CN112067815B - 一种检测小分子半抗原的均相免疫方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了抗原检测领域，具体涉及一种检测小分子半抗原的均相免疫方法，以噬菌体为竞争抗原，抗体标记的多枝状胶体金为动态光散射信号增强探针，以胶体金溶液的平均水化动力学粒径变化作为动态光散射信号输出，构建直接竞争动态光散射均相免疫检测小分子半抗原的方法。本发明提供的方法检测灵敏度高，胶体探针的稳定性强，抗体‑抗原的结合效率高，洗涤和分离的步骤少，操作更简单，免疫学反应效率更高。
Description
技术领域
本发明涉及抗原检测技术领域，进一步涉及动态光散射均相免疫学分析的抗原检测技术，具体涉及一种检测小分子半抗原的均相免疫方法。
背景技术
免疫学分析方法是基于抗原与抗体之间特异性识别和可逆性结合反应而发展起来的简单、快速、灵敏的检测技术。由于免疫分析具有特异性强、灵敏度高、操作简单、费用低和适于现场大批量样品筛选等优点，目前免疫学分析方法已广泛应用于临床诊断(如核酸、生物标志物蛋白等)、环境检测(如细菌、农药、兽药、环境激素、重金属污染物等)及食品安全(如食源性真菌毒素、致病菌、食品添加剂等)等分析领域。
传统酶联免疫吸附法，因其技术条件要求低、携带方便、操作简便和经济、有效期长、特异性强、可实现大批量检测、且易商品化等优点，常以试剂盒的形式出现，已经成为了应用最为广泛和发展最为成熟的生物检测与分析技术。其中，直接竞争酶联免疫吸附法因其简单快速在小分子半抗原的检测中扮演了重要的角色。然而，传统的直接竞争酶联免疫吸附法具有三个明显的缺点：一、采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶催化化学底物显色作为信号输出，然而显色底物往往摩尔消光系数低进而导致灵敏度较低；二、需要通过物理/化学方法制备酶标抗原并且酶标抗原或竞争抗原与抗体的亲和力相对较高导致竞争抗原很难被目标分析物竞争，从而导致灵敏度偏低；三、传统酶联免疫法需要通过反复的孵育和洗涤步骤进行分离，步骤繁琐；另外，非均相的固-液反应模式使得抗原抗体的结合效率不高，导致灵敏度降低。因此，提高检测信号的灵敏度或降低竞争抗原对抗体的亲和力，简化操作步骤且提高免疫学结合效率可以有效地提高传统直接竞争酶联免疫吸附法的灵敏度。
在传统直接竞争酶联免疫吸附法中，竞争抗原的制备是通过将小分子半抗原与载体蛋白(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)偶联。由于载体蛋白的尺寸较小，导致竞争抗原与相应抗体的亲和力较高，无法被待测物竞争。相对于载体蛋白，噬菌体具有更大的尺寸和重量，在相同的温度下，其布朗运动更慢。噬菌体结合抗体的识别位点仅存在于端位～6nm宽的pVIII蛋白表面，使得使用噬菌体作为小分子半抗原的竞争抗原，不仅识别抗体，且亲和力更低，从而更容易被目标分析物竞争，进而获得更高的检测灵敏度。此外，使用噬菌体作为竞争抗原避免了因交联反应造成的信号不稳定及假阳性实验结果的出现，更有效地规避了传统化学合成或生物合成抗原类似物的局限性，如操作复杂繁琐、费时费力以及偶然性大等。
而均相免疫法，只需通过简单地将信号输出探针与样品混合，无需另外的洗涤及分离步骤即可实现目标物的检测。信号的变化依赖于信号探针与目标物通过免疫学反应的识别的反应。与已被广泛接受的酶联免疫吸附法相比，均相免疫分析方法具有操作简单、方便、经济以及响应快速等特点。基于以上优点并结合近年来一些更灵敏的检测信号(如等离子共振、拉曼散射光谱、动态光散射信号、荧光信号、化学发光信号、电化学信号、压力信号、等离子共振信号等)发展起来的均相免疫分析法已成为现场及时检测领域最具竞争性的分析检测平台。其中，基于动态光散射的均相免疫传感器因其超高的灵敏度及特异性，受到了越来越多的关注。目前，基于动态光散射的均相免疫传感器已经被广泛应用于检测各种化学和生物目标物，包括小分子化合物，蛋白质和微生物等。
胶体金因其独特的物理化学及光学性质，已经被广泛应用于制备各种各样的传感器。前期研究报导表明，球形胶体金的光散射强度比相同粒径的聚合物微球高2-3个数量级，因此强的光散射信号能够有效地遮蔽复杂样品基质产生的干扰信号，同时，因胶体金表面易于修饰的优势，胶体金已被作为一种理想的信号探针广泛应用作基于动态光散射传感器中的信号增强器。同时，随着胶体金粒径的增加，其光散射截面持续增大；且当胶体金粒径超过80纳米时，其散射能力急剧增加，因此，在动态光散射传感器中使用大粒径的胶体金能够产生更强的光散射信号。另外，我们前期研究表明，多枝状的胶体金(形貌类似于球状表面上分布着放射状的尖锐分枝或粗糙凸起等，由于形状不同可分为星形，多角形，海胆形等)由于其表面尖端-尖端及核心局域电磁场增强的立体表面，赋予了其比同粒径球状胶体金更强的稳定性及更强的光散射能力。因此，更适于用作动态光散射传感器中的信号探针。目前多枝状胶体金的优良特性使其越来越受广大关注，并逐渐应用于电化学技术、能量转移技术、免疫层析技术及其他检测技术。本发明提出使用大尺寸的噬菌体替代传统的以载体蛋白偶联小分子半抗原制备竞争抗原，以多枝状胶体金作为抗体载体，同时作为动态光散射传感器中信号输出探针，用于构建检测小分子化合物的直接竞争动态光散射均相免疫分析方法。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种针对小分子半抗原的检测方法，以解决现有技术的小分子半抗原传统酶联免疫吸附法检测灵敏度偏低、标记繁琐，抗原抗体反应基于半固相界面反应效率低、不易被目标抗原所竞争、信号不稳定及假阳性信号等问题。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种针对小分子半抗原的检测方法，该方法属于直接竞争免疫分析法，该方法是针对小分子半抗原的检测，该方法中用于标记抗体的载体是多枝状胶体金，标记了抗体的多枝状胶体金同时作为动态光散射传感器的信号探针；该方法中用作竞争抗原的是从七肽库中淘选的小分子半抗原相对应的噬菌体，该方法以动态光散射信号作为信号输出。
包括以下步骤：
(1)以表面修饰羧基链的多枝状胶体金为载体采用EDC一步法将小分子特异性单克隆抗体标记于多枝状胶体金表面，获得抗体标记的多枝状胶体金；
(3)通过噬菌体随机七肽库淘选出针对小分子抗体特异性的噬菌体，获得噬菌体竞争抗原；
(3)在抗体标记的多枝状胶体金溶液中加入噬菌体竞争抗原和待测溶液，37℃反应15-200min后于马尔文纳米粒度仪上测定溶液的平均水化动力学直径，利用水化动力学直径变化测定反应待检样品中小分子半抗原的含量。
进一步地，步骤(1)中所述抗体标记的多枝状胶体金的制备方法为：利用胶体金种子介导生长法合成多枝状胶体金溶液，将合成的胶体金溶液离心后，以pH 9.0-11.0的超纯水置换，加入巯基-羧基双亲链，室温旋转搅拌4～12h；混合溶液离心，去除多余链，获得表面巯基羧基双亲链的多枝状胶体金；将表面巯基羧基双亲链的多枝状胶体金加入到pH7.5PB(0.01mol/L)缓冲液中，加入小分子抗体，室温下搅拌反应，加入EDC后，搅拌补加两次，加入质量体积分数为10％的牛血清白蛋白，并加入EDC，室温搅拌30分钟后，离心将偶联了抗体的多枝状胶体金分离下来，获得抗体标记的多枝状胶体金。
进一步地，步骤(2)通过随机七肽库淘选相应小分子抗体特异性的噬菌体，包括以下操作：以驴抗鼠抗体0.1mL(0.03mg/mL)4℃包被两孔微孔板，洗板后，封闭向第一孔中加入噬菌体随机七肽库，第二孔中加入小分子半抗原相应的抗体，结合后，取第一孔中的上清液加入到第二孔中，孵育后，酸洗脱，取出洗脱液并用中和液中和至溶液pH值为中性；接着对得到的洗脱液进行扩增，即可得到大量高浓度特异性的噬菌体；加入25％的甘油，于-20℃冰箱中保存备用。
进一步地，取步骤(1)中获得的抗体标记的多枝状胶体金，用PBS梯度稀释后，测定溶液的平均水化动力学直径，取溶液平均水化动力学直径稳定的最低浓度为胶体金探针的使用浓度；在此胶体金探针的使用浓度下，测定不产生动态光散射信号的噬菌体竞争抗原的用量。
该水化动力学直径变化即用于测定反应待检样品中小分子半抗原的含量，实际操作中可利用已知浓度且呈梯度分布的小分子半抗原标准溶液，通过以上方法绘制免疫学竞争抑制率(免疫学竞争抑制率(％)＝(1-D/D0)×100％，其中D0为第一个标准(0标准)的平均水化动力学粒径值，D为标准品或样本的平均水化动力学直径)—小分子半抗原浓度的标准曲线，再利用待测样品的粒径变化值计算出相应的免疫学竞争抑制率，然后从标准曲线中计算待测样品的小分子半抗原含量。具体操作方法可以依据本技术领域的一般技术常识任意选择。上述梯度分布的小分子半抗原的标准液，可以分别选择0g/mL、0.19pg/mL、0.39pg/mL、0.78pg/mL、1.56pg/mL、3.12pg/mL、6.25pg/mL、12.5pg/mL、25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、1000pg/mL。
进一步地，通过棋盘滴定法确定抗体标记的多枝状胶体金中抗体的标记量、以及步骤(3)中噬菌体竞争抗原的用量。
在该优选技术方案中：各缓冲液及复溶液在使用前均需经0.22μm滤膜过滤后再使用。
该方法中信号输出底物为多枝状胶体金。1)当溶液中小分子化合物浓度为零甚至极低时，作为竞争抗原的小分子噬菌体竞争性地与多枝状胶体金表面的抗体结合，形成噬菌体“包裹”在多枝状胶体金表面的化合物，由于噬菌体大的粒径的特点，此时溶液的平均水化动力学直径增加到最大值；2)当溶液中小分子化合物浓度高时，小分子化合物竞争性地与多枝状胶体金表面的抗体结合，形成小分子化合物“包裹”在多枝状胶体金表面的化合物，由于小分子化合物粒径小的特点，此时溶液的平均水化动力学直径最小；3)随着小分子化合物浓度的变化，溶液的平均水化动力学直径出现线性变化，最终实现小分子化合物的定量、灵敏检测。
本方法适用于小分子半抗原的定量检测，如真菌毒素、农药、兽药、环境激素、违禁食品添加剂以及具有生理活性的化学物质等，特别是适合于目标分析物的痕量检测。样品处理按照常规处理方法即可。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明多枝状胶体金具有比同粒径、同浓度的球状胶体金更大的光散射截面，因此低浓度的多枝状胶体金探针即可极大地提高动态光散射分析法的光散射信号强度；另一方面，噬菌体具有识别特异性抗体的功能，且识别单元位于pVIII蛋白端位，避免了反应过程中因交联造成的假阳性实验结果；同时更大的纳米尺度(宽～6纳米，长～800纳米)，使噬菌体在与抗体标记的纳米探针结合后，可以产生较常规蛋白质(通常十几个纳米左右)更大的粒径变化，从而拓宽动态光散射信号的调控范围；同时，大尺寸的空间效应降低了竞争抗原与抗体的亲和力；此外，用噬菌体替代传统酶联免疫反应中有毒的酶标抗原作为竞争抗原，建立相应的无毒检测体系，更有利于生产过程中操作人员及环境的安全。提高探针的光散射强度和竞争抗原的纳米尺寸、降低抗体的用量及竞争抗原与目标抗体的亲和力均有利于提高竞争免疫分析方法的检测灵敏度；此外新方法与传统的竞争免疫分析法相比，只需加样混合后测试即可，不需要反复的洗涤及分离过程，因此操作更为简便，试剂更易保存且具有更高的检测灵敏度。
附图说明
图1为本发明方法原理示意图；
图2为赭曲霉毒素A的基于多枝状胶体金的动态光散射均相免疫分析的标准曲线；
图3为对硫磷基于多枝状胶体金的动态光散射均相免疫分析的标准曲线；
图4为恩诺沙星基于多枝状胶体金的动态光散射均相免疫分析的标准曲线；
图5为19-去甲睾酮基于多枝状胶体金的动态光散射均相免疫分析的标准曲线；
图6为三聚氰胺基于多枝状胶体金的动态光散射均相免疫分析的标准曲线；
图7为1，25-二羟基维生素D基于多枝状胶体金的动态光散射均相免疫分析的标准曲线。
具体实施方式
下为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
磷酸盐缓冲液(PBS，0.05M，pH 7.4)的配置方法：NaCl 40g，Na2HPO4 13.5g,KH2PO41.0g，KCl 1.0g溶于1L超纯水中。用0.1M NaOH调pH值至8.0～9.0。
实施例中所涉及的鼠源性IgG类单克隆抗体：抗赭曲霉毒素A单克隆抗体，抗对硫磷单克隆抗体、抗恩诺沙星单克隆抗体、抗19-去甲睾酮单克隆抗体、抗三聚氰胺单克隆抗体及抗1，25-二羟基维生素D单克隆抗体，均由无锡中德伯尔生物技术有限公司提供，本实验所涉及的所有小分子半抗原均购买自Sigma公司。
实施例1检测小分子半抗原含量的应用
1羧基修饰的多枝状胶体金的制备
1)以高温一步法合成多枝状胶体金；将100mL超纯水体系加热至57℃，磁力搅拌器上缓慢搅拌，关热再依次加入2.5mL 60nm种子金、1.5mL l％HAuCl4溶液、2.64mL 1％柠檬酸三钠溶液，此时加快转速，同时迅速一次性加入30mmol/L对苯二酚溶液24mL，继续反应l0min，冷却至室温，4℃保存备用。
其中60nm种子金的合成方法：a)柠檬酸还原法合成18-20nm胶体金，1mL 1％氯金酸溶液加入99mL超纯水中，缓慢匀速搅拌条件下加热至沸腾(约20min出现大气泡)；b)迅速加入2.7mL 1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7)溶液，快速搅拌10min；待溶液颜色变为酒红色并且不再发生变化时，停止加热，搅拌条件下冷却至室温，4℃保存备用。c)取b)中合成的胶体金1mL加入到100mL超纯水溶液中，剧烈搅拌，再加入0.8mL 1％(质量体积分数)的氯金酸溶液，待搅拌均匀后快速加入0.2mL 1％(w/v)的柠檬酸三钠溶液和0.1mL对苯二酚溶液(30mM)作为反应体系的还原剂，每隔10min同上加入两种还原剂，循环5次。室温搅拌30min后，4℃保存备用。
2)将合成的胶体金溶液离心后，以pH 9.0-11.0的超纯水置换，加入巯基-羧基双亲链，室温旋转搅拌4～12h；取10mL上述合成的多枝状胶体金，3000rpm/min，于4℃离心15min，将沉淀用1mL pH＞9的超纯水溶液复溶，加入20μg双亲性巯基羧基链，室温下置于垂直混合仪上搅拌反应4h。
3)将步骤2)中的混合溶液离心，转速3000rmp/min，时间15分钟，去除多余链，并将表面接了双亲链的多枝状胶体金复溶于超纯水中，于4℃冰箱中保存，备用。
2抗体标记的多枝状胶体金探针的制备
取12μL上述修饰了巯基羧基双亲链的多枝状胶体金加入到500μL pH 7.5PB(0.01mol/L)缓冲液中，加入6～12μg小分子抗体，室温下搅拌反应30分钟；继续搅拌反应，加入0.25μg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐后，室温搅拌30分钟，补加两次，加入50μL质量体积分数为10％的牛血清白蛋白，并加入0.25μg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。室温搅拌30分钟后，通过离心的方式将偶联了抗体的多枝状胶体金分离下来，分离后的多枝状胶体金用超纯水洗涤三次。洗涤后的多枝状胶体金重新溶解在超纯水中4℃保存。
3小分子噬菌体竞争抗原的制备
采用随机七肽库淘选相应小分子抗体特异性的噬菌体，具体包括以下操作：
1)以驴抗鼠抗体0.1mL(0.03mg/mL)4℃包被两孔微孔板，4℃冰箱中过夜反应；
2)用0.01M TBST洗板3次，加入0.3mL 5％的BSA溶液，37℃反应1h(第二轮和第四轮用5％OVA，第三轮与本次一样)；
3)0.01M TBST洗涤3次，其中第一孔中加入10μL噬菌体随机七肽库(约2×1011噬菌体离子)以及90μL TBS，37℃孵育1h；第二孔加入小分子半抗原相应的抗体100μL(2μg/mL)，37℃孵育1h；
4)第二孔用0.1％TBST洗涤3次，取第一孔中的上清液加入到第二孔中，37℃继续孵育1h；
5)第二孔用0.1％TBST洗涤10次(第二轮到第四轮吐温20的含量分别为0.2％、0.3％、0.5％)，加入甘氨酸-盐酸酸性洗脱液100μL，室温下轻摇震荡8分钟洗脱噬菌体，吸出洗脱液，加入100μL的中和缓冲液直至溶液pH值为中性。
6)将步骤5)得到的洗脱液加至20mL处于对数生长前期的大肠杆菌Escherichiacoli ER2738培养液中进行扩增培养，37℃，4.5小时；
7)将步骤6)中的扩增液体置于离心机中，4℃，6000r/min，离心10分钟，去除沉淀(大肠杆菌Escherichia coli ER2738细胞和细胞碎片)，取80％的上清液中加入1/5体积的PEG/NaCl(含20％PEG-8000,2.5mol/L NaCl)，4℃沉淀过夜；
8)取7)中沉淀过夜后的溶液离心，9000r/min，15分钟，将白色沉淀用1mL TBST重悬，重悬液再加入1/5体积的PEG/NaCl，4℃冰箱中放置1小时后，4℃离心15分钟，去除上清液，沉淀用200μL TBST重新悬浮后获得噬菌体扩增液；
9)对步骤8)所得噬菌体扩增液进行滴度测定：
a)挑Escherichia coli ER2738单菌落于5mL试管中，37℃，摇床培养6～12h至对数中期(600纳米处吸光值约为0.5)，用LB培养基10倍系列稀释待测噬菌体；
b)将到达对数中期的大肠杆菌培养物分装到2mL离心管中，然后分别加入10μL不同稀释度的噬菌体迅速震荡混匀，室温温育1～5分钟；
c)将步骤b)得到的被噬菌体侵染的大肠杆菌细胞加入到在45℃预温的顶层琼脂培养管中，立即震荡混匀，每次一管，立即倾注到已在37℃预温的LB/IPTG/X-gal平板上。适当地倾斜平板使顶层琼脂在LB平板上均匀铺开。待平板冷却5分钟后，倒置于恒温培养箱中过夜培养。
d)平板计数。仔细检查平板，在少于100个蓝色斑点的平板上进行计数，然后将平均数乘以稀释倍数即可得到10μL液体中噬菌体的滴度。
4检测小分子半抗原的含量
本发明新型动态光散射均相免疫检测方法用于检测小分子半抗原含量时，通过以下步骤实施：样品前处理、用本发明检测方法进行检测、分析结果。
1)样品前处理：将买来的小分子半抗原标准品稀释至相应的浓度梯度，浓度按照所需的实际检测限确定；稀释好的抗原样本放入4℃冰箱备用。不同的待检样本中目标分析物的纯化方法具体参照国标完成。
2)用本发明检测方法进行检测真菌毒素、农药、兽药、环境激素、违禁食品添加剂及具有生理活性的化学物质含量。
3)分析结果。
用上述制备的11个不同浓度的标准品0g/mL、0.19pg/mL、0.39pg/mL、0.78pg/mL、1.56pg/mL、3.12pg/mL、6.25pg/mL、12.5pg/mL、25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、1000pg/mL。在马尔文纳米粒度分析仪上测试溶液对应的平均水化动力学直径。
免疫学竞争抑制率的计算，标准品或样本的免疫学竞争抑制率等于标准品或样本的粒径较第一个标准(0标准)时粒径变化的平均值除于第一个标准(0标准)，(免疫学竞争抑制率(％)＝(D0-D)D0×100％，其中D0为第一个标准(0标准)的平均水化动力学粒径值，D为标准品或样本的平均水化动力学直径)。
以免疫学竞争抑制率为纵坐标，以小分子半抗原浓度(pg/mL)为横坐标绘制标准曲线，求出线性方程。当进行实际样本检测时，将样本的粒径值((D0-D)/D0×100％)值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应样本的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中小分子半抗原的实际浓度。
实施例2真菌毒素检测——赭曲霉毒素A作为待检物
100μL赭曲霉毒素A抗体标记的多枝状胶体金(0.0125pM)与150μL不同浓度的赭曲霉毒素A的标准品、150μL赭曲霉毒素A的噬菌体(滴度为1×109cfu/mL)混合，37℃孵育100分钟，取出于25℃下用马尔文纳米粒度仪测定溶液的平均水化动力学直径变化。通过计算平均值后代入到标准曲线获得待检样品中赭曲霉毒素A的浓度。具体实验结果如下：线性标准曲线为y＝22.29ln(x)－1.91，R2＝0.9913，见附图2。该方法的最低检测限被定义为免疫学竞争抑制率为10％(即(D0-D)/D0×100％＝10％)所需的抗原浓度。通过该标准曲线计算得最低检测线为1.70pg/mL。
该方法不局限于赭曲霉毒素A的检测，还可以用于其他真菌毒素的检测，黄曲霉毒素B1/B2/G1/G2/M1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马菌素、T2毒素等。
实施例3农药检测——对硫磷作为待检物
100μL对硫磷抗体标记的多枝状胶体金(0.02pM)与150μL不同浓度的对硫磷的标准品、150μL对硫磷的噬菌体(滴度为2.1×109cfu/mL)混合，37℃孵育100分钟，取出于25℃下用马尔文纳米粒度仪测定溶液的平均水化动力学直径变化。通过计算平均值后代入到标准曲线获得待检样品中对硫磷的浓度。具体实验结果如下：线性标准曲线为y＝23.45ln(x)－1.83，R2＝0.9961，见附图3。该方法的最低检测限被定义为免疫学竞争抑制率为10％(即(D0-D)/D0×100％＝10％)所需的抗原浓度。通过该标准曲线计算得最低检测线为1.66pg/mL。
该方法不局限于对硫磷的检测，还可以用于其他类型的农药的检测，如其他的有机磷或有机氯农药、氨基甲酸酯类农药等。
实施例4兽药检测——恩诺沙星作为待检物
100μL恩诺沙星抗体标记的多枝状胶体金(0.015pM)与150μL不同浓度的恩诺沙星的标准品、150μL恩诺沙星的噬菌体(滴度为3×109cfu/mL)混合，37℃孵育100分钟，取出于25℃下用马尔文纳米粒度仪测定溶液的平均水化动力学直径变化。通过计算平均值后代入到标准曲线获得待检样品中恩诺沙星的浓度。具体实验结果如下：线性标准曲线为y＝21.96ln(x)－2.91，R2＝0.9893，见附图4。该方法的最低检测限被定义为免疫学竞争抑制率为10％(即(D0-D)/D0×100％＝10％)所需的抗原浓度。通过该标准曲线计算得最低检测线为1.8pg/mL。
该方法不局限于恩诺沙星的检测，还可以用于其他类型的兽药的检测，如其他的氟喹诺酮类、磺胺类、β受体兴奋剂及四环素类药物等。
实施例5环境激素检测——19-去甲睾酮作为待检物
100μL19-去甲睾酮抗体标记的多枝状胶体金(0.015pM)与150μL不同浓度的19-去甲睾酮的标准品、150μL19-去甲睾酮的噬菌体(滴度为7.2×108cfu/mL)混合，37℃孵育100分钟，取出于25℃下用马尔文纳米粒度仪测定溶液的平均水化动力学直径变化。通过计算平均值后代入到标准曲线获得待检样品中19-去甲睾酮的浓度。具体实验结果如下：线性标准曲线为y＝25.85ln(x)－3.2，R2＝0.9958，见附图5。该方法的最低检测限被定义为免疫学竞争抑制率为10％(即(D0-D)/D0×100％＝10％)所需的抗原浓度。通过该标准曲线计算得最低检测线为1.60pg/mL。
该方法不局限于19-去甲睾酮的检测，还可以用于其他类型的环境激素的检测，如性激素(孕酮、睾酮)、类固醇衍生物等。
实施例6违禁食品添加剂检测——三聚氰胺作为待检物
100μL三聚氰胺抗体标记的多枝状胶体金(0.03pM)与150μL不同浓度的三聚氰胺的标准品、150μL三聚氰胺的噬菌体(滴度为6.5×109cfu/mL)混合，37℃孵育100分钟，取出于25℃下用马尔文纳米粒度仪测定溶液的平均水化动力学直径变化。通过计算平均值后代入到标准曲线获得待检样品中三聚氰胺的浓度。具体实验结果如下：线性标准曲线为y＝20.11ln(x)+1.07，R2＝0.9899，见附图6。该方法的最低检测限被定义为免疫学竞争抑制率为10％(即(D0-D)/D0×100％＝10％)所需的抗原浓度。通过该标准曲线计算得最低检测线为1.73pg/mL。
该方法不局限于三聚氰胺的检测，还可以用于其他类型的违禁食品添加剂的检测。
实施例7生理活性化学物质检测——1,25-二羟基维生素D作为待检物
100μL1,25-二羟基维生素D抗体标记的多枝状胶体金(0.04pM)与150μL不同浓度的1,25-二羟基维生素D的标准品、150μL1,25-二羟基维生素D的噬菌体(滴度为5×108cfu/mL)混合，37℃孵育100分钟，取出于25℃下用马尔文纳米粒度仪测定溶液的平均水化动力学直径变化。通过计算平均值后代入到标准曲线获得待检样品中1,25-二羟基维生素D的浓度。具体实验结果如下：线性标准曲线为y＝21.99ln(x)－3.42，R2＝0.9812，见附图7。该方法的最低检测限被定义为免疫学竞争抑制率为10％(即(D0-D)/D0×100％＝10％)所需的抗原浓度。通过该标准曲线计算得最低检测线为1.84pg/mL。
该方法不局限于1,25-二羟基维生素D的检测，还可以用于其他类型的生理活性化学物质的检测。
Claims (4)
1.一种检测小分子半抗原的均相免疫方法，其特征在于，以特异性噬菌体为竞争抗原及相应抗体标记的多枝状胶体金为动态光散射信号增强探针，以溶液的平均水化动力学粒径变化作为动态光散射信号输出，利用水化动力学直径变化测定反应待检样品中小分子半抗原的含量，包括以下步骤：
（1）以表面修饰羧基链的多枝状胶体金为载体采用EDC一步法将小分子特异性单克隆抗体标记于多枝状胶体金表面，获得抗体标记的多枝状胶体金；
（2）通过噬菌体随机七肽库淘选出针对小分子抗体特异性的噬菌体，获得噬菌体竞争抗原；
（3）在抗体标记的多枝状胶体金溶液中加入噬菌体竞争抗原和待测溶液，37℃反应15-200min后于马尔文纳米粒度仪上测定溶液的平均水化动力学直径，利用水化动力学直径变化测定反应待检样品中小分子半抗原的含量；
其中，步骤（1）中所述抗体标记的多枝状胶体金的制备方法为：利用胶体金种子介导生长法合成多枝状胶体金溶液，将合成的胶体金溶液离心后，以pH 9.0-11.0 的超纯水置换，加入巯基-羧基双亲链，室温旋转搅拌4~12h；混合溶液离心，去除多余链，获得表面巯基羧基双亲链的多枝状胶体金；将表面巯基羧基双亲链的多枝状胶体金加入到pH 7.5 PB缓冲液中，加入小分子抗体，室温下搅拌反应，加入EDC后，搅拌补加两次，加入质量体积分数为10%的牛血清白蛋白，并加入EDC，室温搅拌30分钟后，离心将偶联了抗体的多枝状胶体金分离下来，获得抗体标记的多枝状胶体金。
2.根据权利要求1所述的一种检测小分子半抗原的均相免疫方法，其特征在于，步骤（2）通过随机七肽库淘选相应小分子抗体特异性的噬菌体，包括以下操作：以驴抗鼠抗体0.1 mL4℃包被两孔微孔板，洗板后，封闭向第一孔中加入噬菌体随机七肽库，第二孔中加入小分子半抗原相应的抗体，结合后，取第一孔中的上清液加入到第二孔中，孵育后，酸洗脱，取出洗脱液并用中和液中和至溶液pH值为中性；接着对得到的洗脱液进行扩增，即可得到大量高浓度特异性的噬菌体；加入25%的甘油，于-20℃冰箱中保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种检测小分子半抗原的均相免疫方法，其特征在于，取步骤（1）中获得的抗体标记的多枝状胶体金，用PBS梯度稀释后，测定溶液的平均水化动力学直径，取溶液平均水化动力学直径稳定的最低浓度为胶体金探针的使用浓度；在此胶体金探针的使用浓度下，测定不产生动态光散射信号的噬菌体竞争抗原的用量。
4.根据权利要求3所述的一种检测小分子半抗原的均相免疫方法，其特征在于，通过棋盘滴定法确定抗体标记的多枝状胶体金中抗体的标记量、以及步骤（3）中噬菌体竞争抗原的用量。
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