂)                           0.3％

溴化己二甲胺(反应促进剂)                     0.3％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)                     0.5％

牛血清白蛋白(稳定剂)                         5％

其余为纯化水

3、液体血清型恒定值校准液

CAPSO(缓冲液)                        100mmol/L

柳氮磺胺吡啶(抗氧化剂)               0.5％

柠檬酸(增效剂)                       3％

广谱抗生素(防腐剂)                   0.5％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)             1％

牛血清白蛋白(稳定剂)                 8％

丙酸钠(防霉剂)                       0.3％

其余为小牛血清

校准液共有8份，分别加入apoA I、apoB的各4种不同重量的抗原，形成不同浓度的抗原，浓，浓度按照apoA I、apoB各自不同的4个恒定值浓度确定，然后用0.22μm的滤膜抽滤除菌，放2-8℃保存。

实施例5(双试剂)

试剂1：apoA I反应剂包括：

磷酸盐缓冲液                      200mmol/L

聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂)        10％

NaCL(电解质)                      0.3％

PEG-6000(高分子加速剂)           60％

广谱抗生素(防腐剂)               5％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)         0.5％

牛血清白蛋白(稳定剂)             10％

溴化己二甲胺(反应促进剂)         0.5％

其余为纯化水

试剂2：apoA I抗体试剂

apoA I抗血清稀释液              1000ml

羊抗人apoA I抗血清              100ml

丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)        0.03％

其中apoA I抗血清稀释液包括磷酸盐缓冲液  200mmol/L

NaCL(电解质)                            0.3％

PEG-6000(高分子加速剂)                  60％

广谱杀菌剂(防腐剂)                      5％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)                0.5％

牛血清白蛋白(稳定剂)                    10％

其余为纯化水

试剂1：apoB反应剂包括：

磷酸盐缓冲液                            200mmol/L

TWeen-20(表面活性剂)                    10％

PEG-6000(高分子加速剂)                  60％

广谱杀菌剂(防腐剂)                      5％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)                0.5％

牛血清白蛋白(稳定剂)         10％

溴化己二甲胺(反应促进剂)     0.5％

其余为纯化水

试剂2：apoB抗体试剂

apoB抗血清稀释液             1000ml

羊抗人apoB抗血清             100ml

丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)     0.04％

其中apoB抗血清稀释液包括磷酸盐缓冲液   200mmol/L

PEG-6000(高分子加速剂)          60％

广谱杀菌剂(防腐剂)              5％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)        0.5％

牛血清白蛋白(稳定剂)            10％

其余为纯化水

3、液体血清型恒定值校准液

CAPSO(缓冲液)                   100mmol/L

丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)         2％

柠檬酸(增效剂)                   1％

广谱杀菌剂(防腐剂)               1％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)         6％

牛血清白蛋白(稳定剂)             8％

丙酸钠(防霉剂)                   0.3％

其余为小牛血清

校准液共有8份，分别加入apoA I、apoB的各4种不同重量的抗原，形成不同浓度的抗原，浓，浓度按照apoA I、apoB各自不同的4个恒定值浓度确定，然后用0.22μm的滤膜抽滤除菌，放2-8℃保存。

实施例6(双试剂)

试剂1：apoA I反应剂包括：

磷酸盐缓冲液                50mmol/L

聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂)  0.1％

NaCL(电解质)                0.1％

PEG-6000(高分子加速剂)      20％

广谱杀菌剂(防腐剂)          0.1％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)    0.1％

牛血清白蛋白(稳定剂)        0.1％

溴化己二甲胺(反应促进剂)    0.1％

其余为纯化水

试剂2：apoA I抗体试剂

apoA I抗血清稀释液          1000ml

羊抗人apoA I抗血清          100ml

丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)    0.01％

其中APOA I抗血清稀释液包括磷酸盐缓冲液   50mmol/L

NaCL(电解质)                             0.1％

PEG-6000(高分子加速剂)                   20％

广谱杀菌剂(防腐剂)                       0.1％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)                 0.1％

牛血清白蛋白(稳定剂)                     0.1％

其余为纯化水

试剂1：apoB反应剂包括：

磷酸盐缓冲液                50mmol/L

TWeen-20(表面活性剂)        0.1％

PEG-6000(高分子加速剂)      20％

广谱杀菌剂(防腐剂)          0.1％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)    0.1％

牛血清白蛋白(稳定剂)        0.1％

溴化己二甲胺(反应促进剂)    0.1％

其余为纯化水

试剂2：apoB抗体试剂

apoB抗血清稀释液            1000ml

羊抗人apoB抗血清            100ml

丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)    0.01％

其中apoB抗血清稀释液包括磷酸盐缓冲液   50mmol/L

PEG-6000(高分子加速剂)                 20％

广谱杀菌剂(防腐剂)                     0.1％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)               0.1％

牛血清白蛋白(稳定剂)                   0.1％

其余为纯化水

3、液体血清型恒定值校准液

CAPSO(缓冲液)                          20mmol/L

丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)               0.01％

柠檬酸(增效剂)             0.01％

广谱抗生素(防腐剂)         0.1％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)   0.1％

牛血清白蛋白(稳定剂)       0.1％

丙酸钠(防霉剂)             0.01％

其余为小牛血清

校准液共有8份，分别加入apoA I、apoB的各4种不同重量的抗原，形成不同浓度的抗原，浓度按照apoA I、apoB各自不同的4个恒定值浓度确定，然后用0.22μm的滤膜抽滤除菌，放2-8℃保存。

上述双试剂使用时的操作步骤是：取试剂(反应剂)210μl加入样品3μl混匀，37℃水浴5分钟后在340nm处测定吸光度A1，再加入试剂2(抗体试剂)70μl混匀，，37℃水浴5分钟后在340nm处测定吸光度A2，计算出ΔA，即ΔA＝A2-A1，与同样处理的恒定值校准液比较，可计算出样品中apoA I、apoB的浓度。

实施例7(单试剂)

1.apoA I抗体液

apoA I反应剂                 1000ml

羊抗人apoA I抗血清           1000ml

丁基羟基茴香醚               5％

溴化己二甲胺(反应促进剂)     0.3％

其中，apoA I反应剂包括：

磷酸盐缓冲液                 100mmol/L

聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂)   5％

NaCL(电解质)                 0.5％

PEG-6000(高分子加速剂)           80％

广谱杀菌剂(防腐剂)               0.3％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)         0.05％

牛血清白蛋白(稳定剂)             0.5％

其余为纯化水

2、apoB抗体液

apoB反应剂                       1000ml

羊抗人apoB抗血清                 1000ml

丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)         0.04％

溴化己二甲胺(反应促进剂)         0.3％

其中，apoB反应剂包括：

磷酸盐缓冲液                     100mmol/L

TWeen-20(表面活性剂)             5％

PEG-6000(高分子加速剂)           80％

广谱杀菌剂(防腐剂)               0.3％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)         0.05％

牛血清白蛋白(稳定剂)             0.5％

其余为蒸馏水

3、液体血清型恒定值校准液

CAPSO(缓冲液)                    100mmol/L

柳氮磺胺吡啶(抗氧化剂)           0.6％

柠檬酸(增效剂)                   4％

广谱抗生素(防腐剂)               0.5％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)         5％

牛血清白蛋白(稳定剂)             10％

丙酸钠(防霉剂)                   0.3％

其余为小牛血清

校准液共有8份，分别加入apoA I、apoB的各4种不同重量的抗原，形成不同浓度的抗原，按照apoA I、apoB各自不同的4个恒定值浓度确定，然后用0.22μm的滤膜抽滤除菌，放2-8℃保存。

实施例8(单试剂)

1、apoA I抗体液

apoA I反应剂                 1000ml

羊抗人apoA I抗血清           50ml

丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)     2％

溴化己二甲胺(反应促进剂)     0.5％

其中apoA I反应剂包括：

磷酸盐缓冲液                 200mmol/L

聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂)   10％

NaCL(电解质)                 0.3％

PEG-6000(高分子加速剂)       60％

广谱抗生素(防腐剂)           5％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)     0.5％

牛血清白蛋白(稳定剂)         0.5％

其余为纯化水

2、apoB抗体液：

apoB反应剂                   1000ml

羊抗人apoB抗血清             40ml

丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)     2％

溴化己二甲胺(反应促进剂)     0.5％

其中apoB反应剂包括：

磷酸盐缓冲液                 200mmol/L

TWeen-20(表面活性剂)         10％

PEG-6000(高分子加速剂)       60％

广谱杀菌剂(防腐剂)           5％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)     0.5％

牛血清白蛋白(稳定剂)         0.5％

其余为纯化水

3、液体血清型恒定值校准液

CAPSO(缓冲液)                100mmol/L

丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)     2％

柠檬酸(增效剂)               1％

广谱杀菌剂(防腐剂)           1％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)     6％

牛血清白蛋白(稳定剂)         10％

丙酸钠(防霉剂)               0.5％

其余为小牛血清

校准液共有8份，分别加入apoA I、apoB的各4种不同重量的抗原，形成不同浓度的抗原，浓度按照apoA I、apoB各自不同的4个恒定值浓度确定，然后用0.22μm的滤膜抽滤除菌，放2-8℃保存。

实施例9(单试剂)

1、apoA I抗体液

apoA I反应剂              1000ml

羊抗人apoA I抗血清        100ml

丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)  0.01％

溴化己二甲胺(反应促进剂)  0.1％

其中apoA I反应剂包括：

磷酸盐缓冲液              50mmol/L

聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂)0.1％

NaCL(电解质)              0.1％

PEG-6000(高分子加速剂)    20％

广谱杀菌剂(防腐剂)        0.1％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)  0.1％

牛血清白蛋白(稳定剂)      0.1％

其余为纯化水

2、apoB抗体液

apoB反应剂                1000ml

羊抗人apoB抗血清          100ml

丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)  0.01％

溴化己二甲胺(反应促进剂)  0.1％

其中apoB反应剂包括：

磷酸盐缓冲液              50mmol/L

TWeen-20(表面活性剂)      0.1％

PEG-6000(高分子加速剂)         20％

广谱杀菌剂(防腐剂)             0.1％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)       0.1％

牛血清白蛋白(稳定剂)           0.1％

其余为纯化水

3、液体血清型恒定值校准液

CAPSO(缓冲液)                  20mmol/L

丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)       0.01％

柠檬酸(增效剂)                 0.01％

广谱抗生素(防腐剂)             5％

乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)       0.5％

牛血清白蛋白(稳定剂)           10％

丙酸钠(防霉剂)                 0.3％

其余为小牛血清

校准液共有8份，分别加入apoA I、apoB的各4种不同重量的抗原，形成不同浓度的抗原，浓度按照apoA I、apoB各自不同的4个恒定值浓度确定，然后用0.22μm的滤膜抽滤除菌，放2-8℃保存。

上述单试剂使用时的操作步骤是：取试剂300μl加入样品3μl混匀，37℃水浴5分钟后在340nm处测定吸光度，与同样处理的恒定值校准液比较，可计算出样品中apoA I、apoB的浓度。

(本发明提供的试剂盒已生产销售。商品名称为：载脂蛋白(APOA/B)检测试剂盒。生产厂商为：伊利康生物技术有限公司。公司地址：浙江省温州市经济技术开发区高科技园区27号小区。)

Claims (7)

1.一种用于检测apoA I、apoB的试剂盒，其双试剂剂型包括：

a、一种使样品中apoA I、apoB抗原位点充分暴露，有利于与抗apoA I、apoB抗体充分结合的反应剂，所述的反应剂包括50-200mmol/L缓冲液、重量比为0.1-10％的表面活性剂、重量比为20-80％的高分子加速剂、重量比为0.1-5％的防腐剂和0.1-10％的稳定剂，其余为纯化水；

b、抗体试剂，其中分别包括，一种与人血清中的apoA I、apoB抗原有高度特异反应性的抗apoA I抗血清、抗apoB抗血清和抗血清稀释液，抗apoA I抗血清与抗血清稀释液以及抗apoB抗血清与和抗血清稀释液的混合的体积比分别为1∶1-1∶10；所述的抗血清稀释液包括50-200mmol/L缓冲液、重量比为20-80％的高分子加速剂、重量比为0.1-5％的防腐剂和0.1-10％的稳定剂，其余为纯化水；

c、一种用来与样品比较，进行结果计算的液体血清型恒定值校准液，包括：20-100mmol/L的缓冲液、0.1-2.5g/L apoA I抗原、0.1-2.5g/LAapoB抗原、重量比为0.01-2％的抗氧化剂、重量比为0.1-5％的防腐剂、重量比为0.1-10％的稳定剂、重量比为0.1-0.3％的防霉剂，其余是基质；

其特征在于所述的反应剂包括重量比为0.1-10％的表面活性剂，所述的抗体试剂中还包括重量比为0.01-5％的抗氧化剂；所述的血清型恒定值校准液中的基质是小牛血清。

2.一种用于检测apoA I、apoB的试剂盒，其单试剂剂型包括：

a、抗体液，其中分别包括，一种与人血清中的apoA I、apoB抗原有高度特异反应性的抗apoA I抗血清、抗apoB抗血清和反应剂，抗apoA I抗血清与反应剂以及抗apoB抗血清与反应剂的混合的体积比分别为1∶1-1∶30；所述的反应剂包括50-200mmol/L缓冲液、重量比为20-80％的高分子加速剂、重量比为0.1-5％的防腐剂和重量比为0.1-10％的稳定剂，其余为纯化水；

b、一种用来与样品比较，进行结果计算的液体血清型恒定值校准液，包括：20-100mmol/L的缓冲液、0.1-2.5 g/L apoA I抗原、0.1-2.5 g/L AapoB抗原、重量比为0.01-2％抗氧化剂、重量比为0.1-5％防腐剂、重量比为0.1-10％稳定剂、重量比为0.1-0.3％防霉剂，其余是基质；

其特征在于所述的抗体液中还包括重量比为0.1-10％的表面活性剂、重量比为0.01-5％的抗氧化剂；所述的血清型恒定值校准液中的基质是小牛血清。

3.根据权利要求1所述的一种用于检测apoA I、apoB的试剂盒，其特征在于所述的反应剂和抗血清稀释液中还可分别包括重量比为0.1-0.5％的反应促进剂。

4.根据权利要求2所述的一种用于检测apoA I、apoB的试剂盒，其特征在于所述的抗体液中还可分别包括重量比为0.1-0.5％的反应促进剂。

5.根据权利要求1或2所述的一种用于检测apoA I、apoB的试剂盒，其特征在于所述的液体血清型恒定值校准液中还包括重量比为0.01-4％增效剂。

6.根据权利要求3或4所述的一种用于检测apoA I、apoB的试剂盒，其特征在于所述的反应剂和抗血清稀释液中还可分别加入适量电解质。

7.根据权利要求5所述的一种用于检测apoA I、apoB的试剂盒，其特征在于所述的反应剂和抗血清稀释液中还可分别加入适量电解质。