CN114277021A - 胱硫醚-β-裂解酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种胱硫醚‑β‑裂解酶及其制备方法和应用。该胱硫醚‑β‑裂解酶，包括：氨基酸序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.6所示的多肽中的一种。本研究预料不到地发现，包括氨基酸序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.6所示的多肽中的一种的胱硫醚‑β‑裂解酶兼具较高的热稳定性和酶活力。经试验验证，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的胱硫醚‑β‑裂解酶的蛋白比活力为127.4U/mg，在50℃下的半衰期为135.3min，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的胱硫醚‑β‑裂解酶的蛋白比活力为98.9U/mg，在50℃下的半衰期为31.2min。

Description

胱硫醚-β-裂解酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种胱硫醚-β-裂解酶及其制备方法和应用。
背景技术
同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)，也称高半胱氨酸，是一种带巯基的氨基酸，是蛋氨酸与半胱氨酸(L-Cys)代谢的重要中间产物。同型半胱氨酸是导致心脑血管疾病、糖半胱氨酸尿病以及神经系统病变的危险因素。血浆中同型半胱氨酸水平过高将导致高同型半胱氨酸血症，Hcy与高脂血症被认为是心血管疾病的两大诱因。血浆中同型半胱氨酸的测定已成为诊断维生素B12、叶酸缺乏及早期心脑血管等疾病的常用方法。测定Hcy是诊断各类疾病的一个重要前提。
目前，同型半胱氨酸最主要的检测方法有：高效液相色谱法(HPLC)、颗粒增强免疫透射比浊法、荧光偏振免疫法(FPIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶循环法等。其中FPIA法与HPLC法均具有较高的精密度和灵敏度，但这两种方法的成本相对较高，操作繁琐；ELISA法与循环酶法的成本较低，操作简单，而且循环酶法在全自动生化分析仪应用更为广泛。酶循环法原理是利用胱硫醚-β-合成酶催化L-丝氨酸和同型半胱氨酸形成L-胱硫醚，而L-胱硫醚又能在胱硫醚-β-裂解酶的催化作用下，形成同型半胱氨酸、丙酮酸和氨，酶循环法测定同型半胱氨酸原理图如图1所示。所以，通过表达、纯化得到高活性的胱硫醚-β-合成酶和胱硫醚-β-裂解酶是运用酶循环法测定同型半胱氨酸的关键。
1982年，Chandra M.Dwivedi等最早从大肠杆菌中克隆、纯化和表征了胱硫醚-β-裂解酶，目前传统生产一般也是从自然界产胱硫醚-β-裂解酶的微生物中扩增出胱硫醚-β-裂解酶基因，连接到表达载体中，再导入相关表达宿主，表达胱硫醚-β-裂解酶，但是这样获得的胱硫醚-β-裂解酶一般蛋白表达量较小，耐热性能较差。
1995年，Arno C.Alting等从乳酸乳球菌cremoris B78(Lactococcus lactissubsp.cremoris B78)中通过三步纯化得到CBL，其比酶活为2.1U/mg，回收率为21％，纯化倍数为150。2000年，Nada Dobric等将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ssp.cremorisMG1363)的CBL基因克隆至大肠杆菌(E.coli BL21(DE3))，得到比酶活为11.5U/mg的CBL。这些来源的胱硫醚-β-裂解酶活力较低，很难较好的适配同型半胱氨酸的试剂应用，同时胱硫醚-β-裂解酶的稳定性也会大大影响试剂的准确性。
发明内容
基于此，有必提供一种兼具热稳定性和酶活力的胱硫醚-β-裂解酶。
此外，还有必要提供一种胱硫醚-β-裂解酶的应用、重组载体及其制备方法和应用、重组工程菌及其应用。
一种胱硫醚-β-裂解酶，包括：氨基酸序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.6所示的多肽中的一种。
本研究预料不到地发现，包括氨基酸序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.6所示的多肽中的一种的胱硫醚-β-裂解酶兼具较高的热稳定性和酶活力。经试验验证，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的胱硫醚-β-裂解酶的蛋白比活力为127.4U/mg，在50℃下的半衰期为135.3min，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的胱硫醚-β-裂解酶的蛋白比活力为98.9U/mg，在50℃下的半衰期为31.2min，兼具较高的热稳定性和酶活力。
其中一个实施例中，所述胱硫醚-β-裂解酶的核苷酸序列包括：
(a)、由如SEQ ID No.2～SEQ ID No.3所示的核苷酸序列中的一种组成的多核苷酸；
(b)、与如SEQ ID No.2～SEQ ID No.3所示的核苷酸序列中的一种组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸；或，
(c)、由如SEQ ID No.2～SEQ ID No.3所示的核苷酸序列中的一种缺失、替代或增加一个或多个碱基得到的多核苷酸。
一种重组载体，含有上述胱硫醚-β-裂解酶的编码序列。
其中一个实施例中，包括如下步骤：
将上述胱硫醚-β-裂解酶的编码序列克隆到基因工程载体中，得到重组载体。
一种重组工程菌，含有上述重组载体。
其中一个实施例中，所述重组工程菌为含有所述重组载体的大肠杆菌。
一种胱硫醚-β-裂解酶的制备方法，包括如下步骤：
扩大培养上述重组工程菌，加入诱导剂继续培养，培养结束后固液分离，收集上清，得到胱硫醚-β-裂解酶。
其中一个实施例中，所述加入诱导剂继续培养的步骤中，所述诱导剂为0.05mM-0.5mM的IPTG。
其中一个实施例中，所述加入诱导剂继续培养的步骤中，诱导温度为16℃-30℃。
其中一个实施例中，所述加入诱导剂继续培养的步骤中，诱导时间为4h-16h。
其中一个实施例中，所述收集上清的步骤之后，还包括纯化所述上清的步骤，纯化所述上清的方式为：亲和层析或离子交换层析。
上述胱硫醚-β-裂解酶、上述重组载体或者上述重组工程菌在制备体外诊断试剂中的应用。
上述胱硫醚-β-裂解酶、上述重组载体或者上述重组工程菌在制备检测同型半胱氨酸的试剂中的应用。
附图说明
图1为酶循环法测定同型半胱氨酸原理图；
图2为胱硫醚-β-裂解酶蛋白空间结构图；
图3为胱硫醚-β-裂解酶突变体CBL-K17R纯化过程中的SDS-PAGE图；
图4为野生型CBL-WT、突变体CBL-K17的酶比活性和半衰期的比对图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
如无特别说明，本申请的缩写说明如下表1所示：
表1本申请的缩写说明
Figure BDA0003364403740000041
Figure BDA0003364403740000051
本申请一实施方式提供一种胱硫醚-β-裂解酶包括：氨基酸序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.6所示的多肽中的一种。
本研究预料不到地发现，包括氨基酸序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.6所示的多肽中的一种的胱硫醚-β-裂解酶兼具较高的热稳定性和酶活力。经试验验证，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的胱硫醚-β-裂解酶的蛋白比活力为127.4U/mg，在50℃下的半衰期为135.3min，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的胱硫醚-β-裂解酶的蛋白比活力为98.9U/mg，在50℃下的半衰期为31.2min，兼具较高的热稳定性和酶活力。
具体地，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的胱硫醚-β-裂解酶由野生型胱硫醚-β-裂解酶第17位的赖氨酸突变成精氨酸得到，记为CBL-K17R。氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的胱硫醚-β-裂解酶由胱硫醚-β-裂解酶突变体第17位氨基酸赖氨酸突变成组氨酸，记为CBL-K17H。
相对于野生型的胱硫醚-β-裂解酶(CBL-WT)，上述两个突变体(CBL-K17R和CBL-K17H)比活力和半衰期都有不同程度的提高。经过三位空间结构的分析如图2所示(图2为胱硫醚-β-裂解酶蛋白空间结构图)，野生型胱硫醚-β-裂解酶(CBL-WT)37位的天冬氨酸为酸性氨基酸，K17R突变为胱硫醚-β-裂解酶外围距离活性中心较近的赖氨酸突变为精氨酸，K17H突变为胱硫醚-β-裂解酶外围距离活性中心较近的赖氨酸突变为组氨酸，两性氨基酸赖氨酸突变为碱性氨基酸精氨酸和组氨酸后，会增强37位天冬氨酸和17位氨基酸的氢键作用，使得结构更稳固，从而提高了胱硫醚-β-裂解酶的比酶活和热稳定性。
其中，野生型胱硫醚-β-裂解酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。胱硫醚-β-裂解酶突变体CBL-K17R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。胱硫醚-β-裂解酶突变体CBL-K17H的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。野生型胱硫醚-β-裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
具体地，如SEQ ID No.1所示的序列(野生型胱硫醚-β-裂解酶的碱基序列)：
ATGGCTGATAAAAAGTTAGACACTCAATTGGTTAATGCCGGTCGTTCTAAAAAGTATACCCTTGGCGCAGTCAACTCCGTAATTCAGCGCGCGTCATCGCTCGTGTTTGATAGTGTTGAAGCTAAAAAGCATGCCACACGAAATCGGGCAAACGGAGAGCTATTCTACGGGAGAAGGGGTACGCTGACTCACTTTAGCTTACAACAGGCGATGTGTGAATTGGAGGGCGGAGCTGGGTGCGTCCTTTTCCCTTGTGGTGCCGCAGCGGTAGCTAATTCTATCCTCGCCTTTATAGAACAAGGCGACCATGTGCTAATGACCAACACAGCATATGAGCCCTCCCAGGATTTCTGCTCAAAAATTCTGTCGAAGTTAGGAGTTACGACTAGTTGGTTTGACCCATTGATCGGGGCGGATATAGTCAAACACCTTCAACCGAATACCAAGATTGTATTCCTCGAAAGCCCTGGTTCTATCACAATGGAGGTGCATGACGTTCCCGCTATAGTCGCCGCAGTACGTTCCGTGGTTCCAGATGCGATTATCATGATAGACAACACGTGGGCTGCCGGCGTCCTATTTAAAGCACTGGATTTCGGAATTGACGTATCAATCCAGGCGGCTACTAAGTACTTAGTGGGGCACTCGGATGCCATGATAGGTACCGCAGTTTGTAATGCGCGCTGCTGGGAACAATTGCGAGAGAACGCTTATCTTATGGGCCAGATGGTCGACGCCGATACAGCATACATTACGAGTCGGGGACTCAGAACTCTAGGGGTAAGGCTGCGTCAACATCACGAAAGCTCTTTAAAAGTGGCGGAGTGGTTGGCTGAACATCCGCAGGTTGCCCGCGTCAATCACCCTGCACTTCCCGGTTCCAAGGGCCATGAGTTTTGGAAACGAGACTTCACCGGATCATCGGGGCTCTTTAGTTTCGTACTAAAGAAAAAGCTGAACAATGAAGAGTTAGCGAACTATTTGGATAATTTTAGCCTTTTCTCTATGGCTTACTCCTGGGGTGGCTATGAATCACTCATCCTAGCCAACCAACCAGAGCACATAGCAGCGATTCGGCCGCAGGGAGAAATCGACTTTTCGGGGACACTGATAAGATTACATATTGGTTTGGAGGATGTGGACGATCTTATCGCTGACCTCGATGCCGGCTTCGCAAGGATAGTT。
如SEQ ID No.2所示的序列(胱硫醚-β-裂解酶突变体CBL-K17R的碱基序列)：
ATGGCTGATAAAAAGTTAGACACTCAATTGGTTAATGCCGGTCGTTCTAGAAAGTATACCCTTGGCGCAGTCAACTCCGTAATTCAGCGCGCGTCATCGCTCGTGTTTGATAGTGTTGAAGCTAAAAAGCATGCCACACGAAATCGGGCAAACGGAGAGCTATTCTACGGGAGAAGGGGTACGCTGACTCACTTTAGCTTACAACAGGCGATGTGTGAATTGGAGGGCGGAGCTGGGTGCGTCCTTTTCCCTTGTGGTGCCGCAGCGGTAGCTAATTCTATCCTCGCCTTTATAGAACAAGGCGACCATGTGCTAATGACCAACACAGCATATGAGCCCTCCCAGGATTTCTGCTCAAAAATTCTGTCGAAGTTAGGAGTTACGACTAGTTGGTTTGACCCATTGATCGGGGCGGATATAGTCAAACACCTTCAACCGAATACCAAGATTGTATTCCTCGAAAGCCCTGGTTCTATCACAATGGAGGTGCATGACGTTCCCGCTATAGTCGCCGCAGTACGTTCCGTGGTTCCAGATGCGATTATCATGATAGACAACACGTGGGCTGCCGGCGTCCTATTTAAAGCACTGGATTTCGGAATTGACGTATCAATCCAGGCGGCTACTAAGTACTTAGTGGGGCACTCGGATGCCATGATAGGTACCGCAGTTTGTAATGCGCGCTGCTGGGAACAATTGCGAGAGAACGCTTATCTTATGGGCCAGATGGTCGACGCCGATACAGCATACATTACGAGTCGGGGACTCAGAACTCTAGGGGTAAGGCTGCGTCAACATCACGAAAGCTCTTTAAAAGTGGCGGAGTGGTTGGCTGAACATCCGCAGGTTGCCCGCGTCAATCACCCTGCACTTCCCGGTTCCAAGGGCCATGAGTTTTGGAAACGAGACTTCACCGGATCATCGGGGCTCTTTAGTTTCGTACTAAAGAAAAAGCTGAACAATGAAGAGTTAGCGAACTATTTGGATAATTTTAGCCTTTTCTCTATGGCTTACTCCTGGGGTGGCTATGAATCACTCATCCTAGCCAACCAACCAGAGCACATAGCAGCGATTCGGCCGCAGGGAGAAATCGACTTTTCGGGGACACTGATAAGATTACATATTGGTTTGGAGGATGTGGACGATCTTATCGCTGACCTCGATGCCGGCTTCGCAAGGATAGTT。
如SEQ ID No.3所示的序列(胱硫醚-β-裂解酶突变体CBL-K17H的碱基序列)：
ATGGCTGATAAAAAGTTAGACACTCAATTGGTTAATGCCGGTCGTTCTCACAAGTATACCCTTGGCGCAGTCAACTCCGTAATTCAGCGCGCGTCATCGCTCGTGTTTGATAGTGTTGAAGCTAAAAAGCATGCCACACGAAATCGGGCAAACGGAGAGCTATTCTACGGGAGAAGGGGTACGCTGACTCACTTTAGCTTACAACAGGCGATGTGTGAATTGGAGGGCGGAGCTGGGTGCGTCCTTTTCCCTTGTGGTGCCGCAGCGGTAGCTAATTCTATCCTCGCCTTTATAGAACAAGGCGACCATGTGCTAATGACCAACACAGCATATGAGCCCTCCCAGGATTTCTGCTCAAAAATTCTGTCGAAGTTAGGAGTTACGACTAGTTGGTTTGACCCATTGATCGGGGCGGATATAGTCAAACACCTTCAACCGAATACCAAGATTGTATTCCTCGAAAGCCCTGGTTCTATCACAATGGAGGTGCATGACGTTCCCGCTATAGTCGCCGCAGTACGTTCCGTGGTTCCAGATGCGATTATCATGATAGACAACACGTGGGCTGCCGGCGTCCTATTTAAAGCACTGGATTTCGGAATTGACGTATCAATCCAGGCGGCTACTAAGTACTTAGTGGGGCACTCGGATGCCATGATAGGTACCGCAGTTTGTAATGCGCGCTGCTGGGAACAATTGCGAGAGAACGCTTATCTTATGGGCCAGATGGTCGACGCCGATACAGCATACATTACGAGTCGGGGACTCAGAACTCTAGGGGTAAGGCTGCGTCAACATCACGAAAGCTCTTTAAAAGTGGCGGAGTGGTTGGCTGAACATCCGCAGGTTGCCCGCGTCAATCACCCTGCACTTCCCGGTTCCAAGGGCCATGAGTTTTGGAAACGAGACTTCACCGGATCATCGGGGCTCTTTAGTTTCGTACTAAAGAAAAAGCTGAACAATGAAGAGTTAGCGAACTATTTGGATAATTTTAGCCTTTTCTCTATGGCTTACTCCTGGGGTGGCTATGAATCACTCATCCTAGCCAACCAACCAGAGCACATAGCAGCGATTCGGCCGCAGGGAGAAATCGACTTTTCGGGGACACTGATAAGATTACATATTGGTTTGGAGGATGTGGACGATCTTATCGCTGACCTCGATGCCGGCTTCGCAAGGATAGTT。
如SEQ ID No.4所示的序列(野生型胱硫醚-β-裂解酶的氨基酸序列)：
MADKKLDTQL VNAGRSKKYT LGAVNSVIQR ASSLVFDSVE AKKHATRNRA NGELFYGRRGTLTHFSLQQA MCELEGGAGC VLFPCGAAAV ANSILAFIEQ GDHVLMTNTA YEPSQDFCSK ILSKLGVTTSWFDPLIGADI VKHLQPNTKI VFLESPGSIT MEVHDVPAIV AAVRSVVPDA IIMIDNTWAA GVLFKALDFGIDVSIQAATK YLVGHSDAMI GTAVCNARCW EQLRENAYLM GQMVDADTAY ITSRGLRTLG VRLRQHHESSLKVAEWLAEH PQVARVNHPA LPGSKGHEFW KRDFTGSSGL FSFVLKKKLN NEELANYLDN FSLFSMAYSWGGYESLILAN QPEHIAAIRP QGEIDFSGTL IRLHIGLEDV DDLIADLDAG FARIV。
如SEQ ID No.5所示的序列(胱硫醚-β-裂解酶突变体CBL-K17R的氨基酸序列)：
MADKKLDTQL VNAGRSRKYT LGAVNSVIQR ASSLVFDSVE AKKHATRNRA NGELFYGRRGTLTHFSLQQA MCELEGGAGC VLFPCGAAAV ANSILAFIEQ GDHVLMTNTA YEPSQDFCSK ILSKLGVTTSWFDPLIGADI VKHLQPNTKI VFLESPGSIT MEVHDVPAIV AAVRSVVPDA IIMIDNTWAA GVLFKALDFGIDVSIQAATK YLVGHSDAMI GTAVCNARCW EQLRENAYLM GQMVDADTAY ITSRGLRTLG VRLRQHHESSLKVAEWLAEH PQVARVNHPA LPGSKGHEFW KRDFTGSSGL FSFVLKKKLN NEELANYLDN FSLFSMAYSWGGYESLILAN QPEHIAAIRP QGEIDFSGTL IRLHIGLEDV DDLIADLDAG FARIV。
如SEQ ID No.6所示的序列(胱硫醚-β-裂解酶突变体CBL-K17H的氨基酸序列)：
MADKKLDTQL VNAGRSHKYT LGAVNSVIQR ASSLVFDSVE AKKHATRNRA NGELFYGRRGTLTHFSLQQA MCELEGGAGC VLFPCGAAAV ANSILAFIEQ GDHVLMTNTA YEPSQDFCSK ILSKLGVTTSWFDPLIGADI VKHLQPNTKI VFLESPGSIT MEVHDVPAIV AAVRSVVPDA IIMIDNTWAA GVLFKALDFGIDVSIQAATK YLVGHSDAMI GTAVCNARCW EQLRENAYLM GQMVDADTAY ITSRGLRTLG VRLRQHHESSLKVAEWLAEH PQVARVNHPA LPGSKGHEFW KRDFTGSSGL FSFVLKKKLN NEELANYLDN FSLFSMAYSWGGYESLILAN QPEHIAAIRP QGEIDFSGTL IRLHIGLEDV DDLIADLDAG FARIV。
在其中一个实施例中，本申请的胱硫醚-β-裂解酶的核苷酸序列包括：
(a)、由如SEQ ID No.2～SEQ ID No.3所示的核苷酸序列中的一种组成的多核苷酸；
(b)、与如SEQ ID No.2～SEQ ID No.3所示的核苷酸序列中的一种组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸；或，
(c)、由如SEQ ID No.2～SEQ ID No.3所示的核苷酸序列中的一种缺失、替代或增加一个或多个碱基得到的多核苷酸。
由于同一氨基酸可由几种不同的密码子来决定，故同一氨基酸可对应不同的核苷酸序列，不同一氨基酸可对应相同的核苷酸序列。因此，本申请中的胱硫醚-β-裂解酶的氨基酸序列，由如SEQ ID No.2～SEQ ID No.3所示核苷酸序列中的一种进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列所编码得到。本领域技术人员可以根据本申请公开的胱硫醚-β-裂解酶的氨基酸序列，根据现有分子生物学技术，采用cDNA克隆和定点突变的方法或其他适合的方法获得本申请的胱硫醚-β-裂解酶，因此，编码上述胱硫醚-β-裂解酶并不仅限于如SEQ ID No.2～SEQ ID No.3所示的核苷酸序列中的一种。如果编码得到的蛋白与胱硫醚-β-裂解酶没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。
此外，由于蛋白编码序列的多态性及变异，天然存在的蛋白质会出现基因突变，编码序列中碱基被缺失、替代或增加，或氨基酸的缺失、插入、取代或其它变异，从而导致蛋白质的氨基酸序列出现一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。因此，存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质，但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。
功能等同的变异体同样适用于通过缺失、插入和突变等人工手段改变一个或多个密码子，从而向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的多肽。尽管这样能获得更多不同形式的变异体，但所得的变异体作为功能等同变异体的前提是其生理活性基本等同于原始无变异蛋白质的活性。
一般的，功能等同变异体的编码序列是同源的，因此，由至少一种改变(如蛋白质的编码序列中一个或多个碱基的缺失、插入或取代或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、插入或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白质的活性，因此，由上述核苷酸序列编码的到的多肽或上述氨基酸序列组成的多肽，如果编码得到的蛋白与胱硫醚-β-裂解酶没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。
其中一个实施例中，胱硫醚-β-裂解酶为可溶性酶或者固定化酶。
测定Hcy是诊断各类疾病的一个重要前提，而目前测定Hcy的方法中，酶循环法操作简便，精确度高。在酶循环法中，硫醚β-裂解酶(CBL)和胱硫醚-β-合成酶(CBS)是发挥关键作用的酶，测定Hcy依赖于两种酶的活性，更高的活性可以更快速准确地测定Hcy。测定时，LDH、CBL酶浓度必须准确加量，使第一步CBS酶催化的反应成为控制步骤。有了这样的前提，在一定的CBS浓度下，样品中Hcy的浓度与反应速率成正比。
试剂中活力准确定量HCY只是应用的一个基础前提，CBL酶的稳定性会决定应用试剂的检测准确性，长期储存下，某一个酶的活力下降会导致最终HCY的检测含量有较大偏差，最终会影响疾病的判断。而我们该专利的CBL稳定性突变可以较好的解决或缓解使用过程中存在的问题，保证试剂检测准确性，能够很好的通过试剂的热稳定性和准确性验证。
本申请的胱硫醚-β-裂解酶兼具较高稳定性和较高酶活力，能够应用于制备体外诊断试剂，也能够应用于制备检测同型半胱氨酸的试剂，进而提高体外诊断及同型半胱氨酸检测的准确性。其中，体外诊断试剂例如可以为诊断维生素B12、叶酸缺乏及早期心脑血管等疾病的试剂。
本申请一实施方式提供一种重组载体含有本申请上述胱硫醚-β-裂解酶的编码序列。
其中，重组载体为克隆载体或表达载体。
具体地，重组载体为含有上述胱硫醚-β-裂解酶的编码序列的pET-28a(+)质粒。需要说明的是，重组载体不限于为上述指出的载体，也可以将胱硫醚-β-裂解酶基因整合到其他载体上，例如可以为pET21b、pET22b、pET32a、pQE30等载体。
本申请一实施方式提供上述重组载体的制备方法，包括如下步骤：本申请上述的胱硫醚-β-裂解酶的编码序列克隆到基因工程载体中，得到重组载体。
其中，基因工程载体为克隆载体或表达载体。具体地，基因工程载体为pET-28a(+)质粒。需要说明的是，基因工程载体不限于为上述指出的载体，也可以为其他基因工程载体，例如可以为pET21b、pET22b、pET32a、pQE30等载体。
上述重组载体的构建方法，获得能够高表达、高稳定性和高酶活力的胱硫醚-Β-裂解酶的重组载体，能够应用于制备体外诊断试剂，也能够应用于制备检测同型半胱氨酸的试剂。其中，体外诊断试剂例如可以为诊断维生素B12、叶酸缺乏及早期心脑血管等疾病的试剂。
本研究一实施方式提供一种重组工程菌含有上述实施方式的重组载体。
上述重组工程菌能够表达兼具较高稳定性和较高酶活力的胱硫醚-β-裂解酶，能够应用于制备体外诊断试剂，也能够应用于制备检测同型半胱氨酸的试剂，进而提高体外诊断及同型半胱氨酸检测的准确性。并且构建的高效表达的重组工程菌，具有其培养周期短、培养条件简单、目的蛋白产量高、纯化简单的优点。其中，体外诊断试剂例如可以为诊断维生素B12、叶酸缺乏及早期心脑血管等疾病的试剂。
进一步地，重组工程菌为含有上述实施方式的重组载体的大肠杆菌。可选地，重组工程菌为含有上述实施方式的重组载体的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。需要说明的是，重组工程菌不限于为含有上述实施方式的重组载体的大肠杆菌，也可以使用革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母和真菌等微生物宿主进行目的蛋白的表达。
本申请一实施方式提供一种胱硫醚-β-裂解酶的制备方法，包括如下步骤：扩大培养本申请的上述重组工程菌，加入诱导剂继续培养，培养结束后固液分离，收集上清，得到胱硫醚-β-裂解酶。
其中，加入诱导剂继续培养的步骤中，诱导剂为0.05mM-0.5mM的IPTG。诱导温度为16℃-30℃。诱导时间为4h-16h。
其中，收集上清的步骤之后，还包括纯化该上清的步骤，纯化上清的方式为：亲和层析或离子交换层析。具体地，亲和层析为Ni亲和层析。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1：重组表达载体和重组菌株的构建
将本申请的胱硫醚-β-裂解酶野生型氨基酸序列经过大肠杆菌密码子优化后翻译成核苷酸序列，经人工合成基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，人工合成的胱硫醚-β-裂解酶野生型对应的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。其中，野生型胱硫醚-β-裂解酶记为CBL-WT。将目的基因片段克隆到表达载体pET-28a(+)上，其中C端设计His标签，构建重组载体。构建成功的重组表达载体转化至E.coli BL21(DE3)中，获得表达胱硫醚-β-裂解酶野生型的重组菌株。
基于同样的发明构思，将胱硫醚-β-裂解酶突变体的基因片段进行定点饱和突变后分别克隆到表达载体pET-28a(+)上，并转化至E.coli BL21(DE3)中，得到胱硫醚-β-裂解酶突变体的重组菌株。其中，胱硫醚-β-裂解酶突变体的具体情况如下：
突变体CBL-K17R：由氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的野生型胱硫醚-β-裂解酶第17位赖氨酸突变成精氨酸而得到，记为CBL-K17R。突变体CBL-K17R的氨基酸序列如SEQ IDNo.5所示。突变体CBL-K17R的碱基序列如SEQ ID No.2所示。
突变体CBL-K17H：由氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的野生型胱硫醚-β-裂解酶第17位赖氨酸突变成组氨酸而得到，记为CBL-K17H。突变体CBL-K17H的氨基酸序列如SEQ IDNo.6所示。突变体CBL-K17H的碱基序列如SEQ ID No.3所示。
突变体CBL-K17D：由氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的野生型胱硫醚-β-裂解酶第17位赖氨酸突变成甘氨酸而得到，记为CBL-K17D。
突变体CBL-K17A：由氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的野生型胱硫醚-β-裂解酶第17位赖氨酸突变成丙氨酸而得到，记为CBL-K17A。
突变体CBL-K17T：由氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的野生型胱硫醚-β-裂解酶第17位赖氨酸突变成苏氨酸而得到，记为CBL-K17T。
突变体CBL-K17D：由氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的野生型胱硫醚-β-裂解酶第17位氨基酸赖氨酸突变成天冬氨酸而得到，记为CBL-K17D。
突变体CBL-K17E：由氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的野生型胱硫醚-β-裂解酶第17位赖氨酸突变成谷氨酸而得到，记为CBL-K17E。
实施例2：胱硫醚-β-裂解酶的高效表达
挑选平板上的筛选出的单菌落，用LB液体培养基37℃过夜富集培养。取培养物以1：100的比例接种于含100mL的LB液体培养基的锥形瓶中，37℃，振荡培养至菌液OD600为0.8-1.0时，向摇瓶中加入IPTG溶液至终浓度为0.05～0.5mM，18～30℃振荡培养4～16h。4℃，5000rpm，离心5min，收集离心上清。
实施例3：胱硫醚-β-裂解酶的纯化
取上述实施例2的菌体，用50mM pH 8.0Tris-HCl buffer重悬进行超声破碎，酶液用0.22μm滤膜过滤后备用，准备一个2mL的Ni-NTA亲和层析填料柱，用10倍柱体积平衡buffer(50mM Tris-HCl,pH 8.0,0.1M NaCl)进行平衡，然后将过膜后的酶液上样，5倍柱体积的除杂buffer(20mM咪唑，50mM Tris-HCl,pH 8.7,400mM NaCl)冲洗柱子，5倍柱体积的300mM咪唑buffer洗脱目的蛋白，接着5倍柱体积的500mM咪唑buffer洗柱，收集每步纯化的过程样品，方便后续分析，将洗脱样品进行除盐超滤置换浓缩。SDS-PAGE检测上述纯化过程样品，其中图3为胱硫醚-β-裂解酶突变体CBL-K17R纯化过程中的SDS-PAGE图。
实施例4：胱硫醚-β-裂解酶的活性测定
(1)酶活定义
单位酶活定义为在规定反应条件下，每分钟合成1μmol NADH所需的酶量。
(2)试剂准备
试剂I：在50mM pH 8.0Tris-HCl缓冲液中，加入DL-胱硫醚至终浓度3.5mM，NADH至终浓度0.15mM，磷酸吡多醛至终浓度0.05mM，LDH至终浓度10U/mL.
试剂II：50mM pH8.0 Tris-HCl缓冲液。
(3)酶活测定
在1mL比色皿中加入1mL试剂Ⅰ，37℃水浴5min，加入20μL待测样品混匀，37℃反应，测定1min内的吸光度变化(ΔAs)。空白检测用酶稀释液代替待测样品，其他步骤相同，测定1min内的吸光度变化(ΔAb)。
酶活计算公式为：
Figure BDA0003364403740000171
式中：
1.02：反应液总体积(mL)；
0.02：酶液体积(mL)；
1：反应时间(min)；
df：稀释倍数；
6.22：标准反应条件下，生色基团在340nm处毫摩尔吸光系数(cm2/μmol)。
实施例5：胱硫醚-β-裂解酶的半衰期的测定
取50mM pH 8.0Tris-HCl缓冲液，将实施例3中得到超滤置换浓缩酶液稀释至浓度1mg/mL，分装至6个1.5mL离心管中，每管200μL。分别置于50℃温度下水浴0min、20min、40min、60min、80min、100min，按照上述实施例4的检测方法计算孵育后样品的活力。制作孵育时间和残余酶活的曲线，并计算出半衰期。
测试：
将实施例3纯化的各酶按照实施例4和实施例5的方法将野生型CBL-WT和突变型CBL-K17R、CBL-K17H、CBL-K17D、CBL-K17A、CBL-K17T、CBL-K17D和CBL-K17E的比酶活和半衰期测出，结果见图4和表2。图4为野生型CBL-WT、突变体CBL-K17的酶比活性和半衰期的比对图。
表2各突变体和野生型的比酶活和半衰期的比较
CBL的名称 蛋白比活力(U/mg) 50℃半衰期(min)
CBL-WT 95.2 34.1
CBL-K17R 127.4 135.3
CBL-K17H 98.9 31.2
CBL-K17D 12.5 0
CBL-K17E 5.3 0
CBL-K17G 88.9 21.5
CBL-K17A 81.2 18.7
CBL-K17T 85.5 24.9
从图4和表2可以看出，与野生型CBL-WT相比，17位氨基酸突变为碱性氨基酸的突变体CBL-K17R的酶比活力明显高于野生型CBL-WT，半衰期也明显长于野生型CBL-WT，突变体CBL-K17H的的酶比活力高于野生型CBL-WT，半衰期与野生型CBL-WT基本相当，17位氨基酸突变成中性氨基酸的CBL-K17G、CBL-K17A和CBL-K17T在比活力上与野生型差异不大，但半衰期相对都有一定程度的缩短；而17位氨基酸突变成酸性氨基酸的CBL-K17D和CBL-K17E的比活力和半衰期与野生型相比都减弱非常多。
综上，本申请的包括氨基酸序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.6所示的多肽中的一种的胱硫醚-β-裂解酶兼具较高的热稳定性和酶活力，其中，突变体CBL-K17R的蛋白比酶活大于120U/mg，50℃半衰期大于130min。本申请的胱硫醚-β-裂解酶能够应用于制备体外诊断试剂，也能够应用于制备检测同型半胱氨酸的试剂，进而提高体外诊断及同型半胱氨酸检测的准确性。
本申请获得了一种来源于大肠杆菌的重组胱硫醚-β-裂解酶，可以在大肠杆菌中高效重组表达。本申请构建了以K17为模板的一系列突变体，野生型目的基因和突变体目的基因与pET-28a(+)质粒连接，成功构建了重组表达载体pET-28a(+)-CBL或突变体质粒。本申请将质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，成功构建用于胱硫醚-β-裂解酶野生型和胱硫醚-β-裂解酶突变体表达的基因工程菌。本申请建立了准确的活力定量方法，CBL-WT和突变体的活力和稳定性准确定量，标定的活力可准确指导HCY试剂应用投料。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 武汉瀚海新酶生物科技有限公司
<120> 胱硫醚-β-裂解酶及其制备方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1185
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctgata aaaagttaga cactcaattg gttaatgccg gtcgttctaa aaagtatacc 60
cttggcgcag tcaactccgt aattcagcgc gcgtcatcgc tcgtgtttga tagtgttgaa 120
gctaaaaagc atgccacacg aaatcgggca aacggagagc tattctacgg gagaaggggt 180
acgctgactc actttagctt acaacaggcg atgtgtgaat tggagggcgg agctgggtgc 240
gtccttttcc cttgtggtgc cgcagcggta gctaattcta tcctcgcctt tatagaacaa 300
ggcgaccatg tgctaatgac caacacagca tatgagccct cccaggattt ctgctcaaaa 360
attctgtcga agttaggagt tacgactagt tggtttgacc cattgatcgg ggcggatata 420
gtcaaacacc ttcaaccgaa taccaagatt gtattcctcg aaagccctgg ttctatcaca 480
atggaggtgc atgacgttcc cgctatagtc gccgcagtac gttccgtggt tccagatgcg 540
attatcatga tagacaacac gtgggctgcc ggcgtcctat ttaaagcact ggatttcgga 600
attgacgtat caatccaggc ggctactaag tacttagtgg ggcactcgga tgccatgata 660
ggtaccgcag tttgtaatgc gcgctgctgg gaacaattgc gagagaacgc ttatcttatg 720
ggccagatgg tcgacgccga tacagcatac attacgagtc ggggactcag aactctaggg 780
gtaaggctgc gtcaacatca cgaaagctct ttaaaagtgg cggagtggtt ggctgaacat 840
ccgcaggttg cccgcgtcaa tcaccctgca cttcccggtt ccaagggcca tgagttttgg 900
aaacgagact tcaccggatc atcggggctc tttagtttcg tactaaagaa aaagctgaac 960
aatgaagagt tagcgaacta tttggataat tttagccttt tctctatggc ttactcctgg 1020
ggtggctatg aatcactcat cctagccaac caaccagagc acatagcagc gattcggccg 1080
cagggagaaa tcgacttttc ggggacactg ataagattac atattggttt ggaggatgtg 1140
gacgatctta tcgctgacct cgatgccggc ttcgcaagga tagtt 1185
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<211> 1185
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtccttttcc cttgtggtgc cgcagcggta gctaattcta tcctcgcctt tatagaacaa 300
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attatcatga tagacaacac gtgggctgcc ggcgtcctat ttaaagcact ggatttcgga 600
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<211> 1185
<212> DNA
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aaacgagact tcaccggatc atcggggctc tttagtttcg tactaaagaa aaagctgaac 960
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<210> 4
<211> 395
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Asp Lys Lys Leu Asp Thr Gln Leu Val Asn Ala Gly Arg Ser
1 5 10 15
Lys Lys Tyr Thr Leu Gly Ala Val Asn Ser Val Ile Gln Arg Ala Ser
20 25 30
Ser Leu Val Phe Asp Ser Val Glu Ala Lys Lys His Ala Thr Arg Asn
35 40 45
Arg Ala Asn Gly Glu Leu Phe Tyr Gly Arg Arg Gly Thr Leu Thr His
50 55 60
Phe Ser Leu Gln Gln Ala Met Cys Glu Leu Glu Gly Gly Ala Gly Cys
65 70 75 80
Val Leu Phe Pro Cys Gly Ala Ala Ala Val Ala Asn Ser Ile Leu Ala
85 90 95
Phe Ile Glu Gln Gly Asp His Val Leu Met Thr Asn Thr Ala Tyr Glu
100 105 110
Pro Ser Gln Asp Phe Cys Ser Lys Ile Leu Ser Lys Leu Gly Val Thr
115 120 125
Thr Ser Trp Phe Asp Pro Leu Ile Gly Ala Asp Ile Val Lys His Leu
130 135 140
Gln Pro Asn Thr Lys Ile Val Phe Leu Glu Ser Pro Gly Ser Ile Thr
145 150 155 160
Met Glu Val His Asp Val Pro Ala Ile Val Ala Ala Val Arg Ser Val
165 170 175
Val Pro Asp Ala Ile Ile Met Ile Asp Asn Thr Trp Ala Ala Gly Val
180 185 190
Leu Phe Lys Ala Leu Asp Phe Gly Ile Asp Val Ser Ile Gln Ala Ala
195 200 205
Thr Lys Tyr Leu Val Gly His Ser Asp Ala Met Ile Gly Thr Ala Val
210 215 220
Cys Asn Ala Arg Cys Trp Glu Gln Leu Arg Glu Asn Ala Tyr Leu Met
225 230 235 240
Gly Gln Met Val Asp Ala Asp Thr Ala Tyr Ile Thr Ser Arg Gly Leu
245 250 255
Arg Thr Leu Gly Val Arg Leu Arg Gln His His Glu Ser Ser Leu Lys
260 265 270
Val Ala Glu Trp Leu Ala Glu His Pro Gln Val Ala Arg Val Asn His
275 280 285
Pro Ala Leu Pro Gly Ser Lys Gly His Glu Phe Trp Lys Arg Asp Phe
290 295 300
Thr Gly Ser Ser Gly Leu Phe Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys Leu Asn
305 310 315 320
Asn Glu Glu Leu Ala Asn Tyr Leu Asp Asn Phe Ser Leu Phe Ser Met
325 330 335
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340 345 350
Glu His Ile Ala Ala Ile Arg Pro Gln Gly Glu Ile Asp Phe Ser Gly
355 360 365
Thr Leu Ile Arg Leu His Ile Gly Leu Glu Asp Val Asp Asp Leu Ile
370 375 380
Ala Asp Leu Asp Ala Gly Phe Ala Arg Ile Val
385 390 395
<210> 5
<211> 395
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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1 5 10 15
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20 25 30
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (10)

1.一种胱硫醚-β-裂解酶，其特征在于，所述胱硫醚-β-裂解酶包括：氨基酸序列如SEQID No.5～SEQ ID No.6所示的多肽中的一种。
2.根据权利要求1所述的胱硫醚-β-裂解酶，其特征在于，所述胱硫醚-β-裂解酶的核苷酸序列包括：
(a)、由如SEQ ID No.2～SEQ ID No.3所示的核苷酸序列中的一种组成的多核苷酸；
(b)、与如SEQ ID No.2～SEQ ID No.3所示的核苷酸序列中的一种组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸；或，
(c)、由如SEQ ID No.2～SEQ ID No.3所示的核苷酸序列中的一种缺失、替代或增加一个或多个碱基得到的多核苷酸。
3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1-2任一项所述的胱硫醚-β-裂解酶的编码序列。
4.权利要求3所述的重组载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1-2任一项所述的胱硫醚-β-裂解酶的编码序列克隆到基因工程载体中，得到重组载体。
5.一种重组工程菌，其特征在于，含有权利要求3所述的重组载体。
6.根据权利要求5所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌为含有所述重组载体的大肠杆菌。
7.一种胱硫醚-β-裂解酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
扩大培养权利要求5-6任一项所述的重组工程菌，加入诱导剂继续培养，培养结束后固液分离，收集上清，得到胱硫醚-β-裂解酶。
8.根据权利要求7所述的胱硫醚-β-裂解酶的制备方法，其特征在于，所述加入诱导剂继续培养的步骤中，所述诱导剂为0.05mM-0.5mM的IPTG；
及/或，所述加入诱导剂继续培养的步骤中，诱导温度为16℃-30℃；
及/或，所述加入诱导剂继续培养的步骤中，诱导时间为4h-16h。
9.根据权利要求7所述的胱硫醚-β-裂解酶的制备方法，其特征在于，所述收集上清的步骤之后，还包括纯化所述上清的步骤，纯化所述上清的方式为：亲和层析或离子交换层析。
10.权利要求1～2任一项所述的胱硫醚-β-裂解酶、权利要求3所述的重组载体或者权利要求5-6任一项所述的重组工程菌在制备体外诊断试剂或者检测半胱氨酸的试剂中的应用。
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