CN107102150A - 一种尿微量白蛋白测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,具体而言涉及一种尿微量白蛋白测定试剂盒及其制备方法。本发明提供的尿微量白蛋白测定试剂盒包括试剂I和试剂II;其中,所述试剂I包括Tween‑20、TritonX‑100、海藻糖、Nacl、乙二胺四乙酸二钠和PEG 6000;其中,所述试剂II包括山羊抗人mALB抗血清、吐温‑20、TritonX‑100、甘油。本发明提供的试剂盒的线性范围达到400mg/L,重复性CV≤10%,最低检测限达到3mg/L,稳定性达到12个月,临床样本比对相关性的R值≥0.98。这大大提高了临床诊断的准确度和检测范围。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体而言涉及一种尿微量白蛋白测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
微量白蛋白尿是指在尿中出现微量白蛋白。白蛋白是一种血液中的正常蛋白质,人体代谢正常情况下,尿中的白蛋白极少,具体到每升尿白蛋白不超过20mg(<20mg/L),所以叫微量白蛋白。如果在体检后发现尿中的微量白蛋白在20mg/L-200mg/L范围内,就属于微量白蛋白尿,如果患者能够经过规范的修复肾单位,逆转纤维化治疗,尚可彻底修复肾小球,消除蛋白尿,尿常规尿蛋白的显示为阴性(-)或(+-)。而当尿中微量白蛋白超过200mg/L时,就应该引起注意了,此时证明肾病患者已有大量白蛋白漏出,可能出现低蛋白血症,肾病发展离不可逆期只有一步之遥,尿常规测试尿蛋白阳性(+)~(+++),如果不及时进行医治,就会进入尿毒症期。
微量白蛋白尿也是整个血管系统改变的征象,并可认为是动脉病变的“窗口”,因为它是肾脏和心血管系统改变的早期指征。临床中,通常应用尿微量蛋白指标来监测肾病的发生。尿微量蛋白的检测是早期发现肾病最敏感、最可靠的诊断指标。通过尿微量白蛋白的数值,结合发病情况、症状以及病史陈述就可以较为准确的诊断病情。判断病情进入了纤维化那个阶段。
因此,尿微量白蛋白测定是一种灵敏、简便、快速的测定方法,易于在常规实验室中广泛应用,对早期肾损害的诊断远远优于常规定性或半定量试验。
目前国内常用的尿mALB的检测方法有:免疫扩散法、免疫电泳法、免疫比浊法、放射免疫法、酶联免疫吸附法、胶体金法等,现在较多采用的方法是免疫比浊法。其中免疫扩散法、免疫电泳法、、酶联免疫吸附法主要靠手工操作,步骤繁琐且准确度和批间差大,检测时间长,不适合医院检验科使用,放射免疫法准度度较高,但价格昂贵,操作繁琐。胶体金法需采用单克隆抗体,价格昂贵,且检测范围较窄。所以现在多采用免疫比浊法测定。
目前,已有一些专利对尿微量白蛋白进行了定量的研究,如专利CN101504417B涉及使用胶体硒试纸的半定量检测尿微量白蛋白方法,本方法需要用到单克隆抗体,成本较高,且无法进行定量检测。专利CN104849473A采用胶乳增强免疫比浊法测量尿液中的尿微量白蛋白,此试剂盒采用双试剂,需要使用EDC及NHS活化并将羊抗人mALB抗体进行偶联,此方法的检测范围上限为200mg/L,长期稳定性为7个月,此试剂盒对高于200mg/L的样本无法进行检测,且稳定性较短。专利CN 106053368A采用免疫比浊法对尿微量白蛋白进行测定,此方法采用多抗,且并未用胶乳增强方法,价格低廉,但此方法只对试剂盒的精密度进行考察,并未考察其线性范围和稳定性指标,也未进行临床样本测定。
发明内容
本发明针对当前技术存在缺点和不足,本发明提供了一种尿微量白蛋白测定是一种灵敏、简便、快速的测定方法,易于在常规实验室中广泛应用,对早期肾损害的诊断远远优于常规定性或半定量试验。
本发明提供的尿微量白蛋白测定试剂盒包括试剂I和试剂II;
其中,所述试剂I包括Tween-20、TritonX-100、海藻糖、Nacl、乙二胺四乙酸二钠和PEG 6000;
其中,所述试剂II包括山羊抗人mALB抗血清、吐温-20、TritonX-100、甘油。
优选的,所述Tween-20、TritonX-100、海藻糖、Nacl、乙二胺四乙酸二钠和PEG6000的质量比为0.5-5:1-5:2-5:5-20:0.6-3:10-50,尤其是质量比为3:1:4:10:1.5:15。这几种物质的添加比例的选择,会产生较好的协同作用,可以在保证反应速度不降低前提下,增加试剂体系的稳定性和抗干扰能力.有效防止试剂在储存过程中产生沉淀现象.
优选的,所述吐温-20、TritonX-100和甘油的质量比为2-5:1-5:2-10,特别是2:2:8。
这几种非离子型表面活性剂添加比例的选择,会产生较好的协同保护作用,可以防止抗体在体系中的变性,增加抗体的稳定性,有效防止试剂在储存过程中产生沉淀现象.使体系处于长期稳定状态.
优选的,所述试剂II中所述山羊抗人mALB抗血清的终浓度为35±5mg/ml。在此浓度下,抗体能有效避免HOOK效应,同时可使线性范围达到400mg/L。
上述尿微量白蛋白测定试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
1)制备试剂I:称取下列原料,用纯化水定容至1L,然后用1mol/L的HCL溶液调节PH至7.8±0.2备用:
优选的原料配比为:
2)制备试剂II:称取下列原料,用纯化水定容至1L,然后使用1mol/L的NaOH溶液调节PH至7.4±0.2制得试剂II缓冲液:
优选的原料配比为:
将试剂II缓冲液与山羊抗人mALB血清混合,使山羊抗人mALB血清的终浓度为30-40mg/ml。
配制系列浓度的校准品410mg/L、200mg/L、100mg/L、50mg/L、25mg/L、5mg/L、0mg/L。在本公司自研的全自动特定蛋白分析仪上按照如下参数进行定标
本发明的有益效果:
1)试剂I中加入Tween-20、TritonX-100、海藻糖能够改善试剂I的体系稳定性,增加储存有效期,加入Nacl可以增加盐离子的浓度,防止试剂I出现结晶发生,乙二胺四乙酸二钠的加入则可以络合尿液样本中的多种重金属离子,防止测试过程中重金属离子的干扰,同时通过多次单因素试验,获得较为理想的PEG 6000反应促进剂,对加速试剂II中抗mALB抗体与样本的反应有理想的促进作用。
2)试剂II山羊抗人mALB抗血清属于多抗,除含有抗mALB抗体外,还含有多种杂抗,加入吐温-20、TritonX-100、甘油等可有效抑制杂抗对反应过程的影响,同时可以起到稳定体系和加速反应速度的作用。同时对反应体系进行优化,使试剂盒的线性范围达到400mg/L,重复性CV≤10%,最低检测限达到3mg/L,稳定性达到12个月,临床样本比对相关性的R值≥0.98。这大大提高了临床诊断的准确度和检测范围。
附图说明
图1朗道试剂与实施例2制得的试剂临床比对相关性
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明作进一步说明:
1、制备试剂盒(实施例1、实施例2和实施例3)
试剂I的配制
按照如下配方配制实施例1、实施例2和实施例3的试剂I
定容完毕后,使用1N的HCL溶液调节PH至7.8,备用。
试剂II的配制
按照如下配方配制实施例1、实施例2和实施例3的试剂II缓冲液
定容完毕后,使用1N的NaOH溶液调节PH至7.4备用。
实施例1将山羊抗人mALB血清与试剂II缓冲液混合,使山羊抗人mALB血清的终浓度为30mg/ml。
实施例2将山羊抗人mALB血清与试剂II缓冲液混合,使山羊抗人mALB血清的终浓度为35mg/ml。
实施例3将山羊抗人mALB血清与试剂II缓冲液混合,使山羊抗人mALB血清的终浓度为40mg/ml。
以上试剂II 2-8℃保存。
2、用制得的实施例1、实施例2和实施例3进行标定标准曲线
配制系列浓度的校准品410mg/L、200mg/L、100mg/L、50mg/L、25mg/L、5mg/L、0mg/L。用本公司自研的全自动特定蛋白分析仪上按照如下参数进行定标:
标定数据如下所示:
3、(1)线性范围测定结果
实施例1测定结果如下:
实施例2测定结果如下:
实施例3测定结果如下:
(2)试剂盒批内重复性测试
上述数据表明,本公司研发的尿微量白蛋白测定试剂盒其重复性≤10%,特别是实施例2,其重复性≤2%。这就提高了试剂盒检测的精密度。
4、试剂盒的准确度测试
将国际约定校准品ERM-DA470K/IFCC稀释至靶值分别为215mg/L和25mg/L,发现测试值与靶值的相对偏差在10%以内,特别是实施例2的测试值与靶值的相对偏差在3%以内这就大大提高了试剂盒测试的准确度,为样本检测的准确性提供保障。
5、最低检测限
代入定标曲线后,实施例1代入曲线测得,最低检测限的结果值为1.72mg/L;最低检测限≤2mg/L。
实施例2最低检测限的测试结果为0.588mg/L;最低检测限≤1mg/L。
实施例3代入曲线测得,最低检测限的结果值为1.72mg/L;最低检测限≤2mg/L。
6、长期稳定性检测
考察方案:将实施例2的三批试剂置于正常贮存条件下(2-8℃),在第3个月、6个月、9个月、12个月、14个月进行测试,中途若出现不合格,则可终止稳定性考察。
考察结果如下:
从上述考察结果可知,试剂盒在2-8℃储存,其稳定性可达到12个月.
7、临床样本比对结果
朗道试剂与自研试剂临床比对相关性结果见图1所示。
临床比对相关性可达到R=0.998,临床样本相关性良好。
以上所述为本发明的较佳实施例而已,但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改,都落入本发明保护的范围。
Claims (5)
1.一种尿微量白蛋白测定试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括试剂I和试剂II;
其中,所述试剂I包括Tween-20、TritonX-100、海藻糖、Nacl、乙二胺四乙酸二钠和PEG6000;
其中,所述试剂II包括山羊抗人mALB抗血清、吐温-20、TritonX-100、甘油。
2.根据权利要求1所述的尿微量白蛋白测定试剂盒,其特征在于:所述Tween-20、TritonX-100、海藻糖、Nacl、乙二胺四乙酸二钠和PEG 6000的质量比为0.5-5:1-5:2-5:5-20:0.6-3:10-50。
3.根据权利要求1所述的尿微量白蛋白测定试剂盒,其特征在于:所述吐温-20、TritonX-100和甘油的质量比为:2-5:1-5:2-10。
4.根据权利要求1所述的尿微量白蛋白测定试剂盒,其特征在于:所述试剂II中所述山羊抗人mALB抗血清的终浓度为35±5mg/ml。。
5.根据权利要求1~4中所述的任何一种尿微量白蛋白测定试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)制备试剂I:称取下列原料,用纯化水定容至1L,然后用1mol/L的HCL溶液调节PH至7.8±0.2备用:
2)制备试剂II:称取下列原料,用纯化水定容至1L,然后使用1mol/L的NaOH溶液调节PH至7.4±0.2制得试剂II缓冲液:
将试剂II缓冲液与山羊抗人mALB血清混合,使山羊抗人mALB血清的终浓度为35±5mg/ml。
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Application publication date: 20170829 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |