CN107589109B

CN107589109B - 一种提高试剂稳定性的方法、及其稳定试剂

Info

Publication number: CN107589109B
Application number: CN201711088834.2A
Authority: CN
Inventors: 姜敏
Original assignee: Beijing Beijian Xinchuangyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Beijian Xinchuangyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2037-11-08
Also published as: CN107589109A

Abstract

本发明提供了一种提高试剂稳定性的方法、及其稳定试剂。本公开的试剂包含表面活性剂、蛋白稳定剂、和防腐剂的特定组合，从而有效改善NADH指示系统体外诊断试剂的热稳定性、机载稳定性、运输稳定性，可有效延长试剂盒的保存时间。

Description

一种提高试剂稳定性的方法、及其稳定试剂

技术领域

本申请涉及生物化学和临床检验领域。更具体而言，本申请涉及一种用于测定丙氨酸氨基转移酶的试剂。

背景技术

丙氨酸氨基转移酶(Alanineaminotransferase，ALT)主要存在于血液和相关组织中。细胞内浓度高于血清浓度1000至3000倍，只要有1％的肝组织发生破坏，就可以使血清中浓度升高1倍，被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。测定ALT的活性对中毒性肝炎、病毒性肝炎、肝硬变活动期、肝癌、阻塞性黄疸、脂肪肝、胆管炎和胆囊炎、心肌梗塞、心肌炎、心血管疾病、骨骼肌疾病、内脏和肌肉炎症性坏死等的诊断具有重要价值(《临床肝病实验诊断学》，ISBN9787802312470)。

ALT检测方法众多，国内过去多使用比色法检测血液ALT，目前主要开展的为酶偶联的连续检测法(也作速率法)。目前ALT普遍采用各种大型全自动生化分析仪检测。比色法操作简单，不需要特殊的仪器和试剂，但结果不够准确、重复性差。速率法结果准确，是公认的好方法，但是对仪器和试剂有一定的要求(于宏伟，唐贫初；速率法测定血清ALT及其试剂盒的配制，《南京军医学院学报》1999(1):12-14；丙酮酸氧化酶法测定ALT及其试剂盒的配制.倪星忠等人，上海医学检验杂志1996)。

CN104404127A中公开了一种单试剂的丙氨酸氨基转移酶检测试剂，其组成包括以下组分：50mmol/L Tris缓冲液pH＝7.8；500mmo1/L的L-丙氨酸；8g/L氯化钾；10mmol/L的EDTA.Na2；6g/L海藻糖；6g/L牛血清白蛋白；6g/L二硫苏糖醇；6g/L EMERGEN A-60；1ml/L的Proclin-300；15mmo1/L的α-酮戊二酸；1200U/L的乳酸脱氢酶；0.18mmo1/L的NADH。该试剂的7天37℃热稳定性、以及15天的开瓶稳定性都优于对照组试剂。CN104404127A中选用了Tris-EDTA.Na₂缓冲体系，有效去除试剂中重金属离子对NADH的干扰，二硫苏糖醇和氯化钾减缓了NADH在试剂中的衰减，提高了NADH的稳定性；同时试剂中还添加了BSA和EMERGEN A-60保护剂，能够有效的提高了LDH生化试剂的稳定性。

CN106501514A中所公开的ALT检测试剂盒加入酶保护剂、稳定剂，提高了丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒的稳定性。具体而言，CN106501514A公开了一种丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒，由试剂1和试剂2组成。其中，试剂1的组成和成份如下：120mmol/L-180mmol/LTris-HCl缓冲液PH＝8.4；650mmol/L-850mmol/L的L-丙氨酸；0.2mmol/L-0.4mmol/L NADH；2000U/L-3000U/L乳酸脱氢酶LDH；酶保护剂(0.5％-1.5％BSA、甘油、或葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖)；稳定剂(KCl和表面活性剂的组合物)；防腐剂。试剂2的组成和成份如下：60mmol/L-100mmol/L Tris-HCl缓冲液PH＝7.2；35mmol/L-55mmol/L的α-酮戊二酸；稳定剂(KCl和表面活性剂的组合物)；防腐剂。其中，所述的表面活性剂选自：Tween-20、Tween-80、曲拉通X-100、PEG 6000及PEG 8000中的一种或多种；0.5％-1.5％。CN106501514A中公开的试剂盒，于37℃中可稳定一周，代表2-8℃保存可以稳定一年。

对于诊断试剂的稳定性研究，本领域常采用加速稳定性实验来预测产品的失效期(用于评价货架稳定性，有时也被称作长期稳定性或者有效期)。这样的方法优点在于研究周期短(通常数周即可)，不用真正地将试剂存放1年、2年、甚至更长的时间。但是，加速稳定性的理论基础是阿伦尼乌斯公式(Arrhenius equation)。为了确保预测的准确性，要想适用该公式，则对试剂有着较多的要求。这是一种理想状态下的预测。然而，生化试剂的成分复杂、种类繁多，并不是任何试剂都能完美地适用加速稳定性实验来预测其真正效期。

除此外，试剂的稳定性，不应当狭义地理解为货架稳定性(长期稳定性)。这是因为，试剂在实际操作使用中，并不是单纯地静置在环境条件恒定的库房当中(恒定的温湿度、避免光照直射、无震动)，而是可能暴露在变化的环境中。例如，在运输过程中(搬运、颠簸)，会接触到机械力的作用，也会遇到温度上的变化(尽管可以采用冷链运输，也无法避免温湿度时刻恒定)。再比如，在临床机构中，样本的检测都是在大型设备(生化分析仪)上进行。这种操作方式允许多个样本(从数十个至上百个样本)依次或同时检测。那么，试剂将会被从其稳定的储存环境中脱离出来，并且打开包装上机待用。这个过程同样无法避免温湿度的变化，并且样本开盖后接触空气，面临着氧化的因素。因此，这种情况下，加速稳定性实验无法评价其它方面的稳定性(ISO标准23640-2011，In vitro diagnostic medicaldevices-Evaluation of stability of in vitro diagnostic reagents)。

现在市面上多采用双试剂的酶偶联的连续检测方法检测血清ALT，由于试剂中酶和NADH的存在，使得试剂在运输过程中以及在打开瓶盖上机操作时不稳定，这为检测血清ALT带来困难。

鉴于上述需求，本领域仍然需要一种稳定性强的双试剂血液丙氨酸氨基转移酶检测试剂。

发明内容

根据本申请的一些实施方式，提供了一种用于测定样本中丙氨酸氨基转移酶的试剂盒，其包含第一试剂和第二试剂。

在一些实施方式中，第一试剂包含：

在一些实施方式中，第二试剂包含：

TRIS，pH 6.5 100mmol/L

L-丙氨酸 1500mmol/L

α-酮戊二酸 45mmol/L。

在一些实施方式中，本申请的试剂盒用于检测样本中丙氨酸氨基转移酶的含量。在一些实施方式中，样本选自以下的任一项：血清、血浆、尿液、全血。

在一些实施方式中，第一试剂包含：

在一些实施方式中，第一试剂包含：

在一些实施方式中，第一试剂包含：

在一些实施方式中，本申请的试剂盒还包含质控品和/或校准品。

在一些具体的实施方式中，质控品可以是自行配制的，也可以是市售产品；例如朗道生化多项质控品。

在一些具体的实施方式中，校准品可以是自行配制的，也可以是市售产品；例如朗道生化多项校准品。

根据本申请的一些实施方式，还提供了一种制备丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒的方法，包括：

步骤1)提供第一试剂，所述第一试剂包含：

步骤2)提供第二试剂，所述第二试剂包含：

TRIS，pH6.5 100mmol/L

L-丙氨酸 1500mmol/L

α-酮戊二酸 45mmol/L；

步骤3)将所述第一试剂和所述第二试剂组装成试剂盒；

步骤1)和步骤2)顺序可互换。

在一些其它实施方式中，本申请的制备方法还包括并入选自以下任一项的步骤：质控品、校准品、使用说明书、或其组合。

在一些实施方式中，还提供了一种制备丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒的方法，包括以下步骤：

步骤1)提供第一试剂：

-用100ml烧杯称量TritonX-100，加水在电磁炉上加热溶解后，放在室温(18-40摄氏度)下，冷却至室温备用；

-在1L烧杯中加入800ml的水，称取TRIS、EDTA放入水中，搅拌溶解，用4mol/L的HCL调节pH值至8.9±0.05，依次量取Proclin、BSA溶于以上溶液，搅拌溶解，加入TritonX-100溶液搅拌均匀；

-称量LDH、NADH加入到上述溶液中，缓慢搅拌至溶解，并定容至1L，混匀为第一试剂。

步骤2)提供第二试剂：

-1L烧杯中加入800ml的水，称取TRIS、L-丙氨酸、α-酮戊二酸放入水中，搅拌溶解，用4mol/L的HCL调节pH值至6.5±0.05，并定容至1L，混匀为第二试剂。

根据本申请的一些实施方式，还提供了一种用于提高丙氨酸氨基转移酶检测试剂的稳定性的方法，包括步骤：

步骤1)按照以下成分，制备第一试剂：

步骤2)向步骤1)的所述第一试剂中加入0.1g/L至5g/L TritonX-100、0.5g/L至5g/L BSA以及0.5ml/L至1ml/L的Proclin；

任选地，步骤3)按照以下成分，制备第二试剂：

TRIS，pH6.5 100mmol/L

L-丙氨酸 1500mmol/L

α-酮戊二酸 45mmol/L；

所述步骤3)在步骤1)之前或步骤2)之后。

在一些实施方式中，所述的Proclin是PC300或PC950。

附图说明

图1：加速稳定性实验中，试剂的空白吸光度。

图2：加速稳定性实验中，高值样本测量结果。

图3：长期稳定性实验，试剂的空白吸光度结果。

图4：机载稳定性实验，试剂的空白吸光度结果。

具体实施方式

一.实验原料：

二.仪器：

东芝-40全自动生化分析仪。

实施例1：对比试剂盒的配制

第一试剂R1：

第二试剂R2：

TRIS，pH6.5 100mmol/L

L-丙氨酸 1500mmol/L

α-酮戊二酸 45mmol/L

实施例2：测试试剂盒的配制

第二试剂R2的配制方法同实施例1；第一试剂R1的配制方法参见表1。

表1.不同测试试剂盒的R1试剂组成

测试例

测试例1.加速稳定性(也作热稳定性)

1.生化分析仪设置参数：

分析方法：速率法；反应方向：负；

主波长：340nm；副波长：405nm；

温度：37℃；样本量：12μl；

试剂1：200μl；试剂2：100μl；

迟延时间：90s；测量时间：90s。

2.试剂空白吸光度：参见图1、表2。

3.高值样本：参见图2、表3。

4.结果分析：各组试剂的空白吸光度差异显著。实例11的试剂效果最好，空白吸光度较对照试剂盒好很多，变化幅度最小，最稳定。线性也是变化最小的，下降在1％范围内。

表2.空白吸光度

表3.线性高值

测试例2.长期稳定性(也作货架稳定性)

1.测试方法：试剂原包装保存于2-8℃条件下。每隔一个月检测一次，共6个月。

2.试剂空白吸光度：参加图3和表4。

3.结果分析：各组试剂的空白吸光度差异显著。实例11试剂盒的效果最好，变化幅度最小，最稳定。

表4.长期稳定性6个月的检测结果

测试例3.运输稳定性

1.运输稳定性的测试方法：试剂在夏季和冬季分别将试剂盒物流快递至最冷和最热的地区，物流返回后与2-8℃条件下保存的试剂进行对照测定。

2.试剂空白吸光度如表5所示。

表5.运输稳定性

各组试剂的空白吸光度差异显著。实例11的效果最好，变化幅度最小，最稳定。

测试例4.机载稳定性

1.测试方法：试剂在全自动生化分析以上检测合格后，机器连续运转，试剂敞口放置在仪器中，前一个月每半个月检测一次，后两个月每个月检测一次，检测至90天。

2.结果见图4和表6。各组试剂的空白吸光度差异显著。实例11的效果最好，变化幅度最小，最稳定。

表6.机载稳定性

Claims

1.一种用于测定样本中丙氨酸氨基转移酶的试剂盒，其包含：

第一试剂、和第二试剂；

第一试剂由以下组成：

第二试剂由以下组成：

TRIS，pH6.5 100mmol/L

L-丙氨酸 1500mmol/L

α-酮戊二酸 45mmol/L。

2.根据权利要求1所述的用于测定样本中丙氨酸氨基转移酶的试剂盒，其中所述样本选自以下任一项：血清、血浆、尿液、全血。

3.根据权利要求1所述的用于测定样本中丙氨酸氨基转移酶的试剂盒，其还包含质控品和/或校准品。

4.一种制备丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒的方法，包括步骤：

1)按照以下组成提供第一试剂，其中所述第一试剂由以下组成：

2)按照以下组成提供第二试剂，所述第二试剂由以下组成：

TRIS，pH6.5 100mmol/L

L-丙氨酸 1500mmol/L

α-酮戊二酸 45mmol/L；

3)将所述第一试剂和所述第二试剂组装成试剂盒；

4)还包含选自以下的任一项或组合：质控品、校准品、使用说明书。