CN110407934A - 抗人白蛋白混合抗体及测定试剂盒 - Google Patents

抗人白蛋白混合抗体及测定试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗人白蛋白混合抗体及测定试剂盒。该混合抗体包括抗人白蛋白抗体1(抗人ALB抗体1)和抗人白蛋白抗体2(抗人ALB抗体2)，抗人ALB抗体1对mALB检测的线性下限为5～30mg/L，抗人ALB抗体2对mALB检测的线性上限为1800～2000mg/L。本申请的混合抗体能够兼顾高灵敏度和高检测范围的优势，同时达到超出两个抗体特性的意外的协同效果，从而能够满足临床应用上正常人群的筛查(最低值能测到5mg/L)，减少较高浓度样本(1875～2500mg/L)的稀释工作，也能避免高浓度的患者漏诊(高浓度下不出现HOOK效应)。

Description

抗人白蛋白混合抗体及测定试剂盒
技术领域
本发明涉及体外诊断领域，具体而言，涉及一种抗人白蛋白混合抗体及测定试剂盒。
背景技术
尿中总蛋白排泄正常，尿常规蛋白定量阴性，而尿白蛋白排泄却增加，称之为微量白蛋白尿。正常人尿微量白蛋白浓度可低于20mg/L，而临床高浓度尿微量白蛋白样本浓度可达4000～5000mg/L，因此，较广的临床样本浓度范围要求mALB测试能同时满足低浓度和高浓度样本的检测需求。
目前常用的尿微量白蛋白测定方法有胶体金法、普通免疫比浊法和胶乳免疫比浊法。其中胶体金法只能给出定性或半定量结果；普通免疫比浊法虽然可以定量，但灵敏度较低，线性范围一般为25mg/L～600mg/L，达不到临床要求；化学发光法和胶乳比浊法较其他方法原料成本较高，且抗体的包被和标记工艺步骤较多、影响因素复杂，造成批次间差异大。
用目前常用方法对在20mg/L mALB浓度附近的正常人群样本进行测试，有些存在测试结果准确度差的缺陷；对于500～2500mg/L的较高mALB浓度的样本往往需要稀释后再次测定，增加了工作量及检测误差；对于更高浓度的mALB样本(4000～5000mg/L)测试往往会出现HOOK效应，导致高浓度样本被低估(表观测得的浓度落入线性范围内，导致无法甄别是否是需要稀释的高值样本)，甚至假阴性结果(低于阴性参考值20mg/L)。因此，需要一种改进的兼具低的检测下限与高的线性上限两个特性或低HOOK效应的免疫检测方法。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种抗人白蛋白(抗人ALB)混合抗体及测定试剂盒，以解决现有技术中的免疫比浊法不能同时兼具低的检测下限与较高的线性上限(1875～2500mg/L)的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种抗人ALB混合抗体，该混合抗体包括抗人ALB抗体1和抗人ALB抗体2，抗人ALB抗体1对mALB检测的线性下限为5～30mg/L，抗人ALB抗体2对mALB检测的线性上限为1800～2000mg/L。
进一步地，抗人ALB抗体1与抗人ALB抗体2的质量比为1：5～4：1。
进一步地，抗人ALB抗体1与抗人ALB抗体2各自独立地选自多克隆抗体、单克隆抗体或单克隆与多克隆抗体的混合抗体。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种测定mALB的试剂盒，试剂盒包括抗人ALB抗体，抗人ALB抗体为上述任一种抗人ALB混合抗体。
进一步地，试剂盒包括第一组分，第一组分包括抗人ALB混合抗体、缓冲液和稳定剂；优选地，抗人ALB混合抗体在第一组分中的浓度为700～1400mg/L，优选地，抗人ALB混合抗体在第一组分中的浓度为800～1000mg/L，更优选为900mg/L。
进一步地，缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、乙二醛-HCl缓冲液及巴比妥缓冲液中的任意一种；优选地，缓冲液的pH值为7.0～7.8；优选地，缓冲液的浓度为20～100mmol/L。
进一步地，稳定剂包括电解质及防腐剂，还包括离子螯合剂、糖类物质及血清白蛋白中的一种或多种；优选地，离子螯合剂为EDTA-Na2、EDTA-Na4、酒石酸钾钠及柠檬酸铵中的任一种；优选地，糖类物质为海藻糖、葡聚糖、蔗糖及葡萄糖中的一种或多种；优选地，血清白蛋白为牛血清白蛋白；优选地，电解质为氯化钾、氯化钠、氯化镁及乙酸钠中的一种；优选地，防腐剂为ProClin 300或叠氮钠中的一种。
进一步地，离子螯合剂的浓度为20～100mmol/L；优选地，糖类物质的浓度为5～10g/L，更优选为6～8g/L；优选地，血清白蛋白的浓度为2～5g/L；优选地，电解质的浓度为10～30g/L；优选地，防腐剂的浓度为0.1～0.5g/L。
进一步地，试剂盒还包括第二组分，第二组分包括缓冲液、稳定剂、促聚剂及表面活性剂。
进一步地，促聚剂为平均分子量为6000～8000的PEG；更优选促聚剂的浓度为20～50g/L；优选地，表面活性剂选自TritonX-100、Tween-20或Tween-80；更优选表面活性剂在第二组分中的浓度为0.1～3wt％。
应用本发明的技术方案，抗人ALB抗体1的线性下限在5～30mg/L，对mALB的检测具有较高的灵敏度，而抗人ALB抗体2的线性上限为1800～2000mg/L，能够检测高浓度的样本。当所检测的样本中mALB的浓度较低时，混合抗体中抗人ALB抗体1较抗人ALB抗体2的灵敏度高，在竞争抗原的过程中，其更容易与样本中mALB蛋白抗原的结合，因而能够对低浓度的正常人的mALB蛋白进行测定；当所检测的样本中mALB蛋白的浓度较高时，混合抗体中的抗人ALB抗体2的效价较高，在与抗人ALB1抗体竞争抗原时更有优势，因而能够测得高浓度的待检样本。因而，本申请的混合抗体能够兼顾高灵敏度和高检测范围的优势，同时达到超出两个抗体特性的意外的协同效果，从而能够满足临床应用上正常人群的筛查(最低值能测到5mg/L)，减少较高浓度样本(1875～2500mg/L)的稀释工作，也能避免高浓度的患者漏诊(高浓度下不出现HOOK效应)。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明的实施例1、11与对比例1、2和3的试剂盒在对不同浓度的白蛋白进行检测时所体现出的HOOK效应。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
术语解释：
尿微量白蛋白，microalbunminuria，mALB。
抗人白蛋白(Albumin，ALB)抗体。
聚合剂(或称促聚剂)：应用最多的是PEG(聚乙二醇)MW6000-8000，是一种不带电荷的直链大分子多糖，可能是它可以解除蛋白质(抗原、抗体)周围的电子云和水化层，近似于提高了抗原和抗体的浓度，并促进其相互靠近结合成复合物颗粒；或是促使已形成的免疫复合物分子的疏水区暴露，有利于这些复合物凝聚成不溶于水的大颗粒。
HOOK效应(或称钩状效应)：是指当抗原或抗体量大大过剩时，会形成可溶性复合物，从而导致假阴性的现象。其中抗体过量叫做前带效应；抗原过量叫做后带效应。
BSA：牛血清白蛋白。
如背景技术所提到的，现有技术中检测尿微量蛋白的试剂盒虽已有多种，但难以满足人群筛查之用，因为正常人尿微量白蛋白浓度可低于20mg/L，而临床高浓度尿微量白蛋白样本浓度可达4000～5000mg/L，因而难以同时满足低浓度和高浓度的检测需求。
为改善现有技术中的这一状况，在本申请一种典型的实施例中，提出了一种抗人ALB混合抗体，该混合抗体包括抗人ALB抗体1和抗人ALB抗体2，抗人ALB抗体1检测的线性下限为5～30mg/L，抗人ALB抗体2的检测的线性上限为1800～2000mg/L。
本申请中的混合抗体的原理与单一抗体能够用于检测mALB蛋白的原理相同：免疫比浊法的原理是抗原与适量的特异性抗体结合，形成不溶性的抗原-抗体免疫复合物，使反应液产生浊度，在抗体量过量的条件下，浊度的高低与mALB的含量呈正相关。通过与同样处理的校准品比较，即可计算未知样本中白蛋白的含量。本发明的检测原理可以解释如下：抗人ALB抗体1的线性下限在5～30mg/L，对mALB的检测具有较高的灵敏度，而抗人ALB抗体2的线性上限为1800～2000mg/L，能够检测高浓度的样本。当所检测的样本中mALB的浓度较低时，混合抗体中抗人ALB抗体1较抗人ALB抗体2的灵敏度高，在竞争抗原的过程中，其更容易与样本中mALB蛋白抗原的结合，因而能够对低浓度的正常人的mALB蛋白进行测定；当所检测的样本中mALB蛋白的浓度较高时，混合抗体中的抗人ALB抗体2的效价较高，在与抗人ALB1抗体竞争抗原时更有优势，因而能够测得高浓度的待检样本。因而，本申请的混合抗体能够兼顾高灵敏度和高检测范围的优势，同时达到超出两个抗体特性的意外的协同效果，从而能够满足临床应用上正常人群的筛查(最低值能测到5mg/L)，减少较高浓度样本(1875～2500mg/L)的稀释工作，也能避免高浓度的患者漏诊(高浓度下不出现HOOK效应)。
本申请的上述混合抗体为具有上述两种特性的抗体进行混合得到，因而，任何满足上述检测线性上限的抗人ALB抗体均适用于本申请。实际应用中，可以根据两种抗体的具体性能的不同进行合理优化配比。为了进一步提高本申请的上述混合抗体的检测性能，在本申请一种优选的实施例中，上述抗人ALB抗体1与抗人ALB抗体2的质量比为1：5～4：1。按该质量比混合而成的混合抗体具有低线性下限、低HOOK效应及更高的线性上限的优势。
需要说明的是，本申请的上述混合抗体中，对于符合上述两种不同检测线性上限的抗人ALB抗体1和抗人ALB抗体2而言，并无特殊的要求，只要满足上述线性上限的要求即可。在一种优选的实施例中，上述抗人ALB抗体1与抗人ALB抗体2各自独立地选自多克隆抗体、单克隆抗体或单克隆与多克隆抗体的混合抗体。
在上述混合抗体的基础上，本申请还提供了一种测定mALB的试剂盒，该试剂盒包括抗人ALB抗体，抗人ALB抗体为上述任一种混合抗体。本申请的混合抗体中抗人ALB抗体1的线性下限在5～30mg/L，对mALB的检测具有较高的灵敏度，抗人ALB抗体2的线性上限为1800～2000mg/L，能够检测较高浓度的样本。
该试剂盒的检测原理可以解释如下：抗人ALB抗体1的线性下限在5～30mg/L，对mALB的检测具有较高的灵敏度，而抗人ALB抗体2的线性上限为1800～2000mg/L，能够检测较高浓度的样本。当所检测的样本中mALB的浓度较低时，混合抗体中抗人ALB抗体1较抗人ALB抗体2的灵敏度高，在竞争抗原的过程中，其更容易与样本中mALB蛋白抗原的结合，因而能够对低浓度的正常人的mALB蛋白进行测定；当所检测的样本中mALB蛋白的浓度较高时，混合抗体中的抗人ALB抗体2的效价较高，在与抗人ALB抗体1竞争抗原时更有优势，因而能够测得高浓度的待检样本。因而，本申请的混合抗体能够兼顾高灵敏度和高检测范围的优势，从而能够满足临床应用上正常人群的筛查(最低值能测到5mg/L)，减少较高浓度样本(1875～2500mg/L)的稀释工作，也能避免高浓度的患者漏诊(高浓度下不出现HOOK效应)。
不同的抗体，因各自的获取途径、制备工艺、蛋白结构可能不同，需要各自不同的试剂来维持其稳定性，从而导致能稳定这种抗体的储存液不一定能用于储存另一种抗体，混合抗体的储存液需要兼顾所混合的抗体的特性要求，因而需要进行反复的筛选。
为了使上述试剂盒中的混合抗体的性能更稳定，储存时间相对更长，试剂盒中还可以包括便于存储和稳定的试剂。在本申请一种优选的实施例中，上述试剂盒包括第一组分，第一组分包括混合抗体、缓冲液和可选的稳定剂。优选地，混合抗体在第一组分中的浓度为700～1400mg/L，优选为800～1000mg/L，最优选为900mg/L。混合抗体在第一组分中的浓度在700～1400mg/L范围内时，该试剂盒的线性检测上限能够达到1950～2500mg/L范围，HOOK效应的极限浓度可达40000～54000mg/L。而浓度在800～1000mg/L范围内时，线性上限及HOOK效应的极限浓度均较高，分别达到2350mg/L以上和54000mg/L。当混合抗体的浓度为900mg/L时，线性检测上限达到最高。
保持抗体活性关键是要保持抗体蛋白的空间结构的稳定。影响抗体活性的因素主要有溶液的pH值、电解质的浓度、离子螯合剂、微生物的作用等。电解质能够提供合适的离子强度，离子螯合剂可以螯合金属离子防止一些离子沉积。部分糖类物质可以起到保护抗体活性的作用，血清白蛋白类的无关蛋白能够在抗体表面形成一种保护膜，使蛋白结构免遭破坏。防腐剂Proclin 300、NaN3等可以防止空气和水中的微生物的腐蚀。
在本申请一种优选的实施例中，缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、乙二醛-HCl缓冲液及巴比妥缓冲液中的任意一种。稳定剂包括电解质及防腐剂，还包括离子螯合剂、糖类物质及血清白蛋白中的一种或多种，比如稳定剂可以包括电解质、防腐剂及离子螯合剂；或者稳定剂可以包括电解质、防腐剂及糖类物质；或者稳定剂可以包括电解质、防腐剂及血清白蛋白；也可以包括电解质、防腐剂、糖类物质及离子螯合剂；还可以包括电解质、防腐剂、糖类物质、离子螯合剂及血清白蛋白等。
优选地，离子螯合剂为EDTA-Na2、EDTA-Na4、酒石酸钾钠及柠檬酸铵中的任一种；优选地，糖类物质为海藻糖、葡聚糖、蔗糖及葡萄糖中的一种或多种；优选地，血清白蛋白为牛血清白蛋白；优选地，电解质为氯化钾、氯化钠、氯化镁及乙酸钠中的一种；优选地，防腐剂为ProClin 300或叠氮钠中的一种或多种。采用上述类别的缓冲液和稳定剂能使得上述混合抗体的性能更稳定，储存时间更长。
上述优选实施例中所采用的缓冲液和稳定剂，可以根据具体应用中所选用的类别，合理优化其pH值或浓度。在本申请中优选的实施例中，上述缓冲液的pH值为7.0～7.8。在一些优选的实施例中，上述缓冲液的浓度为20～100mmol/L。
在一些优选的实施例中，第一组分中，离子螯合剂的浓度为20～100mmol/L，更优选为30～80mmol/L；在一些优选的实施例中，糖类物质的浓度为5～10g/L，更优选为6～8g/L；血清白蛋白的浓度为2～5g/L；在一些优选的实施例中，电解质的浓度为10～30g/L；在一些优选的实施例中，防腐剂的浓度为0.1～0.5g/L。
为了进一步提高检测的便利性，在本申请一种优选的实施例中，上述试剂盒还包括第二组分，第二组分包括缓冲液、稳定剂、促聚剂及表面活性剂。第二组分的作用是用来提供与抗原反应的缓冲环境，使免疫复合物成为悬浮于反应溶液中的微粒。上述第二组分中的缓冲液、稳定剂等成分与上述第一组分中的缓冲液和稳定剂的成分可以相同，也可以有所不同。
为了进一步促进抗原抗体反应结合形成复合物，在本申请的一些优选的实施例中，上述第二组分中的促聚剂为平均分子量为6000～8000的PEG，其是一种不带电荷的直链大分子多糖，可能是它可以解除蛋白质(抗原、抗体)周围的电子云和水化层，近似于提高了抗原和抗体的浓度，并促进其相互靠近结合成复合物颗粒；或是促使已形成的免疫复合物分子的疏水区暴露，有利于这些复合物凝聚成不溶于水的大颗粒。
在某些优选的实施例中，上述第二组分中，表面活性剂选自TritonX-100、甘油、吐温-80或吐温-20，更优选表面活性剂在第二组分中的浓度为0.1～3wt％。本申请中，表面活性剂的作用是有效防止试剂在储存过程中产生沉淀现象使其处于相对稳定的状态，浓度在0.1～3wt％范围内具有有利于抗体的分散和稳定的有益效果。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
需要说明的是，下列实施例的原材料来源为：
第一类抗体(抗人ALB抗体1)：抗人ALB1-1抗体(线性下限为20mg/L)购自索莱宝科技有限公司，货号：SA107，批号：20160819；抗人ALB1-2抗体(线性下限为30mg/L)购自索莱宝科技有限公司，货号：SA107，批号：20170528；抗人ALB1-3抗体(线性下限为5mg/L)购自索莱宝科技有限公司，货号：SA107，批号：201860305。
第二类抗体(抗人ALB抗体2)：抗人ALB2-1抗体(线性上限为1800mg/L)购自上海源叶生物科技有限公司，货号：SSA107，批号：P29K1857R40；抗人ALB2-2抗体(线性上限为2000mg/L)购自上海源叶生物科技有限公司，货号：SSA107，批号：R15O97K3457。
第三类抗体(抗人ALB抗体3)：抗人ALB抗体3(线性上限为1000mg/L)购自Eastcoast，货号：CAU26640，批号：R170528。
人白蛋白：厂家Sigma-Aldrich，货号：A9731，批号：SLBW7761。
Tris、叠氮钠，Sigma公司。
氯化钠，西陇科学股份有限公司。
BSA：均购自Roche。
校准品由深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产。
上述羊抗人ALB抗体通过如下检测试剂及检测方法筛选得到：
检测试剂：包括分开放置的试剂R1(即第二组分)和试剂R2(即第一组分)，各自的组成如下：
试剂R2组成为：100mmol/L，pH 7.8的Tris-HCl缓冲液，浓度为700mg/L的上述来源的抗人ALB抗体1或抗人ALB抗体2，10g/L氯化钠，0.5g/L ProClin 300；
试剂R1组成为：pH为7.8的Tris-HCl缓冲液、40g/L聚乙二醇(分子量为6000)、50mmol/L氯化钠、2％TritonX-100、0.02％叠氮钠；
检测方法：分别取生理盐水、一系列不同浓度梯度的样本或标准品各5μl，然后再分别加入210μl的R1试剂，预孵育5min后读取吸光度A1，再加入70μl的R2试剂，反应5min后读取吸光度A2，并计算ΔA(ΔA＝A2-A1)。
尿微量白蛋白含量(mg/L)＝(ΔA测定÷ΔA标准)×C标准。
ΔA测定：检测样本吸光度变化；ΔA标准：标准品吸光度变化；C标准：标准品的浓度。
使用具有双试剂功能的Snibe自产全自动生化分析仪，采用终点法进行测定，检测主波长为340nm。
实施例1
一种测定mALB的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，
试剂R2组成为：100mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH为7.8；
浓度为900mg/L混合抗体，抗人ALB1-2：抗人ALB2-2抗体质量比＝7:3；
BSA，2g/L；
海藻糖，6g/L；
ProClin 300，0.5g/L；
EDTA-Na2，30mmol/L；
氯化钠，10g/L。
试剂R1组成为：pH为7.8的100mmol/L Tris-HCl缓冲液、40g/L聚乙二醇(分子量为6000)、50mmol/L氯化钠、2％TritonX-100、0.02％叠氮钠。
实施例2
一种测定mALB的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，
试剂R2组成为：20mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH为7.0；
浓度为800mg/L混合抗体，抗人ALB1-2：抗人ALB2-2抗体质量比＝7:3；
EDTA-Na4，80mmol/L；
海藻糖，8g/L；
BSA，2g/L；
氯化钠，10g/L；
ProClin 300，0.5g/L。
试剂R1组成为：pH为7.0的20mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、20g/L聚乙二醇(分子量为8000)、50mmol/L氯化钠、0.1％TritonX-20、0.02％叠氮钠。
实施例3
一种测定mALB的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，
试剂R2组成为：100mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH为7.8；
浓度为1000mg/L混合抗体，抗人ALB1-1：抗人ALB2-1抗体质量比＝7:3；
酒石酸钾钠，30mmol/L；
蔗糖，5g/L；
BSA，2g/L；
氯化钠，10g/L；
ProClin 300，0.5g/L。
试剂R1组成为：pH为7.8的100mmol/L Tris-HCl缓冲液、40g/L聚乙二醇(分子量为6000)、50mmol/L氯化钠、2％TritonX-100、0.02％叠氮钠。
实施例4
一种测定mALB的试剂盒，包括试剂R2和试剂R1，
试剂R2组成为：90mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH为7.4；
浓度为1200mg/L混合抗体，抗人ALB抗体1(抗人ALB1-1和抗人ALB1-2抗体等比混合)：抗人ALB抗体2(抗人ALB2-1和抗人ALB2-2抗体等比混合)＝7:3；
柠檬酸铵，80mmol/L；
葡聚糖，10g/L；
BSA，5g/L；
氯化钠，20g/L；
叠氮钠，0.1g/L。
试剂R1组成为：pH为7.4的90mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、50g/L聚乙二醇(分子量为8000)、50mmol/L氯化钠、2％TritonX-100、0.02％叠氮钠。
实施例5
一种测定mALB的试剂盒，包括试剂R2和试剂R1，
试剂R2组成为：100mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH为7.8；
浓度为700mg/L混合抗体，抗人ALB1-2：抗人ALB2-2抗体质量比＝7:3；
EDTA-Na2，20mmol/L；
葡萄糖，6g/L；
BSA，2g/L；
氯化镁，10g/L；
ProClin 300，0.5g/L。
试剂R1组成为：pH为7.8的100mmol/L Tris-HCl缓冲液、40g/L聚乙二醇(分子量为6000)、50mmol/L氯化钠、2％TritonX-100、0.02％叠氮钠。
实施例6
一种测定mALB的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，
试剂R2组成为：40mmol/L巴比妥缓冲液，pH为7.4；
浓度为1400mg/L混合抗体，抗人ALB1-1：抗人ALB2-1抗体质量比＝7:3；
EDTA-Na2，100mmol/L；
葡聚糖(分子量4000)，8g/L；
BSA，4g/L；
乙酸钠，30g/L；
叠氮钠，0.1g/L。
试剂R1组成为：pH为7.4的40mmol/L巴比妥缓冲液、40g/L聚乙二醇(分子量为6000)、50mmol/L氯化钠、2％TritonX-100、0.02％叠氮钠。
实施例7
一种测定mALB的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，
试剂R2组成为：100mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH为7.8；
浓度为1400mg/L混合抗体，抗人ALB1-3：抗人ALB2-2抗体质量比＝5：5；
EDTA-Na2，20mmol/L；
葡萄糖，10g/L；
氯化钠，10g/L；
ProClin 300，0.5g/L。
试剂R1组成为：pH为7.8的100mmol/L Tris-HCl缓冲液、40g/L聚乙二醇(分子量为6000)、50mmol/L氯化钠、2％TritonX-100、0.02％叠氮钠。
实施例8
一种测定mALB的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，
试剂R2组成为：100mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH为7.8；
浓度为1400mg/L混合抗体，抗人ALB1-2：抗人ALB2-2抗体质量比＝1：5；
EDTA-Na2，20mmol/L；
氯化钠，10g/L；
ProClin 300，0.5g/L。
试剂R1组成为：pH为7.8的100mmol/L Tris-HCl缓冲液、40g/L聚乙二醇(分子量为6000)、50mmol/L氯化钠、1％Tween-80、0.02％叠氮钠。
实施例9
一种测定mALB的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，
试剂R2组成为：100mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH为7.8；
浓度为1400mg/L混合抗体，抗人ALB1-2：抗人ALB2-2抗体质量比＝4:1；
葡萄糖，10g/L；
氯化钾，30g/L；
ProClin 300，0.5g/L。
试剂R1组成为：pH为7.8的100mmol/L Tris-HCl缓冲液、40g/L聚乙二醇(分子量为6000)、50mmol/L氯化钠、2％TritonX-100、0.02％叠氮钠。
实施例10
一种测定mALB的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，
试剂R2组成为：20mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH为7.0；
浓度为1400mg/L混合抗体，抗人ALB1-2：抗人ALB2-2抗体质量比＝6:1；
BSA，2g/L；
氯化钠，10g/L；
ProClin 300，0.5g/L。
试剂R1组成为：pH为7.0的20mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、40g/L聚乙二醇(分子量为6000)、50mmol/L氯化钠、2％Tween-20、0.02％叠氮钠。
实施例11
一种测定mALB的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，
试剂R2组成为：100mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH为7.8；
浓度为1500mg/L混合抗体，抗人ALB1-2：抗人ALB2-2抗体质量比＝7:3；
氯化钠，10g/L；
ProClin 300，0.5g/L。
试剂R1组成为：pH为7.8的100mmol/L Tris-HCl缓冲液、40g/L聚乙二醇(分子量为6000)、50mmol/L氯化钠、2％TritonX-100、0.02％叠氮钠。
对比例1：
一种测定mALB的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，
试剂R2组成为：100mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH为7.8；
抗人ALB2-2抗体，浓度为700mg/L；
氯化钠，10g/L；
ProClin 300，0.5g/L。
试剂R1组成为：pH为7.8的100mmol/L Tris-HCl缓冲液、40g/L聚乙二醇(分子量为6000)、50mmol/L氯化钠、2％TritonX-100、0.02％叠氮钠。
对比例2：
一种测定mALB的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，
试剂R2组成为：100mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH为7.8；
抗人ALB1-2抗体，浓度为700mg/L；
氯化钠，10g/L；
ProClin 300，0.5g/L。
试剂R1组成为：pH为7.8的100mmol/L Tris-HCl缓冲液、40g/L聚乙二醇(分子量为6000)、50mmol/L氯化钠、2％TritonX-100、0.02％叠氮钠。
对比例3：
一种测定mALB的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，
试剂R2组成为：100mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH为7.8；
浓度为1400mg/L混合抗体，抗人ALB1-2抗体：抗人ALB抗体3质量比＝7:3；
氯化钠，10g/L；
ProClin 300，0.5g/L。
试剂R1组成为：pH为7.8的100mmol/L Tris-HCl缓冲液、40g/L聚乙二醇(分子量为6000)、50mmol/L氯化钠、2％TritonX-100、0.02％叠氮钠。
对比例4：
一种测定mALB的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，
试剂R2组成为：100mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH为7.8；
抗人ALB1-1抗体，浓度为700mg/L；
氯化钠，10g/L；
ProClin 300，0.5g/L。
试剂R1组成为：pH为7.8的100mmol/L Tris-HCl缓冲液、40g/L聚乙二醇(分子量为6000)、50mmol/L氯化钠、2％TritonX-100、0.02％叠氮钠。
检测方法：
1)用纯化水(指不含任何离子的水)稀释高浓度人白蛋白配制得到系列稀释浓度的样本，其理论浓度如表1中第一列的理论浓度所示，然后将各实施例和对比例的试剂盒中的试剂对不同理论浓度的样本进行线性上限检测，具体的检测结果见表1。
表1：线性区间
注：相对偏差＝(平均值-理论浓度)/理论浓度*100％。
从表1可以看出：对相对偏差在10％以内的测定结果进行线性回归分析，S1～S9(实施例1～实施例9)的线性上限为2125～2500mg/L，均高于对比例1～4的线性上限，也高于各自混合抗体中单个抗体的线性上限；且S1～S11在低浓度区(≤20mg/L)均具有小于10％的相对偏差，满足低值样本的检测要求；D1中尽管线性上限也可以达到2000mg/L，但其在60mg/L以下时检测的结果与实际浓度偏差较大，即结果可信度低，尤其是20mg/L时，相对偏差达到96.10％，即根本无法用于该浓度下的检测。相应地，D2仅在浓度低于300mg/L时，相对偏差小于10％，当浓度大于等于400mg/L时，相对偏差随着浓度的升高，相对偏差逐渐增大。进一步地，S1～S3的线性上限显著大于S4～S9，S5的线性上限显著大于S11，均说明混合抗体的总浓度在800～1000mg/L时检测的上下限效果更优；S5的线性上限大于S10，说明混合抗体中抗体1和抗体2的比例在7:3时优于在6:1时的上下限检测效果。
2)HOOK效应检测
用纯化水对人白蛋白进行系列稀释配制不同的高值样本(300mg/L～54000.mg/L)。检测结果见表2和图1。
表2：HOOK效应
由图1的HOOK效应曲线及表2的检测数据可知：当理论浓度达到54000mg/L时，实施例1的表观测定浓度(即测得的浓度)为2812.2mg/L，其未落入实施例1的线性区间(且与线性上限偏值较大)，所以可以正确指示其为高值待稀释测定样本，不会出现HOOK效应下的错检现象，S2和S3在样本中抗原浓度达到54000mg/L时，也均未落入各自的线性区间，所以也不会出现的HOOK效应下的错检现象(且抗原过剩已处于边缘状态)；当理论浓度达到48000mg/L时，S4～S7的表观测定浓度均未落入各自的线性区间，但当理论浓度达到54000mg/L时，其已落入各自的线性区间，即对于大于48000mg/L的样本会出现错检现象，S1～S11的抗原过剩浓度均高于对比例。
从S1～S9及S10来看，在试剂盒的检测线性范围、线性上限和HOOK效应方面，S1～S9优于S10，而从S1～S3又优于S4～S9，S2～S3又优于S1，由此表明两种抗体混合比例在本申请的优选范围内使用，上述性能比较优异；而当混合的比例相同时，混合抗体的总浓度在800～1000mg/L时，上述性能更优，总浓度为900mg/L时，上述性能最优。
此外，与D1相比，尽管S10(两种抗体的比例为6：1)和S11(抗体总浓度为1500mg/L)的线性上限方面有所降低，但这两个实施例在HOOK效应方面分别达到40000和35000mg/L，还是优于比对比例1～4。
3)检测下限的精密度
采用纯化水对40mg/L的人白蛋白样本进行系列浓度稀释，得到理论浓度分别为20、10、5、3mg/L的低值样本。对各个样本重复测定11次，计算相对标准偏差RSD％，计算公式为：
相对标准偏差(RSD)＝标准偏差(SD)/计算结果的算术平均值(X)*100％。该值通常用来表示分析测试结果的精密度。测得各实施例及对比例的检测下限精密度结果见表3。
表3：
由表3的检测数据可知，对比例1虽然具有相对高的检测上限(2000mg/L)，但其检测的最低检测限在3～20mg/L内均不合格，不能满足健康低值样本的筛选；相反，对比例2虽然可以满足健康低值样本的筛选(在3～20mg/L内的精密度达到3.46％)，但其线性检测上限仅为300mg/L(表1)。而实施例1～11在具有提高的线性上限的同时，在低值区(5mg/L)也具有合格的精密度。
4)长期稳定性检测
检测方法为：采用朗道公司的mALB的质控品(货号为AU2352)，浓度为30.5mg/L，连续检测保存1～14个月的存储稳定性，检测结果见表4～表5。
表4：
时间 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6 实施例7
0个月 28.50 32.44 30.96 28.59 28.55 28.61 28.23
3个月 28.49 32.37 30.37 28.84 28.29 29.40 26.51
6个月 28.66 32.67 31.87 28.73 29.21 27.65 25.83
8个月 28.19 31.70 29.98 27.30 27.02 27.62 25.52
10个月 27.97 31.46 29.04 26.11 26.51 26.17 22.28
12个月 29.38 31.16 28.87 26.02 25.97 25.44 21.48
13个月 29.43 31.03 27.84 24.94 24.52 22.22 17.78
14个月 29.90 30.98 26.94 24.59 21.41 20.89 17.73
表5：
时间 实施例8 实施例9 实施例10 实施例11 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4
0个月 31.75 31.99 32.06 33.31 55.21 30.87 37.21 31.11
3个月 30.10 30.81 24.66 19.39 41.81 18.76 20.11 19.54
6个月 28.27 29.32 22.42 16.86 35.02 16.90 17.19 17.13
8个月 25.40 27.35 18.81 13.22 33.67 14.87 12.90 15.32
10个月 24.67 26.14 18.09 12.51 29.00 11.76 12.09 12.63
12个月 23.32 19.88 16.18 10.55 22.54 10.08 10.74 11.24
13个月 21.72 18.90 16.03 10.21 19.67 9.98 10.21 10.12
14个月 17.46 15.51 13.70 8.00 18.22 8.95 8.89 9.33
由表4～表5可知，实施例1和实施例2连续14个月分别测试mALB的质控品，其测得的质控品的浓度变化均在第0个月初始测定浓度的约±5％以内，有良好的存储稳定性；
实施例3和实施例4连续测至第13个月，其测得的质控品的浓度变化约为第0个月初始测定值的±10％，连续测至第14个月，其测试结果约为第0个月初始测定值的±14％，S1～S2的存储稳定性显著优于S3～S4，表明R2组分中糖类物质的浓度为6～8g/L时对混合抗体的稳定效果更优；
实施例5和实施例6连续测至第12个月，其测试结果约为第0个月初始测定值的±10％，连续测至第14个月，其测试结果约为第0个月初始测定值的±25％，S1～S2的存储稳定性显著优于S5～S6，表明R2组分中离子螯合剂浓度为30～80mmol/L时对混合抗体的稳定效果更优；
实施例7～10的存储稳定性均优于S11，D1，D2，D3表明在R2组分中任选地加入离子螯合剂、糖类物质、血清白蛋白中的一种或两种均可以提高混合抗体的存储稳定性。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请通过筛选出具有不同线性上限的抗人ALB抗体1和抗人ALB抗体2，与对应的抗原发生抗原抗体反应，形成不溶性的免疫复合物，在全自动生化仪上表现为形成一定的吸光度变化值。由于竞争原理，抗体1在被测物中含有低浓度mALB抗原时更容易竞争结合，抗体2在被测物中含有高浓度mALB抗原时更容易竞争结合，竞争法使得本申请的混合抗体拓宽了检测的临床范围。
而且，通过优化试验抗体的存储液，提供了一种可使混合抗体的活性稳定14个月以上的测定mALB的试剂盒，该试剂盒通过采用普通的免疫透射比浊法即可达到胶乳免疫透射比浊法的效果，因而成本更低，生产工艺简单，且对产品的质量影响较小。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗人ALB混合抗体，其特征在于，所述混合抗体包括抗人ALB抗体1和抗人ALB抗体2，所述抗人ALB抗体1对mALB检测的线性下限为5～30mg/L，所述抗人ALB抗体2对mALB检测的线性上限为1800～2000mg/L。
2.根据权利要求1所述的抗人ALB混合抗体，其特征在于，所述抗人ALB抗体1与所述抗人ALB抗体2的质量比为1：5～4：1。
3.根据权利要求1或2所述的抗人ALB混合抗体，其特征在于，所述抗人ALB抗体1与所述抗人ALB抗体2各自独立地选自多克隆抗体、单克隆抗体或单克隆与多克隆抗体的混合抗体。
4.一种mALB的测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括抗人ALB抗体，所述抗人ALB抗体为权利要求1至3中任一项所述的抗人ALB混合抗体。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一组分，所述第一组分包括所述抗人ALB混合抗体和缓冲液；优选地，所述第一组分还包括稳定剂；优选地，所述抗人ALB混合抗体在所述第一组分中的浓度为700～1400mg/L，优选地，所述抗人ALB混合抗体在所述第一组分中的浓度为800～1000mg/L，更优选为900mg/L。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、乙二醛-HCl缓冲液及巴比妥缓冲液中的任意一种；优选地，所述缓冲液的pH值为7.0～7.8；优选地，所述缓冲液的浓度为20～100mmol/L。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述稳定剂包括电解质及防腐剂，还包括离子螯合剂、糖类物质及血清白蛋白中的一种或多种；
优选地，所述离子螯合剂为EDTA-Na2、EDTA-Na4、酒石酸钾钠及柠檬酸铵中的任一种；
优选地，所述糖类物质为海藻糖、葡聚糖、蔗糖及葡萄糖中的一种或多种；
优选地，所述血清白蛋白为牛血清白蛋白；
优选地，所述电解质为氯化钾、氯化钠、氯化镁及乙酸钠中的一种；
优选地，所述防腐剂为ProClin 300或叠氮钠中的一种。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述离子螯合剂的浓度为20～100mmol/L；
优选地，所述糖类物质的浓度为5～10g/L，更优选为6～8g/L；
优选地，所述血清白蛋白的浓度为2～5g/L；
优选地，所述电解质的浓度为10～30g/L；
优选地，所述防腐剂的浓度为0.1～0.5g/L。
9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二组分，所述第二组分包括所述缓冲液、所述稳定剂、促聚剂及表面活性剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述促聚剂为平均分子量为6000～8000的PEG；更优选所述促聚剂的浓度为20～50g/L；
优选地，所述表面活性剂选自TritonX-100、Tween-20或Tween-80；更优选所述表面活性剂在所述第二组分中的浓度为0.1～3wt％。
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