CN115219709B - 一种纳米抗体基仿生矿化型免疫探针的制备方法及其应用 - Google Patents
一种纳米抗体基仿生矿化型免疫探针的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种纳米抗体基仿生矿化型免疫探针的制备方法及其在电化学免疫传感检测中的应用。本发明提出了以金属有机框架材料作为骨架,其内部矿化封装酰化辣根过氧化物酶分子,用于放大免疫分析信号,外部组装纳米抗体,用于识别待测物。本发明制备的免疫探针为球形,对检测物有较好的识别能力,同时因高负载辣根过氧化物酶分子而具有较强的信号放大能力。将该免疫探针用于构建黄曲霉毒素B1的电化学免疫传感器,实验表明,在以4‑氯‑1‑萘酚为辣根过氧化物酶的底物时,该免疫探针能显著提高免疫传感器的灵敏度。本发明提出的免疫探针及其工作模式在免疫分析技术领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种免疫探针的制备方法及其在电化学免疫传感器中的应用,尤其涉及一种利用MAF-7封装辣根过氧化物酶分子并同时组装纳米抗体的免疫探针结构,属于免疫分析技术领域。
背景技术
骆驼血清中存在一种天然缺失轻链的抗体(重链抗体),采用基因重组技术克隆该重链抗体可变区基因,并借助蛋白质工程技术得到的抗体分子,其晶体结构尺寸为2.5×4nm,分子量约15kD,仅为传统单克隆抗体的十分之一,因此被称为纳米抗体(Nanobody,Nb)。纳米抗体具有体积小、水溶性好、结构稳定、耐极端环境和生产成本低等特点。然而,纳米抗体因体积小和其单域特性,难以标记较多的辣根过氧化物酶(HRP)等信号分子,导致免疫分析的信号放大作用有限,灵敏度难以提高。
辣根过氧化物酶(HRP)是免疫学分析中较常用的一种酶,传统方法通常将其与免疫分子(抗体或抗原)偶联制成酶标记物,进而通过酶标记物催化底物产生显色反应达到对待测物的定量分析。然而,HRP在免疫分析中的应用有一些不足,例如:HRP热稳定性较差,保存过程中易失活;共价偶联反应较剧烈,标记过程中HRP易失活。
金属有机框架材料(MOF),是一种由有机配体和无机金属通过配位杂化形成的高度有序、多孔的晶体材料。2015年,Liang等首次报道了蛋白质可以促进MOF的合成,形成由MOF骨架包裹蛋白质的复合结构,被称为“仿生矿化MOF”(Nature Communications,2015,6,7240)。仿生矿化MOF技术可以实现生物分子的固定化,并具有反应条件温和,成本低,固定化效率高,能有效提高生物材料对热、有机溶剂和强酸强碱等环境的稳定性。目前,采用仿生矿化MOF技术固定化酶,已展示了良好的应用前景,采用各种类型MOF(包括ZIF-8,ZIF-90和MAF-7)封装、固定酶的技术均有报道(Journal ofthe American Chemical Society,2019,141,2348-2355;Biosensors&Bioelectronics,2020,169,112613;Analyticalchemistry,2020,92,14259-66),研究表明,采用MOF固定酶分子,可以解决酶分子热稳定性差、偶联过程易失活等问题。但是在利用MOF仿生矿化HRP的研究中,现有结果表现出HRP的封装效率较低,这是由于目前商业化HRP的等电点偏中性(即表面电势过高),无法实现高效封装。
如能实现HRP于MAF-7中的高效封装,并将纳米抗体组装于HRP基仿生矿化MAF-7表面,则能提高HRP的稳定性和解决纳米抗体偶联HRP数量有限等问题,有望弥补现有技术的一些不足。
发明内容
本发明目的在于针对目前纳米抗体在免疫分析领域中的不足,提出一种纳米抗体基仿生矿化MOF型免疫探针的制备方法,解决纳米抗体在免疫分析领域中灵敏度不高的问题。本发明选择生物相容性较好的MOF——MAF-7为载体、酰化HRP为封装蛋白,于生理兼容条件下合成仿生矿化型MAF-7;随后将纳米抗体组装于仿生矿化MAF-7表面,构成免疫探针,并用于AFB1的电化学免疫传感分析。该免疫探针,不仅携带了数量较多的HRP,而且可以保护HRP的生物稳定性;此外,MAF-7的孔道结构和较大的比表面积,为HRP对底物的催化提供了便利,同时借助HRP催化底物4-氯-1-萘酚(CN)形成沉淀,封锁仿生矿化MAF-7的内部孔道,阻碍氧还原探针接近电极表面,从而极大提高纳米抗体在免疫分析中的灵敏度。
本发明的目的之一在于提供一种高负载HRP的仿生矿化型MAF-7,解决HRP等酶分子作为免疫分析标记物时生物稳定性不佳的问题,以弥补生物酶分子在免疫分析领域的不足。
本发明的目的之二在于提供一种新型的纳米抗体基免疫探针,解决纳米抗体在免疫分析中信号分子标记数量过少的问题,提高纳米抗体在免疫分析中的灵敏度。
本发明的目的之三在于提供一种纳米抗体基仿生矿化MAF-7免疫探针的新工作模式,提高电化学免疫传感器对小分子污染物的响应。
本发明的上述目的是通过以下技术手段实现的:
本发明涉及的高负载HRP的仿生矿化型MAF-7,通过以下方法制备:
(1)采用碳酸氢钠缓冲液溶解HRP(浓度1~20mg/mL),将DMF溶解的适量酸酐类化合物(待修饰HRP摩尔数的20~200倍)于1h内分5~15次滴入HRP溶液中并保持震荡,每滴加完一次,立刻将pH调至8~9,最后一次滴加完后,室温搅拌反应1h,随后分别采用PBS和去离子水各透析一次,得到酰化修饰的HRP(sHRP);将HRP进行酰化修饰的目的,是为了降低其表面电势,从而提高MAF-7对HRP的封装效率。
(2)依次将3-甲基-1,2,4-三唑(250~1000mM)、硝酸锌(50mM)和sHRP(反应体系终浓度0.5~2mg/mL)溶于去离子水中,随后加入反应总体积0.25%~1.5%(V/V)的10%氨水,启动反应;反应12~48h后,离心收集产物,随后分别采用乙醇和去离子水离心洗涤产物各3次,将洗涤后的产物置于真空干燥箱中干燥,所得产物为球形的HRP基仿生矿化MAF-7。
本发明涉及的一种新型的纳米抗体基免疫探针,通过以下方法制备:
(1)采用封闭蛋白溶液重悬得到的仿生矿化MAF-7,室温震荡1h后离心去除封闭蛋白,去离子水洗涤3次,收集沉淀;
(2)采用浓度为10~1000μg/mL的抗AFB1纳米抗体溶液重悬沉淀,室温震荡30min,纳米抗体即组装于仿生矿化MAF-7表面,从而得到球形的纳米抗体基仿生矿化型免疫探针。
进一步的,本发明提出了所述的纳米抗体基仿生矿化型免疫探针在小分子污染物检测中的应用,同时涉及一种仿生矿化MOF型免疫探针的新工作模式,通过以下步骤实现:
(1)将抛光的GCE置于1mM HAuCl4/0.25M H2SO4溶液中,采用循环伏安法于GCE表面沉积AuNPs,条件如下:电位-0.2~0.6V,扫速10mV/s,循环次数为1圈,随后用超纯水清洗电极表面,氮气吹干备用,标记为AuNPs/GCE;
(2)将人工抗原AFB1-BSA稀释至40μg/mL,取5μL滴涂于AuNPs/GCE表面,4℃孵育过夜,标记为AFB1-BSA/AuNPs/GCE;
(3)将AFB1-BSA/AuNPs/GCE浸入1%卵清白蛋白(OVA)溶液中,室温封闭1h,随后离心洗涤,用于测定AFB1;
(4)将10μL按制备的免疫探针与10μL适当浓度的AFB1标准品混合后,取5μL滴涂于封闭后的AFB1-BSA/AuNPs/GCE表面,室温反应30min后,充分洗涤电极表面,随后滴涂4-氯-1-萘酚(CN)于反应后的电极表面,反应10min,去离子水清洗表面后进行电化学测试,在5mM[Fe(CN)6]3-/4-氧化还原探针下测得不同浓度AFB1的DPV信号,通过AFB1与AFB1-BSA竞争结合免疫探针后导致DPV电流变化进行线性拟合,得到AFB1线性检测范围与最低检出限,并采用面粉和大米样品进行加标回收率的测试。
与现有技术相比,本发明有益效果包括:
(1)将HRP进行酰化修饰,极大提高了MAF-7对HRP的封装效率和仿生矿化型免疫探针的信号放大作用,并进一步提高免疫分析方法的灵敏度。
(2)借助MAF-7将HRP与纳米抗体桥连,不但提高了HRP的生物稳定性,同时解决了纳米抗体信号分子标记难的关键问题。
(3)充分利用仿生矿化型免疫探针自身优势,以CN为底物,利用其被HRP催化后形成沉淀从而堵塞MAF-7孔道的特点,提高免疫分析方法的信噪比。实例结果表明,通过该方法构建的AFB1免疫传感器具有良好的灵敏度和稳定性,其中检测线性范围为50.0fg/mL-10.0ng/mL,最低检出限可达20.0fg/mL。
附图说明
图1为比较分别采用HRP和sHRP合成仿生矿化MAF-7的封装效率;(A)单独MAF-7、MAF-7@HRP和MAF-7@sHRP合成后的照片;(B)采用紫外分光光度计分析MAF-7、MAF-7@HRP和MAF-7@sHRP合成后的上清液;(C)HRP和sHRP的zeta电位;
图2为MAF-7和sHRP@MAF-7的物理表征图;(A)MAF-7的扫描电子显微镜(SEM)图;(B)sHRP@MAF-7的SEM图;(C)MAF-7、sHRP和sHRP@MAF-7的红外光谱图;(D)MAF-7和sHRP@MAF-7的X射线衍射图谱;
图3为采用荧光共聚焦显微镜分析仿生矿化型免疫探针中纳米抗体和sHRP的空间定位;sHRP采用异硫氰酸荧光素(FITC)标记,纳米抗体采用罗丹明B(RhB)标记;
图4为比较采用和不采用CN作为免疫探针底物对电流信号响应效果的比较图;
图5为利用所制备的免疫探针检测不同浓度AFB1的DPV峰电流值与AFB1浓度的线性关系图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明,但实施例对本发明不做任何形式的限定。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1一种纳米抗体基仿生矿化型免疫探针的制备方法:
(1)HRP的琥珀酰化修饰:将200mg HRP溶解于10mL碳酸氢钠缓冲液(0.13M,pH8.5)中,采用1M NaOH将溶液pH调至8~9,随后将少量DMF溶解的100mg琥珀酸酐于1h内分10次滴入HRP溶液中并保持震荡,每滴加完一次,立刻将pH调至8~9,最后一次滴加完后,室温搅拌反应1h,随后分别采用PBS和去离子水各透析一次,即得到琥珀酰化修饰的HRP(sHRP),结果如图1(C)所示,HRP经琥珀酸酐修饰后,表面电势明显下降。
(2)sHRP基仿生矿化MAF-7的合成:依次将40mL 3-甲基-1,2,4-三唑(250mM)、40mL硝酸锌(50mM)和40mg sHRP溶于去离子水中,随后加入0.4mL 10%氨水,启动反应;反应12~48h后,离心收集产物,随后分别采用乙醇和去离子水离心洗涤产物各3次,将洗涤后的产物置于真空干燥箱中干燥,所得产物为球形的MAF-7@sHRP。图1中的(A)和(B)的实验结果表明,将HRP进行酰化修饰后,能极大提高封装效率,并联合图2中的(C)和图3的实验结果表明,sHRP与MAF-7发生络合,并被封装于MAF-7内部;图2中的(B)和图3显示本发明提出的仿生矿化MAF-7为球形。
(3)纳米抗体的组装:采用浓度为50μg/mL的抗AFB1纳米抗体溶液重悬MAF-7@sHRP,室温震荡30min,纳米抗体即组装于MAF-7@sHRP表面,从而得到球形的纳米抗体基仿生矿化型免疫探针(Nb@MAF-7@sHRP),图3显示纳米抗体成功组装于MAF-7@sHRP表面。
实施例2仿生矿化型免疫探针在AFB1电化学免疫传感器中的应用:
(1)将抛光的GCE置于1mM HAuCl4/0.25M H2SO4溶液中,采用循环伏安法于GCE表面沉积纳米金,条件如下:电位-0.2~0.6V,扫速10mV/s,循环次数为1圈,随后用超纯水清洗电极表面,氮气吹干备用,标记为AuNPs/GCE;
(2)将人工抗原AFB1-BSA稀释至40μg/mL,取5μL滴涂于AuNPs/GCE表面,4℃孵育过夜,标记为AFB1-BSA/AuNPs/GCE;
(3)将AFB1-BSA/AuNPs/GCE浸入1%卵清白蛋白(OVA)溶液中,室温封闭1h,随后采用PBS洗涤,用于测定AFB1;
(4)将10μL实施例1所述制备的免疫探针与10μL不同浓度的AFB1标准品混合后,取5μL滴涂于封闭后的AFB1-BSA/AuNPs/GCE表面,室温反应30min后,采用PBS充分洗涤电极表面,随后向电极表面滴涂CN,避光反应10min,去离子水清洗表面后进行电化学测试,在5mM[Fe(CN)6]3-/4-氧化还原探针溶液中检测DPV电流信号,将AFB1浓度与对应的DPV峰电流值进行线性拟合,建立工作曲线,获得该传感器对AFB1的检测范围和最低检测限,如图5所示,检测线性范围为50.0fg/mL-10.0ng/mL,最低检出限为20.0fg/mL(S/N=3)。
图4为比较采用和不采用CN为免疫探针底物时,对特定浓度AFB1的响应效果比较,由实验结果可知,采用CN为底物时,sHRP催化CN形成沉淀堵塞MAF-7的孔道,能进一步增加检测信号。
(5)分别向AFB1阴性的面粉和大米样品中加入不同浓度的AFB1标准品,随后采用本发明提出的免疫传感器进行检测,并计算回收率。结果如表1所示:
表1
以上所述仅表达了本发明的优选实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形、改进及替代,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种纳米抗体基仿生矿化型免疫探针的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
S1、依次将3-甲基-1,2,4-三唑、酰化修饰的辣根过氧化物酶HRP和硝酸锌溶于去离子水中,随后加入适量10%的氨水,启动反应,反应一定时间后,离心收集产物,分别采用乙醇和去离子水洗涤产物,将洗涤后的产物干燥,所得产物即为球形的HRP基仿生矿化MAF-7;
S2、采用封闭蛋白溶液重悬S1中得到的仿生矿化MAF-7,封闭后离心去除多余封闭蛋白,随后采用抗黄曲霉毒素B1(AFB1)纳米抗体溶液重悬沉淀,室温震荡30min,纳米抗体即组装于仿生矿化MAF-7表面,从而得到球形的仿生矿化型免疫探针。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体基仿生矿化型免疫探针的制备方法,其特征在于:采用酸酐类化合物修饰HRP,以增加HRP分子表面的羧基,降低HRP表面电势,以提高MAF-7对HRP的封装效率。
3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体基仿生矿化型免疫探针的制备方法,其特征在于:采用碳酸氢钠缓冲液溶解HRP,随后将DMF溶解的酸酐类化合物于1h内分5~15次滴入HRP溶液中并保持震荡,每滴加完一次,立刻将pH调至8~9,最后一次滴加完后,室温搅拌反应1h,随后分别采用磷酸盐缓冲液和去离子水各透析一次。
4.根据权利要求1所述的纳米抗体基仿生矿化型免疫探针的制备方法,其特征在于:3-甲基-1,2,4-三唑与硝酸锌的摩尔比为5~20:1,合成体系中酰化修饰HRP的终浓度为0.5~2mg/mL,10%氨水的添加量为反应总体积的0.25%~1.5%(V/V),反应时间为12~48h,得到球形的HRP基仿生矿化MAF-7。
5.根据权利要求1所述的纳米抗体基仿生矿化型免疫探针的制备方法,其特征在于:所述纳米抗体为能识别待测物的特异性纳米抗体,浓度为10~1000μg/mL。
6.如权利要求1-5任一项所述制备方法得到的仿生矿化型免疫探针在电化学免疫传感器中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:检测包括以下步骤:
S1、采用电化学还原法于抛光的玻碳电极GCE表面修饰纳米金AuNPs;
S2、将人工抗原AFB1-BSA滴涂于AuNPs修饰的GCE表面,随后采用封闭蛋白封闭电极表面的空白位点;
S3、将制备的免疫探针与等体积适当浓度的AFB1标准品混合后,滴涂于修饰电极表面,待测AFB1将与AFB1-BSA竞争结合免疫探针,反应充分后清洗电极表面,并向反应后电极表面滴加4-氯-1-萘酚,HRP将催化4-氯-1-萘酚形成沉淀型产物,堵住仿生矿化型免疫探针内部的孔道,影响氧化还原探针[Fe(CN)6]3-/4-接近电极表面,随后采用电化学差分脉冲伏安法测定电流信号,获得AFB1浓度与电流值的对应关系,进而实现对AFB1的检测。
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