CN114460291A - 一种基于空心聚合物套管结合Zr-MOF的不同信号放大能力的移液器免疫传感平台 - Google Patents

一种基于空心聚合物套管结合Zr-MOF的不同信号放大能力的移液器免疫传感平台 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于空心聚合物套管结合Zr‑MOF的不同信号放大能力的移液器免疫传感平台，直接在空心聚合物套管内壁通过静电作用、氢键作用或者疏水相互作用包被生物识别分子，并成功实现了各种大分子、小分子目标物的检测。本发明可根据不同待测物对灵敏度要求不同使用相应信号读出探针并结合图片颜色识别软件或者CCD拍照系统进行定量分析，满足不同待测物对灵敏度的不同要求。较于传统ELISA检测方法，在空心聚合物套管上进行实验，操作简便，不需要额外的洗板技术，节约枪头，成本低；传感原理高效、准确性好：本发明在传统的金标准ELISA基础进行改进，因而依旧保留ELISA的固有结果准确、稳定优势；检测灵敏度高、进行大批量样本的快速以及现场分析，检测效率极高。

Description

一种基于空心聚合物套管结合Zr-MOF的不同信号放大能力的 移液器免疫传感平台
技术领域
本发明属于生物传感领域，涉及一种基于空心聚合物套管结合Zr-MOF的不同信号放大能力的移液器免疫传感平台。
背景技术
对于致病菌、真菌毒素、抗生素、生物标志物、重金属等危害因子进行有效的高灵敏检测在食品安全、疾病诊断、环境监测等方面具有重要意义。尽管基于光学、电化学、磁性等信号读出方式的生物传感器被开发且应用于检测领域，但是酶联免疫吸附测定法(ELISA)由于其稳定性好、重现性强依旧是各种靶标检测最广泛使用的免疫测定法，更是被视为标准方法。尽管如此，ELISA在检测过程中仍有一定的不足：1.在洗涤步骤中需要拍板操作，就可能会导致因不同实验员的实验经验不同而对结果产生偏差；2.由于每步反应所需试剂不同，更是需要频繁的更换移液器枪头；3.ELISA的灵敏度在应对日益提高的检测要求以及复杂基质的干扰时存在巨大的挑战。
发明内容
本发明的目的是为解决ELISA在现场快速检测中洗涤操作复杂、成本高、灵敏度有限等问题，通过在空心聚合物套管内壁通过静电作用、氢键作用或者疏水相互作用包被生物识别分子，并成功实现了各种大分子、小分子目标物的检测。提供一种基于空心聚合物套管结合Zr-MOF的不同信号放大能力的移液器免疫传感平台，成本低、稳定性好、抗干扰能力强及灵敏度可选，主要是基于Zr-MOF实现不同信号放大能力及空心聚合物套管实现免疫检测反应。
本发明技术方案如下：
一种基于Zr-MOF的不同信号放大能力移液器免疫传感平台，以空心聚合物套管作为基底，通过在空心聚合物套管内壁包被生物识别分子，实现了各种大分子、小分子目标物的检测。
优选地，所述生物识别分子为捕获抗体或检测抗体、抗体或抗原、DNA捕获探针或DNA检测探针；
所述目标物包括病毒、生物标志物、抗生素分子、农药分子、兽药分子、生物毒素、细菌或其他；还包括各种基质成分的检测对象如血清、牛奶、饮料、粮食谷物或其他；
所述空心聚合物套管是材质为聚苯乙烯(PS)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯酰胺(PAM)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)或其他。
所述的基于空心聚合物套管结合Zr-MOF的不同信号放大能力的移液器免疫传感平台的操作方法，所述方法包括以下步骤：
S1:空心聚合物套管依次进行与生物识别分子温育过夜、洗涤、牛血清蛋白封闭；
S2：上述研制生物分子修饰空心聚合物套管依次吸入待测目标物进行生物反应，反应后排出溶液并洗涤空心聚合物套管，加入酶标抗体或Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体或Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链进行反应，洗涤过量的酶标抗体或Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体或Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链后；
S3：吸入信号产生底物(TMB显色底物)进行颜色变化后予以硫酸终止反应，对最终颜色进行拍照并以颜色分析软件分析颜色强度，颜色强度与待测目标物浓度相关，或者在加入酶标抗体反应后，洗涤过量的酶标抗体，然后吸入发光底物进而产生信号，结合CCD拍照成像系统进行定量分析靶标，光强度与待测目标物浓度相关。
步骤S2中加入Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体实现双重信号放大；若加入Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链，洗涤后，温育杂交链反应放大系统、温育链霉亲和素化HRP实现五重信号放大。
进一步优选地，所述Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体是按如下方法制备；
Zr-MOF是通过如下合成的：将5-15mg H2TCPP、15-45mg ZrOCl2·8H2O和350-350mg苯甲酸溶解在5-15mLDMF中并加入到50-100mL玻璃瓶中；在300rpm、90℃条件下搅拌2-10h得到Zr-MOF产物；并以14,000rpm离心30min，用DMF洗涤3次，在真空烘箱中干燥；
Zr-MOF-Pt通过在Zr-MOF上原位还原法合成：将5-15mg Zr-MOF分散在10-30mL水中，然后在悬浮液中加入100μL2.5-10％H2PtCl6搅拌10.5-2h(37℃)，随后，将2.5mL0.1-1mg/mL NaBH4溶液滴入悬浮液中，剧烈搅拌2-4h(37℃)，最终将Zr-MOF-Pt产物进行离心(14000转，10分钟)，用水洗涤3次，最后分散在水中；
Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体的制备：在Zr-MOF-Pt中加入HRP酶标抗体(100μL，200μg/mL)并在4℃保持10-24小时；然后，将混合溶液用PBS洗涤3次并离心(12000rpm，10min，4℃)。
更进一步优选地，所述Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链是按如下方法制备：将Zr-MOF-Pt与HRP溶液(0.5-2mg/mL,50μL)一起孵育1小时(Zr-MOF-Pt-HRP)；接下来，在4℃下加入HRP酶标抗体(100μL，100-300μg/mL)和磷酸化杂交链反应引发链DNA温育12-24小时(Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链)；然后，将混合溶液用PBS洗涤3次并离心(12000rpm，10min，4℃)；Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链重悬于1.0mL PBS中，4℃保存。
优选地，所述杂交链反应放大系统为生物素化的双发卡DNA。
本发明所提供的方法和装置，其工作原理如下：
金属有机骨架(MOF)材料因其高孔隙率、大表面积以及中心原子或配体提供的优异性能而受到研究人员的高度关注。此外，MOF已被证明是贵金属原位生长的理想载体。并且可以通过形成配位键与核酸相互作用。其中，Zr-MOF的大表面积可以原位生成大量铂纳米粒子(Pt NPs)，高孔隙率可以包埋大量辣根过氧化物酶(HRP)。Zr-MOF的Zr离子可以与DNA的末端磷酸根形成Zr-OP键。Pt NPs可以在无需额外的活化试剂辅助下修饰酶标抗体。因此，Zr-MOF可以实现构建不同信号放大能力探针的载体，提高比色检测的灵敏度，而且完美解决了MOF与生物分子(抗体或DNA)的复杂偶联问题。本专利中，我们基于Zr-MOF构建了两种不同的信号放大能力的信号探针：1.基于Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体的双重信号放大探针，其原理为利用在Zr-MOF表面原位生成大量Pt NPs，其次并偶联大量的酶标抗体实现双重信号放大探针；2.基于Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链的五重信号放大探针，其原理为在Zr-MOF表面原位生成大量Pt NPs，Pt NPs上偶联大量的酶标抗体，在Zr-MOF的孔隙中包埋大量HRP，Zr离子共价连接大量杂交链信号放大的引发链，引发链触发杂交链反应进一步富集大量的HRP实现五重信号放大。其次，当检测目标物对灵敏度要求不高的时候，直接用酶标抗体进行检测。HRP酶催化TMB显色底物产生的不同颜色信号强度与靶标浓度相关，完成对靶标的定量分析。
本发明的有益效果是：
1)设备便携、成本低：在空心聚合物套管上进行实验，实验操作简便，不需要额外的洗板技术，节约枪头，成本低；
2)传感原理高效、准确性好：本发明在传统的金标准ELISA基础进行改进，因而依旧保留ELISA的固有结果准确、稳定优势；
3)包被操作简便：生物识别分子(抗原、抗体)可以通过静电吸附、疏水相互作用、氢键作用吸附在空心聚合物套管上面，避免了化学修饰；
4)检测灵敏度高：基于Zr-MOF构建的不同信号放大能力信号探针实现双重或者五重信号放大，大大提高灵敏度，针对不同的检测对象，我们可以采用不同的信号放大系统；
5)高通量检测：配合高通量移液排枪每次可最多进行96通道的高通量检测，进行大批量样本的快速以及现场分析，检测效率极高。
附图说明
图1：基于Zr-MOF的不同信号放大能力移液器免疫传感平台原理图。
图2：Zr-MOF与Zr-MOF-Pt表征图(A和C为Zr-MOF的SEM图和TEM图；B和D为Zr-MOF-Pt的SEM图和TEM图；
图3：基于自写颜色分析程序对于不同信号放大系统DON检测标准曲线对比(a：Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链；b：Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体；c：酶标抗体)；
图4：基于CCD拍照系统对于不同信号放大系统DON检测标准曲线对比(a：Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链；b：Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体；c：酶标抗体)；
图5：基于自写颜色分析程序对于PCT检测标准曲线；
图6：基于自写颜色分析程序对于IL6检测标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
试验材料及相关术语说明
DON抗体(3.5mg/mL)、DON-BSA偶联物(5.7mg/mL)：购自山东蓝都生物科技有限公司。
DON标准品：购自百灵威科技公司。
白介素6(IL6)、白介素6捕获抗体(IL6-Ab1)、白介素6酶标抗体、PCT、PCT捕获抗体(PCT-Ab1)、PCT酶标抗体：购自abcam公司。
初始一次性空心聚合物套管自设计制作。
实施例1基于Zr-MOF的不同信号放大能力的信号探针的构建
Zr-MOF的合成：将10mg H2TCPP、30mg ZrOCl2·8H2O和280mg苯甲酸溶解在10mLDMF中并加入到50mL玻璃瓶中。在300rpm、90℃条件下搅拌5h得到Zr-MOF产物。并以14,000rpm离心30min，用DMF洗涤3次，在真空烘箱中干燥，如图2中A和C。
Zr-MOF-Pt的合成：将10mg Zr-MOF分散在20mL水中。然后在悬浮液中加入100μL5％H2PtCl6搅拌1h(37℃)。随后，将2.5mL 0.4mg/mL NaBH4溶液滴入悬浮液中，剧烈搅拌3h(37℃)。最终将Zr-MOF-Pt产物进行离心(14000转，10分钟)，用水洗涤3次，最后分散在水中，如图2中B和D。
Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体的制备：在Zr-MOF-Pt中加入HRP酶标抗体(100μL，200μg/mL)并在4℃保持16小时。然后，将混合溶液用PBS洗涤3次并离心(12000rpm，10min，4℃)。
Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链的合成：Zr-MOF-Pt与HRP溶液(1mg/mL,50μL)一起孵育1小时(Zr-MOF-Pt-HRP)。接下来，在4℃下加入HRP酶标抗体(100μL，200μg/mL)和磷酸化杂交链反应引发链DNA温育16小时(Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链)。然后，将混合溶液用PBS洗涤3次并离心(12000rpm，10min，4℃)。Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链重悬于1.0mL PBS中，4℃保存。
表1不同介质结合生物分子性能对比
Figure BDA0003484026500000051
结果表明：我们的Zr-MOF-Pt材料在结合生物分子过程中不需要额外的活化试剂，从而提高偶联效率，简化实验步骤，降低成本。
实施例2呕吐毒素(DON)的比色法检测
为了验证该方法具有可调的灵敏度而适用于不同对象的检测，以对粮食中的DON为例，采用不同的信号放大系统来进行比色法检测，具体过程如下：
1)空心聚合物套管吸入呕吐毒素抗原4℃过夜，然后5％的BSA在37℃下进行封闭1h(免疫检测空心聚合物套管)，免疫检测空心聚合物套管吸入50μL DON-Ab和50μL不同浓度的DON，并在37℃下孵育30分钟，然后PBST洗涤；
2)向上述空心聚合物套管中引入100μL酶标抗体并在37℃下孵育30分钟，然后PBST洗涤；后吸入100μLTMB商用显色液在室温下避光反应15min，然后注入含有50μL的硫酸检测孔中呈黄色并对结果拍照，分析黄颜色的B值从而比色定量分析靶标含量；
以DON浓度的对数值为横坐标，颜色B值变化值的绝对值△IB为纵坐标，作标准曲线，如图3c所示；
该DON检测方法的原理如下：免疫检测空心聚合物套管内，修饰在空心聚合物套管上的DON完全抗原、DON一抗及样品中的DON三者发生免疫竞争反应，当样品DON越多时，DON一抗与DON完全抗原结合越少，与DON一抗结合HRP酶标二抗越少。因此，样品中的DON浓度与显色底物的颜色B值变化值的绝对值△IB呈正相关从而测定样品中DON。
或者：
1)空心聚合物套管吸入呕吐毒素抗原4℃过夜，然后5％的BSA在37℃下进行封闭1h(免疫检测空心聚合物套管)，免疫检测空心聚合物套管吸入50μL DON-Ab和50μL不同浓度的DON，并在37℃下孵育30分钟，然后PBST洗涤；
2)向上述空心聚合物套管中引入100μL Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体并在37℃下孵育40分钟，然后PBST洗涤；后吸入100μLTMB商用显色液在室温下避光反应15min，然后注入含有50μL的硫酸检测孔中呈黄色并对结果拍照，分析黄颜色的B值从而定量分析靶标含量；
以DON浓度的对数值为横坐标，颜色B值变化值的绝对值△IB为纵坐标，作标准曲线，如图3b所示；
该DON检测方法的原理如下：免疫检测空心聚合物套管内，修饰在空心聚合物套管上的DON完全抗原、DON一抗及样品中的DON三者发生免疫竞争反应，当样品DON越多时，DON一抗与DON完全抗原结合越少，与DON一抗结合的Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体越少。因此，样品中的DON浓度与显色底物的颜色B值变化值的绝对值△IB呈正相关从而测定样品中DON。
或者：
1)空心聚合物套管吸入呕吐毒素抗原4℃过夜，然后5％的BSA在37℃下进行封闭1h(免疫检测空心聚合物套管)，免疫检测空心聚合物套管吸入50μL DON-Ab和50μL不同浓度的DON，并在37℃下孵育30分钟，然后PBST洗涤；
2)向上述空心聚合物套管中引入100μLZr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链并在37℃下孵育40分钟，然后PBST洗涤；
3)向上述空心聚合物套管中引入100μL杂交链反应放大系统在37℃下温育90分钟，然后PBST洗涤；
4)向上述空心聚合物套管中加入SA-HRP溶液在37℃下温育30分钟，然后PBST洗涤，吸入100μLTMB商用显色液在室温下避光反应10min，然后注入含有50μL的硫酸检测孔中呈黄色并对结果拍照，分析黄颜色的B值从而定量分析靶标含量；
以DON浓度的对数值为横坐标，颜色B值变化值的绝对值△IB为纵坐标，作标准曲线，如图3a所示；
该DON检测方法的原理如下：免疫检测空心聚合物套管内，修饰在空心聚合物套管上的DON完全抗原、DON一抗及样品中的DON三者发生免疫竞争反应，当样品DON越多时，DON一抗与DON完全抗原结合越少，与DON一抗结合的Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链越少，然后结合的SA-HRP酶也就越少。因此，样品中的DON浓度与显色底物的颜色B值变化值的绝对值△IB呈正相关从而测定样品中DON。
从图3中可知，在相同的条件下，采用不同的信号放大系统可得到不同检测线性范围以及检测灵敏度，满足不同检测要求需要，因此说明本专利可以根据不同待测物选择不同的信号放大系统进而实现精准检测。
表2 ELISA与自动化空心聚合物套管pELISA性能对比
Figure BDA0003484026500000071
实施例3呕吐毒素(DON)的化学发光法检测
为了验证该方法具有可调的灵敏度而适用于不同对象的检测，以对粮食中的DON为例，采用不同的信号放大系统来进行化学发光法检测，具体过程如下：
1)空心聚合物套管吸入呕吐毒素抗原4℃过夜，然后5％的BSA在37℃下进行封闭1h(免疫检测空心聚合物套管)，免疫检测空心聚合物套管吸入50μL DON-Ab和50μL不同浓度的DON，并在37℃下孵育30分钟，然后PBST洗涤；
2)向上述空心聚合物套管中引入100μL酶标抗体并在37℃下孵育30分钟，然后PBST洗涤；催化发光底物产生信号，结合CCD拍照系统进行定量分析靶标，光强度与待测目标物浓度相关从而化学发光定量分析靶标含量；
以DON浓度的对数值为横坐标，光强度变化值的绝对值△CL为纵坐标，作标准曲线，如图4c所示；
该DON检测方法的原理如下：免疫检测空心聚合物套管内，修饰在空心聚合物套管上的DON完全抗原、DON一抗及样品中的DON三者发生免疫竞争反应，当样品DON越多时，DON一抗与DON完全抗原结合越少，与DON一抗结合HRP酶标二抗越少。因此，样品中的DON浓度与发光底物产生信号变化值的绝对值△CL呈正相关从而测定样品中DON。
或者：
1)空心聚合物套管吸入呕吐毒素抗原4℃过夜，然后5％的BSA在37℃下进行封闭1h(免疫检测空心聚合物套管)，免疫检测空心聚合物套管吸入50μL DON-Ab和50μL不同浓度的DON，并在37℃下孵育30分钟，然后PBST洗涤；
2)向上述空心聚合物套管中引入100μL Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体并在37℃下孵育40分钟，然后PBST洗涤；催化发光底物产生信号，结合CCD拍照系统进行定量分析靶标，光强度与待测目标物浓度相关从而化学发光定量分析靶标含量；
以DON浓度的对数值为横坐标，光强度变化值的绝对值△CL为纵坐标，作标准曲线，如图4b所示；
该DON检测方法的原理如下：免疫检测空心聚合物套管内，修饰在空心聚合物套管上的DON完全抗原、DON一抗及样品中的DON三者发生免疫竞争反应，当样品DON越多时，DON一抗与DON完全抗原结合越少，与DON一抗结合的Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体越少。因此，样品中的DON浓度与发光底物产生信号变化值的绝对值△CL呈正相关从而测定样品中DON。
或者：
1)空心聚合物套管吸入呕吐毒素抗原4℃过夜，然后5％的BSA在37℃下进行封闭1h(免疫检测空心聚合物套管)，免疫检测空心聚合物套管吸入50μL DON-Ab和50μL不同浓度的DON，并在37℃下孵育30分钟，然后PBST洗涤；
2)向上述空心聚合物套管中引入100μLZr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链并在37℃下孵育40分钟，然后PBST洗涤；
3)向上述空心聚合物套管中引入100μL杂交链反应放大系统在37℃下温育90分钟，然后PBST洗涤；
4)向上述空心聚合物套管中加入SA-HRP溶液在37℃下温育30分钟，然后PBST洗涤，催化发光底物产生信号，结合CCD拍照系统进行定量分析靶标，光强度与待测目标物浓度相关从而化学发光定量分析靶标含量；
以DON浓度的对数值为横坐标，光强度变化值的绝对值△CL为纵坐标，作标准曲线，如图4a所示；
该DON检测方法的原理如下：免疫检测空心聚合物套管内，修饰在空心聚合物套管上的DON完全抗原、DON一抗及样品中的DON三者发生免疫竞争反应，当样品DON越多时，DON一抗与DON完全抗原结合越少，与DON一抗结合的Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链越少，然后结合的SA-HRP酶也就越少。因此，样品中的DON浓度与发光底物产生信号变化值的绝对值△CL呈正相关从而测定样品中DON。
实施例4 PCT的比色法检测
为了验证该方法能适用于不同对象的检测灵敏度要求，对人血清中的炎症标志物降钙素原(PCT)以Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体探针进行双重信号放大进行较高灵敏度检测，具体如下：
1)空心聚合物套管吸入PCT捕获抗体(PCT-Ab1)4℃过夜，然后5％的BSA在37℃下进行封闭1h(免疫检测空心聚合物套管)，免疫检测空心聚合物套管吸入100μL不同浓度的PCT，并在37℃下孵育30分钟，然后PBST洗涤；
2)向上述空心聚合物套管中引入100μL Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体探针并在37℃下孵育30分钟，然后PBST洗涤；后吸入100μLTMB商用显色液在室温下避光反应10min，然后注入含有50μL的硫酸检测孔中呈黄色并对结果拍照，分析黄颜色的B值从而定量分析靶标含量；
以PCT浓度的对数值为横坐标，颜色B值变化值的绝对值△IB为纵坐标，作标准曲线，如图5所示；
采用标准加入法对血清样品中的PCT残留进行检测，过程同上，结果如表3所示。
该PCT检测方法的原理如下：免疫检测空心聚合物套管内，修饰在空心聚合物套管上的PCT-Ab1与样品中的PCT发生免疫结合反应，当样品PCT越多时，PCT-Ab1与PCT结合就越多，与PCT-PCT-Ab1复合物结合的Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体就越多，提高的灵敏度来源于Zr-MOF富集的Pt NPs和HRP酶标抗体。因此，样品中的PCT浓度与显色底物的颜色B值变化值的绝对值△IB呈正相关从而测定样品中PCT。
表3.采用标准加入法对人血清中的PCT进行检测的结果
Figure BDA0003484026500000091
实施例5白介素6(IL6)的检测
为了验证该方法能适用于不同对象的检测灵敏度要求，对人血清中的炎症标志物炎症标志物白介素6(IL6)以Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链探针高灵敏度检测，具体如下：
1)空心聚合物套管吸入IL6捕获抗体(IL6-Ab1)4℃过夜，然后5％的BSA在37℃下进行封闭1h(免疫检测空心聚合物套管)，免疫检测空心聚合物套管吸入100μL不同浓度的IL6，并在37℃下孵育30分钟，然后PBST洗涤；
2)向上述空心聚合物套管中引入100μL Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链探针并在37℃下孵育40分钟，然后PBST洗涤；
3)向上述空心聚合物套管中引入100μL杂交链反应放大系统在37℃下温育90分钟，然后PBST洗涤；
4)向上述空心聚合物套管中加入SA-HRP溶液在37℃下温育30分钟，然后PBST洗涤，吸入100μL TMB商用显色液在室温下避光反应10min，然后注入含有50μL的硫酸检测孔中呈黄色并对结果拍照，分析黄颜色的B值从而定量分析靶标含量；
5)以IL6浓度的对数值为横坐标，颜色B值变化值的绝对值△IB为纵坐标，作标准曲线，如图6所示；
6)采用标准加入法对血清样品中的IL6的量进行检测，过程同上，结果如表4所示。
该IL6检测方法的原理如下：反应装置内，修饰在空心聚合物套管上的IL6-Ab1与样品中的IL6发生免疫结合反应，当样品IL6越多时，IL6-Ab1与IL6结合就越多，与IL6-IL6-Ab1复合物结合的Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链探针越多，然后结合的SA-HRP酶也就越多。因此，样品中的IL6浓度与显色底物的颜色B值变化值的绝对值△IB呈正相关从而测定样品中IL6。
表4.采用标准加入法对人血清中的IL6进行检测的结果
Figure BDA0003484026500000101
申请人声明，通过上述实施例来解释本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述具体实施例才能实施。所属领域的技术人员在本发明基础上进行的任何改进，或者对本发明所选用的材料的等效替换等，均落在专利的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于空心聚合物套管结合Zr-MOF的不同信号放大能力的移液器免疫传感平台，其特征在于，以空心聚合物套管作为基底，在空心聚合物套管内壁包被生物识别分子，实现了各种大分子、小分子目标物的检测。
2.如权利要求1所述的基于空心聚合物套管结合Zr-MOF的不同信号放大能力的移液器免疫传感平台，其特征在于：
所述生物识别分子为捕获抗体或检测抗体、抗体或抗原、DNA捕获探针或DNA检测探针；
所述目标物包括病毒、生物标志物、抗生素分子、农药分子、兽药分子、生物毒素、细菌或其他；还包括各种基质成分的检测对象如血清、牛奶、饮料、粮食谷物或其他；
所述空心聚合物套管是材质为聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷或聚对苯二甲酸乙二醇酯或其他。
3.权利要求1-2所述的基于空心聚合物套管结合Zr-MOF的不同信号放大能力的移液器免疫传感平台的操作方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
S1:空心聚合物套管依次进行与生物识别分子温育过夜、洗涤、牛血清蛋白封闭；
S2：上述研制生物分子修饰空心聚合物套管依次吸入待测目标物进行生物反应，反应后排出溶液并洗涤空心聚合物套管，加入酶标抗体或Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体或Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链进行反应，洗涤过量的酶标抗体或Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体或Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链后；
S3：吸入信号产生底物进行颜色变化后予以硫酸终止反应，对最终颜色进行拍照并以颜色分析软件分析颜色强度，颜色强度与待测目标物浓度相关，或者在加入酶标抗体反应后，洗涤掉过量的酶标抗体，然后吸入发光底物进而产生信号，结合CCD拍照成像系统进行定量分析靶标，光强度与待测目标物浓度相关。
4.如权利要求3所述的基于空心聚合物套管结合Zr-MOF的不同信号放大能力的移液器免疫传感平台的操作方法，其特征在于：所述Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体是按如下方法制备；
Zr-MOF是通过如下合成的：将 H2TCPP、ZrOCl2·8H2O和苯甲酸溶解在DMF中并加入到玻璃瓶中；搅拌得到Zr-MOF产物；并离心，用DMF洗涤，在真空烘箱中干燥；
Zr-MOF-Pt通过在Zr-MOF上原位还原法合成：将Zr-MOF分散在水中，然后在悬浮液中加入H2PtCl6搅拌，随后，将NaBH4溶液滴入悬浮液中搅拌，最终将Zr-MOF-Pt产物进行离心，用水洗涤，最后分散在水中，得到Zr-MOF-Pt；
Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体的制备：在Zr-MOF-Pt中加入HRP酶标抗体反应；然后，用PBS洗涤并离心，得到Zr-MOF-Pt-HRP酶标抗体。
5.如权利要求4所述的基于空心聚合物套管结合Zr-MOF的不同信号放大能力的移液器免疫传感平台的操作方法，其特征在于：所述Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链是按如下方法制备：将Zr-MOF-Pt与HRP溶液一起孵；接下来，加入HRP酶标抗体和磷酸化杂交链反应引发链DNA温育得到Zr-MOF-Pt-HRP-HRP酶标抗体-引发链。
6.如权利要求5所述的基于空心聚合物套管结合Zr-MOF的不同信号放大能力的移液器免疫传感平台，其特征在于：所述杂交链反应放大系统为生物素化的双发卡DNA。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115219709A (zh) * 2022-07-19 2022-10-21 江西农业大学 一种纳米抗体基仿生矿化型免疫探针的制备方法及其应用
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