CN107102150A - 一种尿微量白蛋白测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体而言涉及一种尿微量白蛋白测定试剂盒及其制备方法。本发明提供的尿微量白蛋白测定试剂盒包括试剂I和试剂II；其中，所述试剂I包括Tween‑20、TritonX‑100、海藻糖、Nacl、乙二胺四乙酸二钠和PEG 6000；其中，所述试剂II包括山羊抗人mALB抗血清、吐温‑20、TritonX‑100、甘油。本发明提供的试剂盒的线性范围达到400mg/L，重复性CV≤10％，最低检测限达到3mg/L,稳定性达到12个月，临床样本比对相关性的R值≥0.98。这大大提高了临床诊断的准确度和检测范围。

Description

一种尿微量白蛋白测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言涉及一种尿微量白蛋白测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

微量白蛋白尿是指在尿中出现微量白蛋白。白蛋白是一种血液中的正常蛋白质，人体代谢正常情况下，尿中的白蛋白极少，具体到每升尿白蛋白不超过20mg(<20mg/L)，所以叫微量白蛋白。如果在体检后发现尿中的微量白蛋白在20mg/L-200mg/L范围内，就属于微量白蛋白尿，如果患者能够经过规范的修复肾单位，逆转纤维化治疗，尚可彻底修复肾小球，消除蛋白尿，尿常规尿蛋白的显示为阴性(-)或(+-)。而当尿中微量白蛋白超过200mg/L时，就应该引起注意了，此时证明肾病患者已有大量白蛋白漏出，可能出现低蛋白血症，肾病发展离不可逆期只有一步之遥，尿常规测试尿蛋白阳性(+)～(+++)，如果不及时进行医治，就会进入尿毒症期。

微量白蛋白尿也是整个血管系统改变的征象，并可认为是动脉病变的“窗口”，因为它是肾脏和心血管系统改变的早期指征。临床中，通常应用尿微量蛋白指标来监测肾病的发生。尿微量蛋白的检测是早期发现肾病最敏感、最可靠的诊断指标。通过尿微量白蛋白的数值，结合发病情况、症状以及病史陈述就可以较为准确的诊断病情。判断病情进入了纤维化那个阶段。

因此，尿微量白蛋白测定是一种灵敏、简便、快速的测定方法，易于在常规实验室中广泛应用，对早期肾损害的诊断远远优于常规定性或半定量试验。

目前国内常用的尿mALB的检测方法有：免疫扩散法、免疫电泳法、免疫比浊法、放射免疫法、酶联免疫吸附法、胶体金法等，现在较多采用的方法是免疫比浊法。其中免疫扩散法、免疫电泳法、、酶联免疫吸附法主要靠手工操作，步骤繁琐且准确度和批间差大，检测时间长，不适合医院检验科使用，放射免疫法准度度较高，但价格昂贵，操作繁琐。胶体金法需采用单克隆抗体，价格昂贵，且检测范围较窄。所以现在多采用免疫比浊法测定。

目前，已有一些专利对尿微量白蛋白进行了定量的研究，如专利CN101504417B涉及使用胶体硒试纸的半定量检测尿微量白蛋白方法，本方法需要用到单克隆抗体，成本较高，且无法进行定量检测。专利CN104849473A采用胶乳增强免疫比浊法测量尿液中的尿微量白蛋白，此试剂盒采用双试剂，需要使用EDC及NHS活化并将羊抗人mALB抗体进行偶联，此方法的检测范围上限为200mg/L,长期稳定性为7个月，此试剂盒对高于200mg/L的样本无法进行检测，且稳定性较短。专利CN 106053368A采用免疫比浊法对尿微量白蛋白进行测定，此方法采用多抗，且并未用胶乳增强方法，价格低廉，但此方法只对试剂盒的精密度进行考察，并未考察其线性范围和稳定性指标，也未进行临床样本测定。

发明内容

本发明针对当前技术存在缺点和不足，本发明提供了一种尿微量白蛋白测定是一种灵敏、简便、快速的测定方法，易于在常规实验室中广泛应用，对早期肾损害的诊断远远优于常规定性或半定量试验。

本发明提供的尿微量白蛋白测定试剂盒包括试剂I和试剂II；

其中，所述试剂I包括Tween-20、TritonX-100、海藻糖、Nacl、乙二胺四乙酸二钠和PEG 6000；

其中，所述试剂II包括山羊抗人mALB抗血清、吐温-20、TritonX-100、甘油。

优选的，所述Tween-20、TritonX-100、海藻糖、Nacl、乙二胺四乙酸二钠和PEG6000的质量比为0.5-5：1-5：2-5：5-20：0.6-3:10-50，尤其是质量比为3：1：4：10：1.5:15。这几种物质的添加比例的选择,会产生较好的协同作用,可以在保证反应速度不降低前提下,增加试剂体系的稳定性和抗干扰能力.有效防止试剂在储存过程中产生沉淀现象.

优选的，所述吐温-20、TritonX-100和甘油的质量比为2-5：1-5：2-10，特别是2：2：8。

这几种非离子型表面活性剂添加比例的选择,会产生较好的协同保护作用,可以防止抗体在体系中的变性,增加抗体的稳定性,有效防止试剂在储存过程中产生沉淀现象.使体系处于长期稳定状态.

优选的，所述试剂II中所述山羊抗人mALB抗血清的终浓度为35±5mg/ml。在此浓度下,抗体能有效避免HOOK效应,同时可使线性范围达到400mg/L。

上述尿微量白蛋白测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)制备试剂I：称取下列原料，用纯化水定容至1L，然后用1mol/L的HCL溶液调节PH至7.8±0.2备用：

优选的原料配比为：

2)制备试剂II：称取下列原料，用纯化水定容至1L，然后使用1mol/L的NaOH溶液调节PH至7.4±0.2制得试剂II缓冲液：

优选的原料配比为：

将试剂II缓冲液与山羊抗人mALB血清混合，使山羊抗人mALB血清的终浓度为30-40mg/ml。

配制系列浓度的校准品410mg/L、200mg/L、100mg/L、50mg/L、25mg/L、5mg/L、0mg/L。在本公司自研的全自动特定蛋白分析仪上按照如下参数进行定标

本发明的有益效果：

1)试剂I中加入Tween-20、TritonX-100、海藻糖能够改善试剂I的体系稳定性，增加储存有效期，加入Nacl可以增加盐离子的浓度，防止试剂I出现结晶发生，乙二胺四乙酸二钠的加入则可以络合尿液样本中的多种重金属离子，防止测试过程中重金属离子的干扰，同时通过多次单因素试验，获得较为理想的PEG 6000反应促进剂，对加速试剂II中抗mALB抗体与样本的反应有理想的促进作用。

2)试剂II山羊抗人mALB抗血清属于多抗，除含有抗mALB抗体外，还含有多种杂抗，加入吐温-20、TritonX-100、甘油等可有效抑制杂抗对反应过程的影响，同时可以起到稳定体系和加速反应速度的作用。同时对反应体系进行优化，使试剂盒的线性范围达到400mg/L，重复性CV≤10％，最低检测限达到3mg/L,稳定性达到12个月，临床样本比对相关性的R值≥0.98。这大大提高了临床诊断的准确度和检测范围。

附图说明

图1朗道试剂与实施例2制得的试剂临床比对相关性

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

1、制备试剂盒(实施例1、实施例2和实施例3)

试剂I的配制

按照如下配方配制实施例1、实施例2和实施例3的试剂I

定容完毕后，使用1N的HCL溶液调节PH至7.8,备用。

试剂II的配制

按照如下配方配制实施例1、实施例2和实施例3的试剂II缓冲液

定容完毕后，使用1N的NaOH溶液调节PH至7.4备用。

实施例1将山羊抗人mALB血清与试剂II缓冲液混合，使山羊抗人mALB血清的终浓度为30mg/ml。

实施例2将山羊抗人mALB血清与试剂II缓冲液混合，使山羊抗人mALB血清的终浓度为35mg/ml。

实施例3将山羊抗人mALB血清与试剂II缓冲液混合，使山羊抗人mALB血清的终浓度为40mg/ml。

以上试剂II 2-8℃保存。

2、用制得的实施例1、实施例2和实施例3进行标定标准曲线

配制系列浓度的校准品410mg/L、200mg/L、100mg/L、50mg/L、25mg/L、5mg/L、0mg/L。用本公司自研的全自动特定蛋白分析仪上按照如下参数进行定标：

标定数据如下所示：

3、(1)线性范围测定结果

实施例1测定结果如下：

实施例2测定结果如下：

实施例3测定结果如下：

(2)试剂盒批内重复性测试

上述数据表明，本公司研发的尿微量白蛋白测定试剂盒其重复性≤10％，特别是实施例2，其重复性≤2％。这就提高了试剂盒检测的精密度。

4、试剂盒的准确度测试

将国际约定校准品ERM-DA470K/IFCC稀释至靶值分别为215mg/L和25mg/L，发现测试值与靶值的相对偏差在10％以内，特别是实施例2的测试值与靶值的相对偏差在3％以内这就大大提高了试剂盒测试的准确度，为样本检测的准确性提供保障。

5、最低检测限

代入定标曲线后，实施例1代入曲线测得，最低检测限的结果值为1.72mg/L；最低检测限≤2mg/L。

实施例2最低检测限的测试结果为0.588mg/L；最低检测限≤1mg/L。

实施例3代入曲线测得，最低检测限的结果值为1.72mg/L；最低检测限≤2mg/L。

6、长期稳定性检测

考察方案：将实施例2的三批试剂置于正常贮存条件下(2-8℃)，在第3个月、6个月、9个月、12个月、14个月进行测试，中途若出现不合格，则可终止稳定性考察。

考察结果如下：

从上述考察结果可知，试剂盒在2-8℃储存，其稳定性可达到12个月.

7、临床样本比对结果

朗道试剂与自研试剂临床比对相关性结果见图1所示。

临床比对相关性可达到R＝0.998，临床样本相关性良好。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (5)

1.一种尿微量白蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括试剂I和试剂II；

其中，所述试剂I包括Tween-20、TritonX-100、海藻糖、Nacl、乙二胺四乙酸二钠和PEG6000；

其中，所述试剂II包括山羊抗人mALB抗血清、吐温-20、TritonX-100、甘油。

2.根据权利要求1所述的尿微量白蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述Tween-20、TritonX-100、海藻糖、Nacl、乙二胺四乙酸二钠和PEG 6000的质量比为0.5-5：1-5：2-5：5-20：0.6-3：10-50。

3.根据权利要求1所述的尿微量白蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述吐温-20、TritonX-100和甘油的质量比为：2-5：1-5：2-10。

4.根据权利要求1所述的尿微量白蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述试剂II中所述山羊抗人mALB抗血清的终浓度为35±5mg/ml。。

5.根据权利要求1～4中所述的任何一种尿微量白蛋白测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备试剂I：称取下列原料，用纯化水定容至1L，然后用1mol/L的HCL溶液调节PH至7.8±0.2备用：

2)制备试剂II：称取下列原料，用纯化水定容至1L，然后使用1mol/L的NaOH溶液调节PH至7.4±0.2制得试剂II缓冲液：

将试剂II缓冲液与山羊抗人mALB血清混合，使山羊抗人mALB血清的终浓度为35±5mg/ml。