CN110865185A - 基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素a的方法 - Google Patents

基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素a的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110865185A
CN110865185A CN201910757553.4A CN201910757553A CN110865185A CN 110865185 A CN110865185 A CN 110865185A CN 201910757553 A CN201910757553 A CN 201910757553A CN 110865185 A CN110865185 A CN 110865185A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ochratoxin
monoclonal antibody
copper sulfide
carboxylated
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910757553.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110865185B (zh
Inventor
高志贤
李双
宁保安
白家磊
彭媛
王江
韩殿鹏
韩铁
陈瑞鹏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Environmental Medicine and Operational Medicine Institute of Military Medicine Institute of Academy of Military Sciences
Original Assignee
Environmental Medicine and Operational Medicine Institute of Military Medicine Institute of Academy of Military Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Environmental Medicine and Operational Medicine Institute of Military Medicine Institute of Academy of Military Sciences filed Critical Environmental Medicine and Operational Medicine Institute of Military Medicine Institute of Academy of Military Sciences
Priority to CN201910757553.4A priority Critical patent/CN110865185B/zh
Publication of CN110865185A publication Critical patent/CN110865185A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110865185B publication Critical patent/CN110865185B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明属于食品检测技术领域，本发明公开了一种基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法，包括如下步骤：形成羧基化硫化铜纳米颗粒‑赭曲霉毒素A单克隆抗体的免疫信号标记物；在黑色聚苯乙烯微孔板上固定赭曲霉毒素A抗原，加入待测样品后，待测样品中的赭曲霉毒素A抗原和赭曲霉毒素A竞争结合标记物上的赭曲霉毒素A单克隆抗体；将未与黑色聚苯乙烯微孔板固定赭曲霉毒素A抗原结合的羧基化硫化铜纳米颗粒‑赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物用洗掉，将结合的羧基化硫化铜纳米颗粒‑赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记的铜离子溶出，加入铜离子荧光探针催化铜离子进行荧光定量检测。本发明方法成本低廉、操作简单。

Description

基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法。
背景技术
本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的发明内容，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。
“民以食为先，食以安为先”，食品安全和人们的生活密切相关，随着人们生活水平的不断的提高，食品安全引起了人们的广泛关注。近年来，真菌毒素引起的中毒事件被广泛报道，这些频频发生的食品安全问题给居民带来了沉重的负担。真菌毒素在自然界分布极其广泛，目前发现的真菌毒素种类大概有300多种，真菌毒素就是真菌产生一些初级或次级代谢物。食品在储存和运输过程中遇到潮湿的环境极易受到真菌毒素的污染，直接影响食品的质量安全。其中30多种菌株所产生的毒素代谢产物对人类健康存在严重威胁，其中赭曲霉毒素A(Ochratoxins A，OTA)是污染第二的真菌毒素，仅次于毒素最强的黄曲霉毒素。目前，国际癌症研究机构(IARC)已将OTA列为人类潜在致癌物(2B组)，多个国家和组织也相继制定了OTA严格的限量标准。例如，欧盟委员会明确规定了OTA在食品的最大容许限度，谷类(3.0ng/g)、原谷物(5.0ng/g)、干果(10.0ng/g)、酒和葡萄汁(2.0ng/g)。因此，建立一种高效，快捷，灵敏的检测食品中的OTA具有重要的研究意义。
一些传统检测OTA的方法的包括：高效液相色谱法(High Performance LiquidChromatography，HPLC)、薄层色谱法(Thin-layer chromatograghy，TLC)和气相色谱法(Gas chromatography，GC)等，都拥有较高的稳定性和灵敏度。然而，这些方法需要复杂的仪器，繁琐的样品前处理过程(包括萃取、清洗和浓缩等)和昂贵的实验仪器使得无法对大量样品进行快速筛查，这些仪器分析法需要昂贵的成本投入以及专门人员的培训操作，使得大部分仪器分析方法只能限于实验室的应用，因而限制了它们的普及和应用。
发明内容
本发明实施例的目的是提供一种基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法，本发明提供的检测方法成本低廉，操作简单。
本发明实施例提供了一种基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法，包括如下步骤：
合成羧基化硫化铜，将所述的羧基化硫化铜偶联赭曲霉毒素A单克隆抗体形成羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体的免疫信号标记物；
在黑色聚苯乙烯微孔板上固定赭曲霉毒素A抗原，用牛血清白蛋白封闭未反应的活性位点，在均相反应体系中，加入待测样品后，所述待测样品中的赭曲霉毒素A抗原和赭曲霉毒素A竞争结合羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物上的赭曲霉毒素A单克隆抗体；
将未与黑色聚苯乙烯微孔板固定赭曲霉毒素A抗原结合的羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物用10mmol/L磷酸盐缓冲液洗掉，加入0.01mol/L盐酸溶液将黑色聚苯乙烯微孔板固定赭曲霉毒素A抗原结合的羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记的铜离子溶出，加入铜离子荧光探针催化铜离子进行荧光定量检测。
进一步的，所述的合成羧基化硫化铜纳米颗粒包括如下步骤：
将0.01-1mmol氯化铜加入到100-150mL超纯水中并与0.1-0.5mol的巯基乙酸混合搅拌15-25min，用0.5-1M的氢氧化钠将PH调节至8.5-9.0，然后向混合液中加入0.5-5mol的硫代乙酰胺，该反应过程在50-60℃下保持5-6h并通入氮气保护，随后，停止反应并离心。
进一步的，所述的将羧基化硫化铜纳米颗粒偶联赭曲霉毒素A单克隆抗体形成羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物包括如下步骤：
将100μL浓度为20-32mg/mL新配制的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶液(用10mmol/L 2-吗啉乙磺酸缓冲液配制，PH 5.5)与1ml羧基化硫化铜纳米颗粒悬浮液充分混合活化羧基化硫化铜纳米颗粒表面的羧基，在室温下震荡反应2-3h，离心除去上清液，加入1mL浓度为200-250μg/mL赭曲霉毒素A单克隆抗体，在4℃温度下震荡孵育12h，随后将反应液离心，用10mmol/L磷酸盐缓冲液洗涤3次，得到羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物。
进一步的，赭曲霉毒素A抗原的添加量为30μg/mL。
进一步的，反应时间为60min。
进一步的，反应温度为37℃。
进一步的，羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物的添加量为0.7mg/mL。
进一步的，所述的荧光定量测定包括步骤：
建立标准曲线
加入200μL浓度为2.5-5％的戊二醛黑色聚苯乙烯微孔板内使黑色聚苯乙烯微孔板表面氨基活化，室温下震荡2h后用磷酸盐缓冲液洗涤三次；
将50μL的赭曲霉毒素A抗原浓度为30μg/mL加入到氨基活化完的黑色聚苯乙烯微孔板中，并在37℃孵育2-3h以固定赭曲霉毒素A抗原，然后用磷酸盐缓冲液洗涤3次以除去物理吸附的赭曲霉毒素A抗原，加入120μL浓度为1-5％的牛血清白蛋白溶液封闭未反应的活性位点，再次用磷酸盐缓冲液洗涤3次；
向固定有赭曲霉毒素A抗原的黑色聚苯乙烯微孔板的反应室中加入50μL浓度为0.7mg/mL的羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物物和50μL含有梯度浓度的赭曲霉毒素A在37℃竞争反应60min，随后用磷酸盐缓冲液洗涤3次，所述的梯度浓度包括0pg/mL，10pg/mL，1×102pg/mL，1×103pg/mL，1×104pg/mL，1×105pg/mL，1×106pg/mL；
在黑色聚苯乙烯微孔板的反应室中加入200μL浓度为0.1mol/L的盐酸溶液，溶解羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物的铜离子在37℃震荡反应30min。再加入5μL浓度为0.5mg/mL的罗丹明6G酰胺硫脲(铜离子荧光探针)继续震荡反应30-45min后进行荧光定量检测，根据所述的梯度浓度的荧光定量检测结果绘制标准曲线。
本发明基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法实施例具有如下有益效果：
本发明方法以合成羧基化硫化铜纳米颗粒后偶联赭曲霉毒素A单克隆抗体形成羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物为基础，在黑色聚苯乙烯微孔板上固定赭曲霉毒素A抗原，用牛血清白蛋白封闭未反应的活性位点，在均相反应体系中，加入不同浓度的赭曲霉毒素A后，赭曲霉毒素A抗原和赭曲霉毒素A竞争结合羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物上的赭曲霉毒素A单克隆抗体，将未与黑色聚苯乙烯微孔板固定赭曲霉毒素A抗原结合的羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物洗掉，加入盐酸溶液将黑色聚苯乙烯微孔板固定赭曲霉毒素A抗原结合的羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记的铜离子溶出，加入罗丹明6G酰胺硫脲(铜离子荧光探针)催化铜离子进行荧光定量检测。如图1所示，该发明方法对检测赭曲霉毒素A的线性范围为10pg/mL～1×105pg/mL，最低检测限为2.71pg/mL。与现有技术相比，本发明方法对赭曲霉毒素A具有更低的检测限、更高的灵敏度和准确度，以及良好的特异性，可实现对玉米、大豆、咖啡实际样品中低浓度赭曲霉毒素A小分子的检测。
附图说明
图1为本发明基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法流程示意图；
图2为本发明基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法中羧基化硫化铜纳米颗粒的红外光谱图；
图3为本发明基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法中羧基化硫化铜纳米颗粒的扫描电镜图；
图4为本发明基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法中羧基化硫化铜纳米颗粒修饰赭曲霉毒素A单克隆抗体的动态光散射(DLS)图；
图5为本发明基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法中赭曲霉毒素A抗原最佳添加量的优化图；
图6为本发明基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法中最佳孵育温度的优化图；
图7为本发明基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法中最佳孵育时间的优化图；
图8为本发明基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法中羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物最佳添加量的优化图；
图9为本发明基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法中基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的标准曲线图；
图10为本发明基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法中与其他真菌毒素的特异性图。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。
一种基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法，包括如下步骤：
合成羧基化硫化铜，将所述的羧基化硫化铜偶联赭曲霉毒素A单克隆抗体形成羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体的免疫信号标记物；
在黑色聚苯乙烯微孔板上固定赭曲霉毒素A抗原，用牛血清白蛋白封闭未反应的活性位点，在均相反应体系中，加入待测样品后，所述待测样品中的赭曲霉毒素A抗原和赭曲霉毒素A竞争结合羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物上的赭曲霉毒素A单克隆抗体；
将未与黑色聚苯乙烯微孔板固定赭曲霉毒素A抗原结合的羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物用10mmol/L磷酸盐缓冲液洗掉，加入0.01mol/L盐酸溶液将黑色聚苯乙烯微孔板固定赭曲霉毒素A抗原结合的羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记的铜离子溶出，加入铜离子荧光探针催化铜离子进行荧光定量检测。
在本发明的一些实施例中，铜离子荧光探针可以为罗丹明6G酰胺硫脲、萘酰亚胺类荧光探针C，吡唑基香豆素席夫碱。
在本发明的一些实施例中，所述的合成羧基化硫化铜纳米颗粒包括如下步骤：
将0.01-1mmol氯化铜加入到100-150mL超纯水中并与0.1-0.5mol的巯基乙酸混合搅拌15-25min，用0.5-1M的氢氧化钠将PH调节至8.5-9.0，然后向混合液中加入0.5-5mol的硫代乙酰胺，该反应过程在50-60℃下保持5-6h并通入氮气保护，随后，停止反应并离心。
这里要说明的是：调节PH不一定是用氢氧化钠溶液，还可以是其他碱性溶液，如氢氧化钾，当然，还可以是其他碱性物质，只要可以调节PH至8.5-9.0即可。
在本发明的一些实施例中，所述的将羧基化硫化铜纳米颗粒偶联赭曲霉毒素A单克隆抗体形成羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物包括如下步骤：
将100μL浓度为20-32mg/mL新配制的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶液(用10mmol/L 2-吗啉乙磺酸缓冲液配制，PH 5.5)与1ml羧基化硫化铜纳米颗粒悬浮液充分混合活化羧基化硫化铜纳米颗粒表面的羧基，在室温下震荡反应2-3h，离心除去上清液，加入1mL浓度为200-250μg/mL赭曲霉毒素A单克隆抗体，在4℃温度下震荡孵育12h，随后将反应液离心，用10mmol/L磷酸盐缓冲液洗涤3次，得到羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物。
在本发明的一些实施例中，赭曲霉毒素A抗原的添加量为30μg/mL。
在本发明的一些实施例中，反应时间为60min。
在本发明的一些实施例中，反应温度为37℃。
在本发明的一些实施例中，羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物的添加量为0.7mg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述的荧光定量测定包括步骤：
建立标准曲线
加入200μL浓度为2.5-5％的戊二醛黑色聚苯乙烯微孔板内使黑色聚苯乙烯微孔板表面氨基活化，室温下震荡2h后用磷酸盐缓冲液洗涤三次；
将50μL的赭曲霉毒素A抗原浓度为30μg/mL加入到氨基活化完的黑色聚苯乙烯微孔板中，并在37℃孵育2-3h以固定赭曲霉毒素A抗原，然后用磷酸盐缓冲液洗涤3次以除去物理吸附的赭曲霉毒素A抗原，加入120μL浓度为1-5％的牛血清白蛋白溶液封闭未反应的活性位点，再次用磷酸盐缓冲液洗涤3次；
向固定有赭曲霉毒素A抗原的黑色聚苯乙烯微孔板的反应室中加入50μL浓度为0.7mg/mL的羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物物和50μL含有梯度浓度的赭曲霉毒素A在37℃竞争反应60min，随后用磷酸盐缓冲液洗涤3次，所述的梯度浓度包括0pg/mL，10pg/mL，1×102pg/mL，1×103pg/mL，1×104pg/mL，1×105pg/mL，1×106pg/mL；
在黑色聚苯乙烯微孔板的反应室中加入200μL浓度为0.1mol/L的盐酸溶液，溶解羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物的铜离子在37℃震荡反应30min。再加入5μL浓度为0.5mg/mL的罗丹明6G酰胺硫脲(铜离子荧光探针)继续震荡反应30-45min后进行荧光定量检测，根据所述的梯度浓度的荧光定量检测结果绘制标准曲线。
香豆素-喹啉荧光探针。
实施例1
羧基化硫化铜纳米颗粒的制备
将0.1mmol氯化铜加入到100mL超纯水中并与、0.2mmol的巯基乙酸混合搅拌20min用0.5M的氢氧化钠将PH调节至9.0，然后向混合液中加入0.1mmol的硫代乙酰胺，该反应过程在50℃下保持6h并通入氮气保护，随后，停止反应并用超滤离心管(3kDa)在离心机纯化羧基化硫化铜纳米颗粒，将羧基化硫化铜纳米颗粒重新分散至超纯水中储存在4℃以备使用。红外光谱表征如图2所示，1733cm-1处的吸收带对应羧基中C＝O伸缩振动峰；1384cm-1和1105cm-1两处的吸收带对应羧基中的C-O伸缩振动和O-H面内变性振动。由此证明了制备的硫化铜纳米颗粒上羧基的存在。透射电镜表征如图3所示，合成的羧基化硫化铜纳米颗粒的粒径100nm左右。
羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物的制备
将100μL浓度为20mg/mL新配制的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶液(用10mmol/L2-吗啉乙磺酸缓冲液配制，PH 5.5)与1ml羧基化硫化铜纳米颗粒悬浮液充分混合活化羧基化硫化铜纳米颗粒表面的羧基，在室温下震荡反应2h。离心除去上清液，加入1mL赭曲霉毒素A单克隆抗体(200μgmL-1)，在4℃温度下震荡孵育12h，随后将反应液离心(13000rpm，10min，4℃)，用磷酸盐缓冲液(10mmol/L)洗涤3次，得到羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物，用10mmol/L的PBS分散至1mL储存在4℃备用。动态光散射表征如图4所示，羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体的平均粒径比羧基化硫化铜纳米颗粒的平均粒径明显增大，间接说明了赭曲霉毒素A单克隆抗体成功偶联在羧基化硫化铜纳米颗粒表面。
赭曲霉毒素A抗原浓度添加量的优化
优化5个赭曲霉毒素A抗原的浓度，分别为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL，如图5所示，当赭曲霉毒素A抗原添加浓度在10-30μg/mL时，其荧光值强度逐渐增加，当赭曲霉毒素A抗原添加浓度在30μg/mL时，随着赭曲霉毒素A抗原浓度的增加其荧光值强度基本保持不变，说明当赭曲霉毒素A抗原浓度为30μg/mL时达到饱和状态，故赭曲霉毒素A抗原的最佳添加量为30μg/mL。
反应时间的优化
优化了6个反应时间点，分别是20min、30min、40min、50min、60min、70min，如图6所示，在20-60min范围内，随着反应的进行，其荧光值强度逐渐增加，当反应时间在60min时，其荧光值强度达到最大值，故反应的最佳时间为60min。
反应温度的优化
优化了5个反应温度，分别为4℃、25℃、37℃、45℃、55℃，如图7所示，当反应温度在4℃-37℃时，其荧光值强度逐渐增加，当反应温度在37℃时，其荧光值强度达到最大值，故最佳反应温度为37℃。
羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物添加量的优化
优化5个羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物的浓度，分别为0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL，如图8所示，当羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物添加浓度在0.5-0.7mg/mL时，其荧光值强度逐渐增加，当羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物添加浓度在0.7mg/mL时后，随着羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物浓度的增加其荧光值强度基本保持不变，说明当羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物浓度为0.7mg/mL时达到饱和状态，故羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物的最佳添加量为0.7mg/mL。
建立标准曲线
1)加入200μL浓度为2.5％的戊二醛在黑色聚苯乙烯微孔板内使其表面氨基活化，室温下震荡2h后用磷酸盐缓冲液洗涤三次。
2)将50μL的赭曲霉毒素A抗原浓度为30μg/mL加入到氨基活化完的黑色聚苯乙烯微孔板中，并在37℃孵育2h以固定赭曲霉毒素A抗原，然后用磷酸盐缓冲液洗涤3次以除去物理吸附的赭曲霉毒素A抗原，加入120μL浓度为1％的牛血清白蛋白溶液封闭未反应的活性位点，再次用磷酸盐缓冲液洗涤3次。
3)向固定有赭曲霉毒素A抗原的黑色聚苯乙烯微孔板的反应室中加入50μL浓度为0.7mg/mL的羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物和50μL含有不同浓度的赭曲霉毒素A在37℃竞争反应60min，随后用磷酸盐缓冲液洗涤3次。
4)在黑色聚苯乙烯微孔板的反应室中加入200μL浓度为0.1mol/L的盐酸溶液，溶解羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物的铜离子在37℃震荡反应30min。再加入5μL浓度为0.5mg/mL的罗丹明6G酰胺硫脲(铜离子荧光探针)继续震荡反应30min后进行荧光定量检测。
在以上实验条件的情况下，使用一系列稀释浓度的赭曲霉毒素A标准样品(a-j分别为0，10，1×102，1×103，1×104，1×105，1×106pg/mL)绘制标准曲线。如图9所示，荧光值强度随着赭曲霉毒素A浓度的增加而降低，该趋势可以做如下解释：当不同浓度的赭曲霉毒素A和羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物以及黑色聚苯乙烯微孔板上固定赭曲霉毒素A抗原在同一个反应室中，赭曲霉毒素A和黑色聚苯乙烯微孔板固定的赭曲霉毒素A抗原竞争结合羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物上的赭曲霉毒素A单克隆抗体，当OTA浓度越高，赭曲霉毒素A和羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物上赭曲霉毒素A单克隆抗体结合的越多，导致羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物上赭曲霉毒素A单克隆抗体和黑色聚苯乙烯微孔板上固定的赭曲霉毒素A抗原结合的越少，然后将未与黑色聚苯乙烯微孔板上固定赭曲霉毒素A抗原结合的羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物和赭曲霉毒素A清洗掉，加入盐酸溶液溶解免疫复合物中所标记的羧基化硫化铜纳米颗粒，将溶解出的铜离子加入铜离子荧光探针发生开环水解反应，生成的产物在495nm激发光激发下发出508-650nm的发射光，在554nm处荧光强度达到最大值，荧光强度与产物成正比，故可通过荧光值强度对赭曲霉毒素A进行定量检测，且赭曲霉毒素A浓度与荧光强度存在负相关关系。以赭曲霉毒素A浓度为横坐标，554nm的荧光值强度为纵坐标，得到的标准曲线为Y＝9277.0025-416.6091X，R2＝0.9942，赭曲霉毒素A浓度在10pg/mL～1×105pg/mL成良好的线性关系，最低检出限为2.71pg/mL。
检测方法的特异性
为了评价本发明方法的特异性，选取了和赭曲霉毒素A都属于真菌毒素的干扰物T-2毒素、玉米赤霉烯酮毒素(ZEN)、伏马镰刀毒素(FB1)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、呕吐毒素(DON)，从理论上讲，该方法的特异性主要取决于赭曲霉毒素A单克隆抗体和赭曲霉毒素A的特异性结合，如果OTA单克隆抗体和其它真菌毒素结合，则会产生假阳性信号。如图10所示，当加入10ngmL-1的其他真菌毒素时，F0/F(空白对照组荧光强度/试验组荧光强度)比值较低。空白对照组的荧光强度最高，这是因为没有毒素和黑色聚苯乙烯微孔板固定的赭曲霉毒素A抗原竞争结合羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物，加入盐酸后溶解的铜离子最多，加入铜离子荧光探针后其荧光值强度最强，加入其他真菌毒素与赭曲霉毒素A单克隆抗体没有特异性结合，导致和黑色聚苯乙烯微孔板固定的赭曲霉毒素A抗原和羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物结合的较多，加入盐酸后溶解的铜离子较多，加入铜离子荧光探针后其荧光值强度较强，故F0/F值较低，当加入1ng/mL赭曲霉毒素A时，赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素A单克隆抗体能特异性结合，其荧光值强度较低，故F0/F值较高。
实际样品的检测
样品前处理。称取1g玉米面、大豆面、咖啡面加入到5ml离心管中，之后加入2ml浓度为10ng/ml的赭曲霉毒素A溶液(用甲醇∶磷酸盐缓冲液＝7∶3稀释)，涡旋震荡5min。之后10000rpm/min离心15min，取上清液，0.45um过滤膜进行过滤，然后稀释为1ng/ml、0.1ng/ml(用甲醇∶PBS＝7∶3稀释)进行加标回收实验。
采用加标回收实验。选取玉米、大豆、咖啡作为实际样品。在检测范围内设置高中低不同浓度(10ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL)，每个浓度平行测定3次，计算加标回收率，并与传统的酶联免疫吸附(ELISA)方法做方法学对比，结果见表1。
表1
Figure BDA0002171768980000111
Figure BDA0002171768980000121
结果表明，本发明的加标回收率在93.88％～109.96％。相对标准偏差(relativestandard deviation，RSD)在2.37％～5.12％之间，用传统的ELISA试剂盒方法检测了相同样品的加标回收率，结果表明本发明方法与传统的ELISA方法的加标回收率基本一致，说明本发明方法的准确可靠。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，包括如下步骤：
合成羧基化硫化铜，将所述的羧基化硫化铜偶联赭曲霉毒素A单克隆抗体形成羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体的免疫信号标记物；
在黑色聚苯乙烯微孔板上固定赭曲霉毒素A抗原，用牛血清白蛋白封闭未反应的活性位点，在均相反应体系中，加入待测样品后，所述待测样品中的赭曲霉毒素A抗原和赭曲霉毒素A竞争结合羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物上的赭曲霉毒素A单克隆抗体；
将未与黑色聚苯乙烯微孔板固定赭曲霉毒素A抗原结合的羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物用10mmol/L磷酸盐缓冲液洗掉，加入0.01mol/L盐酸溶液将黑色聚苯乙烯微孔板固定赭曲霉毒素A抗原结合的羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记的铜离子溶出，加入铜离子荧光探针催化铜离子进行荧光定量检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的合成羧基化硫化铜纳米颗粒包括如下步骤：
将0.01-1mmol氯化铜加入到100-150mL超纯水中并与0.1-0.5mol的巯基乙酸混合搅拌15-25min，用0.5-1M的氢氧化钠将PH调节至8.5-9.0，然后向混合液中加入0.5-5mol的硫代乙酰胺，该反应过程在50-60℃下保持5-6h并通入氮气保护，随后，停止反应并离心。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的将羧基化硫化铜纳米颗粒偶联赭曲霉毒素A单克隆抗体形成羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物包括如下步骤：
将100μL浓度为20-32mg/mL新配制的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶液与1ml羧基化硫化铜纳米颗粒悬浮液充分混合活化羧基化硫化铜纳米颗粒表面的羧基，在室温下震荡反应2-3h，离心除去上清液，加入1mL浓度为200-250μg/mL赭曲霉毒素A单克隆抗体，在4℃温度下震荡孵育12h，随后将反应液离心，用10mmol/L磷酸盐缓冲液洗涤3次，得到羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，赭曲霉毒素A抗原的添加量为30μg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应时间为60min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应温度为37℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物的添加量为0.7mg/mL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的荧光定量测定包括步骤：
建立标准曲线
加入200μL浓度为2.5-5％的戊二醛黑色聚苯乙烯微孔板内使黑色聚苯乙烯微孔板表面氨基活化，室温下震荡2h后用磷酸盐缓冲液洗涤三次；
将50μL的赭曲霉毒素A抗原浓度为30μg/mL加入到氨基活化完的黑色聚苯乙烯微孔板中，并在37℃孵育2-3h以固定赭曲霉毒素A抗原，然后用磷酸盐缓冲液洗涤3次以除去物理吸附的赭曲霉毒素A抗原，加入120μL浓度为1-5％的牛血清白蛋白溶液封闭未反应的活性位点，再次用磷酸盐缓冲液洗涤3次；
向固定有赭曲霉毒素A抗原的黑色聚苯乙烯微孔板的反应室中加入50μL浓度为0.7mg/mL的羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物物和50μL含有梯度浓度的赭曲霉毒素A在37℃竞争反应60min，随后用磷酸盐缓冲液洗涤3次，所述的梯度浓度包括0pg/mL，10Pg/mL，1×102pg/mL，1×103pg/mL，1×104pg/mL，1×105pg/mL，1×106pg/mL；
在黑色聚苯乙烯微孔板的反应室中加入200μL浓度为0.1mol/L的盐酸溶液，溶解羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物的铜离子在37℃震荡反应30min，再加入5μL浓度为0.5mg/mL的罗丹明6G酰胺硫脲(铜离子荧光探针)继续震荡反应30-45min后进行荧光定量检测，根据所述的梯度浓度的荧光定量检测结果绘制标准曲线。
CN201910757553.4A 2019-08-19 2019-08-19 基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素a的方法 Active CN110865185B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910757553.4A CN110865185B (zh) 2019-08-19 2019-08-19 基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素a的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910757553.4A CN110865185B (zh) 2019-08-19 2019-08-19 基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素a的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110865185A true CN110865185A (zh) 2020-03-06
CN110865185B CN110865185B (zh) 2023-03-14

Family

ID=69651971

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910757553.4A Active CN110865185B (zh) 2019-08-19 2019-08-19 基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素a的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110865185B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112067815A (zh) * 2020-09-03 2020-12-11 南昌大学 一种检测小分子半抗原的均相免疫方法
CN112362875A (zh) * 2020-11-10 2021-02-12 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光检测方法和试剂盒
CN112461803A (zh) * 2020-06-12 2021-03-09 重庆工商大学 一种检测食品样品中的黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的方法
CN113406330A (zh) * 2021-06-30 2021-09-17 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种用于检测诺氟沙星的试剂盒及检测方法
CN114088675A (zh) * 2021-11-17 2022-02-25 浙江科技学院 包裹荧光染料的免疫脂质体及应用

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102426230A (zh) * 2011-09-20 2012-04-25 王利兵 一种不对称金纳米粒子二聚体免疫传感器检测黄曲霉毒素的方法
CN102689918A (zh) * 2012-03-04 2012-09-26 重庆文理学院 硫化铜纳米片的制备方法
CN104132981A (zh) * 2014-07-20 2014-11-05 济南大学 一种Cu2S标记的雌激素免疫传感器的制备方法及应用
CN104374913A (zh) * 2014-11-08 2015-02-25 济南大学 一种竞争型黄曲霉毒素免疫传感器的制备方法及应用
CN105543376A (zh) * 2016-01-24 2016-05-04 湖南科技大学 赭曲霉毒素a的快速检测方法
CN105622624A (zh) * 2015-12-14 2016-06-01 河南理工大学 一种罗丹明b衍生物、制备方法及其作为荧光探针的应用
CN105754587A (zh) * 2016-03-30 2016-07-13 泰山医学院 咪唑并吡啶罗丹明酰肼类铜离子比率荧光探针及其应用
CN105801589A (zh) * 2016-04-05 2016-07-27 江苏省原子医学研究所 基于罗丹明6g衍生物的比色探针及其制备方法和应用
CN107314979A (zh) * 2016-10-09 2017-11-03 河南理工大学 一种基于罗丹明6g的铜离子传感器、制备及应用
CN108440548A (zh) * 2018-03-31 2018-08-24 浙江工业大学 一种含酰肼基团的罗丹明6g类荧光探针及其制备与应用
CN108535467A (zh) * 2018-03-26 2018-09-14 暨南大学 一种化学发光间接竞争免疫检测铜离子的试剂盒及其应用

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102426230A (zh) * 2011-09-20 2012-04-25 王利兵 一种不对称金纳米粒子二聚体免疫传感器检测黄曲霉毒素的方法
US20130071947A1 (en) * 2011-09-20 2013-03-21 Libing Wang Chirality sensor and method for detection of aflatoxin by using the sensor
CN102689918A (zh) * 2012-03-04 2012-09-26 重庆文理学院 硫化铜纳米片的制备方法
CN104132981A (zh) * 2014-07-20 2014-11-05 济南大学 一种Cu2S标记的雌激素免疫传感器的制备方法及应用
CN104374913A (zh) * 2014-11-08 2015-02-25 济南大学 一种竞争型黄曲霉毒素免疫传感器的制备方法及应用
CN105622624A (zh) * 2015-12-14 2016-06-01 河南理工大学 一种罗丹明b衍生物、制备方法及其作为荧光探针的应用
CN105543376A (zh) * 2016-01-24 2016-05-04 湖南科技大学 赭曲霉毒素a的快速检测方法
CN105754587A (zh) * 2016-03-30 2016-07-13 泰山医学院 咪唑并吡啶罗丹明酰肼类铜离子比率荧光探针及其应用
CN105801589A (zh) * 2016-04-05 2016-07-27 江苏省原子医学研究所 基于罗丹明6g衍生物的比色探针及其制备方法和应用
CN107314979A (zh) * 2016-10-09 2017-11-03 河南理工大学 一种基于罗丹明6g的铜离子传感器、制备及应用
CN108535467A (zh) * 2018-03-26 2018-09-14 暨南大学 一种化学发光间接竞争免疫检测铜离子的试剂盒及其应用
CN108440548A (zh) * 2018-03-31 2018-08-24 浙江工业大学 一种含酰肼基团的罗丹明6g类荧光探针及其制备与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
程慧 等: "基于铜离子显色反应的磁珠免疫分析快速检测黄曲霉毒素 B1", 《现代食品科技》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112461803A (zh) * 2020-06-12 2021-03-09 重庆工商大学 一种检测食品样品中的黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的方法
CN112067815A (zh) * 2020-09-03 2020-12-11 南昌大学 一种检测小分子半抗原的均相免疫方法
CN112067815B (zh) * 2020-09-03 2022-03-18 南昌大学 一种检测小分子半抗原的均相免疫方法
CN112362875A (zh) * 2020-11-10 2021-02-12 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光检测方法和试剂盒
CN113406330A (zh) * 2021-06-30 2021-09-17 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种用于检测诺氟沙星的试剂盒及检测方法
CN113406330B (zh) * 2021-06-30 2024-01-02 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种用于检测诺氟沙星的试剂盒及检测方法
CN114088675A (zh) * 2021-11-17 2022-02-25 浙江科技学院 包裹荧光染料的免疫脂质体及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110865185B (zh) 2023-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110865185B (zh) 基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素a的方法
CN109752536B (zh) 基于金纳米颗粒高效组装结构的光学探针及其制备与应用
Liao et al. An ultrasensitive ELISA method for the detection of procalcitonin based on magnetic beads and enzyme-antibody labeled gold nanoparticles
CN109884306B (zh) 一种小分子检测试纸条、试剂盒及其检测方法
CN111551724B (zh) 一种荧光探针、检测四环素的方法及应用
JP2014163758A (ja) 蛍光色素化合物を含むセルロース微粒子
CN109490293A (zh) 一种快速检测鸡卵黄抗体的比色试剂盒
CN106324254A (zh) 一种抗胰岛素抗体检测试剂盒及其检测方法
Hironaka et al. Conjugation of antibody with temperature-responsive polymer via in situ click reaction to enable biomarker enrichment for increased diagnostic sensitivity
CN114989823B (zh) 一种疏水量子点纳米材料、纳米探针及其制备方法和应用
Huang et al. Rapid and quantitative determination of deoxynivalenol in cereal through the combination of magnetic solid-phase extraction and optical fiber-based homogeneous chemiluminescence immunosensor
CN110274898B (zh) His@ZIF-8/Tb3+复合材料的制备方法
CN110261604B (zh) 抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法及应用
CN106248930A (zh) 一种无酶病原体比色分析检测传感器
Petrakova et al. Immunochromatographic test system for the detection of T-2 toxin
Wang et al. Duplex-immunoassay of ovarian cancer biomarker CA125 and HE4 based carbon dot decorated dendritic mesoporous silica nanoparticles
CN114660029A (zh) 一种比色-荧光双信号聚集诱导荧光微球及其应用
Kabwe et al. Synthesis and characterisation of quantum dots coupled to mycolic acids as a water‐soluble fluorescent probe for potential lateral flow detection of antibodies and diagnosis of tuberculosis
CN115060893A (zh) 三维均相填充型磁性-贵金属复合纳米酶、其新冠抗原免疫层析试纸及应用
CN114544974A (zh) 一种基于碳量子点微球的荧光免疫层析试剂卡及其制备方法与应用
CN113406330A (zh) 一种用于检测诺氟沙星的试剂盒及检测方法
CN117630364B (zh) 一种双酶型免疫荧光系统检测痕量黄曲霉毒素b1的方法
Chen et al. A smartphone-enabled visual platform for detecting aflatoxins in peanut oil using colorimetric analysis coupled with magnetic imprinted solid-phase extraction
CN116735871A (zh) 一种受体试剂及其应用
CN107942053B (zh) 芽胞@Zr4+作为功能微球的制备及其在免疫检测中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant