JP2005510706A - ダイナミックレンジが拡張された粒子利用リガンドアッセイ - Google Patents

Abstract

本発明は１または２以上の被検体を同時にアッセイする方法に冠する。本発明のアッセイは、広いダイナミックレンジと、迅速な処理時間を提供する。広い実用ダイナミックレンジは、２または３以上の独立に測定可能なクラスの被検体特異的結合パートナーでコーティングされた粒子とともに、関心のある被検体を含むかもしれないサンプルを同時にインキュベーションすることによって達成される。前記２または３以上のクラスの粒子は互いに少なくともサイズが異なる。前記被検体の濃度は、これら２つのクラス由来の計測値から複合標準曲線をもちいて得られる。

Description

本発明は、生物学的サンプル中の被検体濃度を迅速かつ定量的に検定（アッセイ）するための試薬および方法に関する。より具体的には、本発明は、関心のある単数または複数の被検体を含むかもしれないサンプルを、２または３以上の独立に測定可能なクラスの固体に支持された結合パートナーとともに同時にインキュベーションすることにより、広い実用ダイナミックレンジを有するアッセイを提供する。

被検体の存在、必要性および濃度を該被検体に対する特異性を有する結合パートナーを用いて決定するためのアッセイ技術は、例えば生化学および臨床化学の分野で頻繁に用いられる。したがって、例えば、広範囲の免疫学的技術および関連分野の技術が、特異抗体（例：特定の抗原に対するモノクローナル抗体）のような前記被検体に対する適当な結合パートナーを用いて、血清中の抗原のような物質を測定するために提案されてきた。

かかる技術の１つは競合的結合アッセイを含み、標識（例えば放射能標識）をつけたバージョンの被検体またはその類似体の既知量と、前記被検体に対して特異的な結合パートナーの比較的少量の既知量とが、測定される被検体とともにインキュベーションされ、前記標識被検体および天然に存在する被検体は前記結合パートナーに対して競合する。前記結合パートナーに結合した標識被検体の量は前記サンプル中の被検体濃度に反比例する。

別の有用な技術はサンドイッチアッセイを含む。これは、前記サンプル中の被検体に結合する過剰量の結合パートナーを用いる。標識された第２のリガンドが添加され、捕捉された被検体に結合して、サンドイッチ状態を形成し、標識の量は捕捉された被検体の量に依存する。結合し標識された被検体の量は前記サンプル中の被検体濃度に正比例する。かかるサンドイッチアッセイにおける前記結合パートナーと前記標識されたリガンドとは、前記被検体上の異なる結合部位、例えば、エピトープに対する親和性を有することが好ましい。前記リガンドは、例えば放射能、吸光性または蛍光にもとづいて計測されるように標識されることがある。

サンドイッチアッセイは、競合的結合アッセイよりも高感度を示す傾向があるので、通常は好ましい。高感度は、例えば、ナノモル／Ｌからピコモル／Ｌの範囲またはさらに低い濃度で血清中に存在する抗原を定量する、臨床検査室での免疫アッセイでは必須であることがわかるであろう。しかし、サンドイッチアッセイは、被検体上に２つの結合部位が存在することを要する。したがって、競合的な形式のほうが低分子については採用されるが、それは、低分子では、結合部位が２つ存在しないか、あるいは、立体的障害を起こす場合があるからである。

上記のタイプのアッセイの両方における結合パートナーは、結合した被検体と、競合する標識または被検体に結合した標識との単離を促進するために、固体支持体に結合される点で共通する。したがって、例えば前記結合パートナーは、未結合の過剰な標識リガンドを洗浄して除去するために、反応容器の表面、例えば適当なプラスチック材料でできたマイクロタイタープレートのウェルの表面に結合される場合がある。

代替的に、前記結合パートナーは、例えばポリスチレンまたはポリアクリル酸のような、適当なプラスチック材料でできた粒子のアレイの表面に結合される場合がある。その場合には、遊離の標識から結合した被検体／標識を分離するのは、例えば、濾過か、超常磁性粒子が用いられるときには、磁界の適用かの作用である。前記粒子は、結合パートナーを覆う表面積全体を大きくするために、微視的なサイズであることが有利である。サイズのそろった（ｍｏｎｏｓｉｚｅｄ）微粒子は標準的な特性を示すので好ましい。

ビーズ利用同時測定（ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）のための免疫アッセイは、（ビーズのサイズか、数か、１または２以上の蛍光色素の取り込みかのような）弁別可能な光学特性を有するコード化された粒子を用いる。同一のコードを有する粒子は表面に同一のリガンド（例えば抗体）を受け入れるので、同一の被検体に反応する。

上記の基本的なアッセイ技術の短所は、結合した被検体および標識の分離と、これに伴う未結合の標識を除去するための洗浄のステップが、本質的に時間がかかり、労働集約的であることである。しかし、この問題は、粒子がフロー・サイトメトリーによって解析される、粒子利用アッセイ（ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ）においては原理的に回避できることが知られている。これは、逐次的に個々の粒子が励起光で照射され、前記粒子のサイズに関係がある散乱光のパルスと、例えば、前記粒子に結合した標識の量および性質に関係がある蛍光のパルスのような、さらなる信号とを発生させるやり方で、粒子の懸濁液が光度計の測定領域を横切ることを伴うのが典型的である。したがって、フロー・サイトメトリーの粒子解析に先だって未結合の標識を分離する必要はないので、フロー・サイトメトリーは均一的すなわち分離が不要なアッセイであると言われる。

臨床的アッセイ、特に、上記のアッセイ形式を用いる免疫アッセイに伴う一般的な問題は、多くの被検体は臨床的な濃度範囲が広いこと（ｗｉｄｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒａｎｇｅ）である。したがって、かかるアッセイの信号応答は、臨床的な最大値以下で飽和することがしばしば起こる。かかるアッセイの飽和した信号を与える検体は、希釈して、アッセイの範囲がより臨床的な値をカバーするようにやり直し（ｒｅｒｕｎ）を行うのが典型的である。かかる戦略は、希釈およびやり直しの頻度が低い単一アッセイでは合理的である。しかし、検体が複数の被検体についてアッセイするときには、特定の被検体について検体を再度アッセイする必要が生じる可能性が増大する。希釈およびやり直しはシステム資源を拘束するため、検体中の臨床的な濃度範囲が広いことに対処する代替的な方法が必要である。

下記の特許文献１は、フロー・サイトメトリーで弁別可能な単分散粒子の異なるタイプにそれぞれコーティングされた、高親和性および低親和性の結合パートナーを用いるアッセイ技術を説明する。この２種類の粒子の混合物と標識リガンドとの予め定められた量が被検体とともにインキュベーションされて、得られた２つのタイプの標識リガンドを結合した粒子が、フロー・サイトメトリーによって独立かつ同時に検出され、こうして得られた２つの測定値から前記被検体の濃度は二重標準較正曲線を参照して決定される。しかし、この方法は、前記被検体に対する２つの異なるタイプの結合パートナー（リガンド）の製造または取得を要する。さらに、それぞれの粒子のタイプは、前記結合パートナーを前記粒子に結合させる反応を別々にさせること、および、これらの結合反応のそれぞれを最適化することを必要とする。
米国特許第５，５８５，２４１号明細書

下記の特許文献２は、２つの固体形状の結合パートナーが、被検体および標識リガンドに、同時ではなく逐次的に反応させられる、アッセイを説明する。第２の固体形状の結合パートナーを添加することは、前記被検体が第１の固体形状の結合パートナーにさらに結合することを防ぎ、未結合の被検体が「洗い流され」て、前記反応を実質的に停止させる、ある種の洗浄ステップとして機能する。この方法は、追加の試薬送達ステップを必要とする短所がある。このステップは、関係するハードウェアか、スループットの時間のスライスかのいずれかを必要とするが、これらの両方とも、アッセイスループットの単位当たりに要するコストを増大させる。
米国特許第５，７３９，０４２号明細書

サンプルの希釈およびアッセイのやり直しを要しないで、サンプル中の１または２以上の被検体をアッセイする費用効率の高い方法であって、拡張されたダイナミックレンジを提供する方法の必要性が今でも存在する。

発明の概要
本発明は、サンプル中の１または２以上の被検体をアッセイする方法に関する。より具体的には、本発明は、広いダイナミックレンジおよび迅速な処理時間とを提供することができ、複数のサンプル希釈およびアッセイのやり直しの必要性を除去する、アッセイを提供する。

したがって、本発明の１つの観点は、サンプル中の被検体をアッセイする方法を提供することであって、該方法は、
（ａ）（ｉ）前記被検体に対する第１の結合パートナーを固定化した第１のクラスの粒子と、
（ｉｉ）前記被検体に対する第１の結合パートナーを有する第２のクラスの粒子とを少なくとも含む、コーティングされた粒子のセットを用意すること、
（ｂ）第１のクラスの粒子に固定化された第１の結合パートナーに結合した前記サンプル被検体を含む第１の複合体、および／または第２のクラスの粒子に固定化された第１の結合パートナーに結合した第２のサンプル被検体を含む第２の複合体の形成を可能にする条件で、前記粒子のセットの存在下に前記サンプルを同時にインキュベーションこと、
（ｃ）第１の複合体および／または第２の複合体の量を決定することを含み、
第１の結合パートナーは第１および第２のクラスの粒子に固定化され、
第１および第２のクラスの粒子は独立に測定可能で、
第１のクラスの粒子は第２のクラスの粒子より小さく、
第１の複合体および／または第２の複合体の量は、前記サンプル中の被検体の濃度を決定するものである。

１の実施態様では、前記アッセイはサンドイッチアッセイであって、前記方法は、前記被検体に対する標識された第２の結合パートナーを含むリガンドとともに前記サンプルおよび前記コーティングされた粒子のセットをインキュベーションすることを含む。

別の実施態様では、前記アッセイは競合アッセイであり、前記方法は、前記被検体の標識類似体を含むリガンドとともに前記サンプルおよびコーティングされた粒子のセットをインキュベーションすることを含む。

本発明の方法は、単一の被検体または複数の被検体を同時にアッセイするために利用することができる。

本発明のその他の長所および新規な特徴は、部分的には以下の説明に列挙され、部分的には以下の明細書を検討すると当業者にとって明らかとなり、あるいは、本発明の実施により理解されることもある。本発明の新規な特徴および長所は、添付する特許請求の範囲において具体的に指摘された、手段、組合せおよび方法によって実現され、達成される場合がある。

発明の詳細な説明
本発明は１または２以上の被検体を同時にアッセイする方法に関する。本発明のアッセイは、広いダイナミックレンジと迅速な処理時間を提供することができる。本発明のアッセイは、複数回のサンプル希釈およびサンプル処理のやり直しの必要性を除去する。さらに、本発明の方法は、余分な試薬添加のステップを除去して、アッセイのコストを減少させる。

本発明は、被検体特異的な結合パートナーでコーティングされた粒子の２または３以上の独立に測定できるクラスとともに関心のある単数または複数の被検体を含むことがあるサンプルを同時にインキュベーションすることによって、広いダイナミックレンジが達成されうるという予想外の発見に基づく。それぞれのクラスの粒子は、同一の結合パートナーでコーティングされることが好ましい。前記２または３以上のクラスの粒子は、少なくともサイズが互いに異なる。前記被検体の濃度は、組み合わされた標準曲線によって、これら２つのクラスに由来する測定値から得られる。

従来の粒子利用アッセイは、小さなビーズのような粒子の表面にコーティングされた、免疫アッセイの場合の抗体または抗原のような捕捉用の結合パートナーを用いる。前記ビーズは、アッセイの制度を向上させるために、互いにできるだけ類似することを意図して作られた。

対照的に、本発明の方法は、関心のある被検体に対する結合パートナーでコーティングされた粒子の少なくとも２つのクラスを含むセットであって、ダイナミックレンジを拡張するために、あるクラスの粒子のサイズが他のクラスの粒子のサイズと異なるセットを用いる。被検体に対する結合親和性および特異性は、粒子をコーティングするために用いられる結合パートナーの全てについて同じである。前記粒子の２または３以上のクラスの反応は、遊離被検体濃度に著しい変化を起こさずに独立に進行する。作用機序は、大きな粒子は小さな粒子よりもゆっくり拡散する被検体分子に対するアクセスが容易であるという、拡散律速的な（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｌｉｍｉｔｅｄ）速度論に依存している。例えば、大きい粒子は、低い被検体濃度でより大きい信号を生じるが、高い濃度では飽和する。小さい粒子は、低い被検体濃度では小さすぎて信頼性のある測定はできないが、もっと高い被検体濃度では測定可能な信号を発生する。全ての結合パートナーの親和性および特異性は同じであるため、１個の粒子当たり捕捉された被検体の量の違いは、結合パートナーの親和性の違いではなく、結合反応の速度論から生じる。前記少なくとも２つのサイズの粒子からの信号の比較が拡張されたダイナミックレンジをもたらす。２または３以上の異なるサイズの粒子からの信号を組み合わせることにより、総合的な測定可能範囲は広くなる場合がある。したがって、本発明の方法では、異なるクラスの粒子の間でのサイズの違いは、検出の際に粒子を弁別するための単なる手段にすぎないのではなくて、本アッセイの機能性の鍵である。

被検体特異的な結合パートナーでコーティングされた前記２または３以上のクラスの粒子は、反応混合液に同時に添加されるため、本発明の方法における１の長所は、本技術分野の他の方法で実施される追加の試薬を送達するステップを除去することである。この追加のステップは、関連するハードウェアか、スループットの時間のスライスかのいずれかを必要とするが、これらのいずれもがアッセイのスループットの単位当たりに要する費用を上昇させる。臨床化学および生物薬学的試験は両方とも非常に費用に敏感であるため、本発明の費用節減は、本技術分野の現在利用される方法よりも明らかな優越性を提供する。

したがって、本発明の１の実施態様は、サンプル中の被検体をアッセイする方法を提供し、該方法は、
（ａ）（ｉ）前記被検体に対する第１の結合パートナーを固定化した粒子の第１のクラスと、
（ｉｉ）前記被検体に対する第１の結合パートナーを固定化した粒子の第２のクラスとを少なくとも含む、コーティングされた粒子のセットを用意すること、
（ｂ）第１のクラスの粒子に固定化された第１の結合パートナーに結合された前記サンプルの被検体を含む第１の複合体、および／または、第２のクラスの粒子に固定化された前記結合パートナーに結合された前記サンプルの被検体を含む第２の複合体の形成を可能にする条件で、前記粒子のセットの存在下に前記サンプルを同時にインキュベーションすること、
（ｃ）第１の複合体および／または第２の複合体の量を決定することを含み、
前記第１および第２のクラスのコーティングされた粒子は独立に測定することができ、
第１のクラスの粒子は第２のクラスの粒子より小さく、
第１の複合体および／または第２の複合体の量は前記サンプル中の被検体の濃度を決定するものである。

１の実施態様では、前記アッセイはサンドイッチアッセイで、前記被検体に対する標識された第２の結合パートナーを含むリガンドの既知量が、前記サンプルとコーティングされた粒子のセットとともにインキュベーションされる。前記リガンドは、第１および／または第２の複合体の被検体に結合して、それぞれ第１および／または第２のサンドイッチ複合体を形成する。この実施態様では、前記サンドイッチ複合体の標識によって発生する信号は、前記サンプルの被検体の濃度に正比例する。

別の実施態様では、アッセイは競合アッセイで、被検体の標識類似体を含むリガンドの既知量が、サンプルと、コーティングされた粒子のセットとともにインキュベーションされる。前記リガンドは、第１の結合パートナーとの結合に関し前記被検体と競合し、第１のクラスの粒子に固定された結合パートナーに結合した前記リガンドを含む第３の複合体と、第２のクラスの粒子に固定された結合パートナーに結合した前記リガンドを含む第４の複合体とを形成する。この実施態様では、第３および／または第４の複合体に結合した標識によって発生した信号はサンプル被検体の濃度に反比例する。

サンドイッチアッセイおよび競合アッセイの形式の両方において、被検体の濃度は以下に説明する複合較正曲線を参照して得られる。

１の実施態様では、本発明の拡張されたダイナミックレンジの特徴は、２または３以上のクラスの粒子であって、それぞれのクラスの粒子が同一の被検体に対する同一の結合パートナーでコーティングされている粒子を含むセットを提供することによって達成される。それぞれのクラスの粒子は、少なくともサイズについて他のクラスの粒子と異なる。異なるクラスは、各クラスの粒子が、粒子の材料に装荷された（ｌｏａｄｅｄ）弁別可能で検出可能な色素のような、粒子に付随するコードも互いに異なる。したがって、前記コードは、サイズの違いに付加される、粒子の異なるクラスの間で弁別する手段となる場合がある。代替的に、前記クラスは、あるクラスの粒子が他のクラスの粒子とは異なる材料でできている点で、互いに異なる場合がある。いずれのケースにおいても、サイトメータが、異なるサイズの粒子と異なるコードとによって発生した光学信号に基づいて、各クラスの粒子の数を決定することができる。さらに、前記サイトメータは、サンドイッチ複合体の一部であるか、あるいは、各クラスの粒子に結合する標識されたリガンドの標識を検出することができる。前記サイトメータは、特定のクラスにおける個々の粒子全てからの信号を組み合わせることによって、個々の粒子についての標識による信号と、異なるクラスのそれぞれについての標識による信号とを関連付ける（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）ことができる。

１の実施態様では、被検体特異的な結合パートナーは、２または３以上のクラスの粒子に固定化されるが、粒子の全てが同一のタイプの材料でできている場合（例えば各クラスの粒子がポリスチレン粒子のようなポリマー粒子である場合）、前記２または３以上のクラスの粒子の相違点はサイズである（例えば第１のクラスは第２のクラスの粒子より直径が小さい粒子を含む場合）。さらに、１または２以上のクラスの粒子が、例えばあるクラスの粒子に装荷された色素が他のクラスに装荷された色素とは異なる場合のように、弁別可能な色素を装荷される場合がある。前記粒子に装荷される場合がある適当な色素は、シアニン色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、フルオレセイン誘導体およびローダミン誘導体を含むが、これらに限られない。

別の実施態様では、被検体−結合パートナーは、２または３以上クラスの粒子に固定化される場合があり、各クラスは別のクラスの粒子とは異なる材料でできた粒子を含む。例えば、あるクラスの粒子はポリスチレン粒子を含み、別のクラスの粒子は金粒子を含む場合がある。この実施態様では、あるクラスの粒子はそれぞれ別のクラスの粒子とはサイズが異なる。全ての実施態様において、サイズの違いは、捕捉される被検体の量の違いを生じるように主に方向付けられている。

１の実施態様では、本発明の方法は、関心のある被検体を捕捉するために、２または３以上クラスの粒子に固定化された単一の被検体特異的な結合パートナーを用いる。しがたって、この実施態様は、前記結合パートナーを入手し、前記結合パートナーを前記粒子に結合させる反応を最適化するために、たった１つの開発努力しか必要としない。しかし、本発明は、被検体当たり１つの結合パートナーを利用することに限られない。したがって、他の実施態様では、各クラスの粒子は異なる結合パートナーでコーティングされる場合があり、コーティングされた粒子のセットの全ての結合パートナーは、同一の関心のある被検体に対して特異的で、該被検体に対して同一の親和性を有する。

ここで用いられる「コーティングされた粒子」という用語は、被検体特異的な結合パートナーが固定化され、あるいは、コーティングされた担体粒子を指し、前記結合パートナーは、共有（化学的）結合または非共有結合（例えば物理的吸着）かによって前記粒子に結合されるか、あるいは、間接的な結合によって結合される。

ここで用いられる「セット」という用語は、関心のある同一の被検体に対する結合パートナーを固定化した粒子の２または３以上のクラスの集合を指す。あるクラスの粒子にコーティングされた結合パートナーは、別のクラスの粒子にコーティングされた結合パートナーと同一の場合がある。代替的には、各結合パートナーが同一の被検体に対して特異的である場合には、各クラスの粒子が異なる結合パートナーでコーティングされる。

「クラス」という用語は、特定の弁別可能なグループに属する粒子を指す。特定のクラスの粒子は同一の材料でできており、実質的に同一のサイズである。標識される場合には、特定のクラスの粒子は全て同一の標識その他のコードを含む。したがって、あるセットが第１のクラスと第２のクラスの粒子を含んでいて、第１および第２のクラスの粒子は同一の結合パートナーでコーティングされているが、第１のクラスの粒子は第２のクラスの粒子から弁別可能である場合がある。

ここで用いられる、「結合パートナー」または「特異的結合パートナー」という用語は、関心のある被検体または該被検体の類似体を特異的に認識し結合して、テストされるべきサンプル中に存在するかもしれない他の分子または物質との交差反応が無視できる、分子または部分（ｍｏｉｅｔｙ）を指す。典型的な結合パートナーは、抗原、抗原断片、レセプター、核酸、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、レクチン、プロテインＡ、プロテインＧ、ポリペプチド、アビジン、ストレプトアビジン、シクロデキストラン、クラウンエーテル、内因子（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、葉酸、結合タンパクを含むが、これらに限られない。ある被検体に対して特異的な結合パートナーは、商業的な供給源から入手される場合があるか、あるいは、当業者に知られた標準的な手順に従って調製される場合がある。被検体：結合パートナーの対の例は、ハプテン：抗体、ビオチン：アビジン、ホルモン：レセプター、ポリペプチド：抗体およびオリゴヌクレオチド：相補的なＤＮＡまたはＲＮＡを含むが、これらに限られない。

ここで用いられるところの「被検体」または「関心のある被検体」は、サンプル中の存在および／または濃度が決定されるべき物質を指す。「被検体」という用語は、特異的結合パートナーが存在するか、特異的結合パートナーが調製可能な、いずれかの物質を含む。代表的な被検体は、薬物、抗原、ハプテン、抗体、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、レセプター、酵素、レクチン、炭水化物、ステロイド、癌細胞マーカー、組織細胞、ウイルス、ビタミン、核酸および殺虫剤（ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ）を含むが、これらに限られない。

ここで用いられる「抗体」という用語は、外来物質の検出に応答して産生される免疫グロブリンを指し、無傷の分子とともに、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖのような、機能的な断片を含む。

「被検体類似体」という用語によって、関心のある被検体の結合親和性に匹敵する結合親和性で特異的結合パートナーに対して結合することができる、いずれかの分子または化学物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｔｉｔｙ）を意味する。被検体類似体は、テストされるべきサンプル中には通常は存在しない点と、該被検体類似体の存在を検出可能にするなんらかの特徴を有する点とで被検体とは異なる。かかる特徴は、典型的には、放射能のある原子、酵素、色素、基質、リンカーまたは固相のような標識である。被検体類似体は、通常、検出を容易にするために、被検体の構造と類似する部分と、相違する部分とを含む。被検体類似体は、低分子の検出用の競合アッセイに用いられるのが最もありふれている。

本発明のアッセイ法を実行するためには、被検体特異的な結合パートナーを固定化した第１および第２のクラスの粒子を少なくとも含む、コーティングされた粒子のセットを用意することが必要である。前記結合パートナーは、化学的方法（すなわち共有結合）と、物理的吸着（すなわち疎水相互作用または電荷相互作用のような非共有結合）と、間接的な方法とを介して、前記粒子に固定化または結合される場合がある。かかる方法は当業者に周知である。

コーティングされるべき粒子の適当な材料は、多糖類、スチレンポリマー、ポリアクリル酸（例えば、ポリアクリルアミドおよびヒドロキシエチル ポリメタクリレート）、ガラス、セラミック、炭素、塩化ポリビニル、タンパク質等のような、天然および合成の有機高分子を含むが、これらに限られない。スチレンポリマーは、ポリスチレンと、芳香族基を含む高分子と、ナフタレン、アントラセン等のようなさらに高分子の芳香族化合物とを含む。１の実施態様では、前記粒子はラテックスビーズである。その他の適当な粒子の材料は、金粒子、コロイド状金属およびコロイド状金属酸化物のような金属粒子を含む。

異なるサイズおよび材料の粒子は商業的に入手可能である。２つのクラスの粒子の適当なサイズは被検体のダイナミックレンジに依存する。一般に、全ての粒子が１ないし２０マイクロメータの範囲の直径を有することが好ましい。生成した信号のサイズは前記粒子の表面積に依存し、該表面積が前記直径の２乗に比例する。例えば１０マイクロメータの球形の粒子は、１５４μｍ^２の表面積がある直径７マイクロメータのビーズの２倍の表面積、すなわち３１４μｍ^２を有するので、アッセイではおよそ２倍の信号を生成する。使いやすいように、前記２つのクラスの粒子の信号比は、２ないし１６の範囲であることが好ましい。これは、粒子の直径が約１：１．４ないし１：４の範囲であることが好ましい。例えば、小さい方の粒子の直径が３マイクロメータの場合には、大きい方の粒子の直径は４ないし１２マイクロメータの範囲であることが好ましい。

本発明のサンドイッチアッセイ形式では、被検体−結合パートナーでコーティングされた粒子の前記２または３以上のクラスがいったん用意されると、アッセイは、該コーティングされた粒子の第１および第２のクラスと、関心のある被検体に特異的な第２の結合パートナーを含む標識されたリガンドの既知量との存在下で、サンプルを同時にインキュベーションすることを含む。混合物は、第１のクラスの粒子の第１の結合パートナーに結合したサンプル被検体と、前記標識されたリガンドとを含む第１のサンドイッチ複合体、および／または、第２のクラスの粒子の第１の結合パートナーに結合したサンプル被検体と、前記標識されたリガンドとを含む第２のサンドイッチ複合体の形成を可能にする条件下でインキュベーションされる。かかるインキュベーション条件は、当業者に周知であり、これ以上説明する必要はない。前記標識されたリガンドは、第１および／または第２のサンドイッチ複合体を検出する１つの手段を提供する。すなわち、第１の複合体の標識されたリガンドは第１の弁別可能な信号を発生し、第２の複合体の標識されたリガンドは第２の弁別可能な信号を発生する。第１および第２の信号は前記サンプル中の被検体の濃度に正比例する。

本発明の競合的アッセイでは、関心のある被検体に対する結合パートナーでコーティングされた粒子の２または３以上のクラスを含むセットが、前記サンプルと、関心のある被検体に対して特異的な第２の結合パートナーを含む標識されたリガンドの既知量とともに同時にインキュベーションされる。前記競合的アッセイでは、前記標識されたリガンドは、第１の結合パートナーとの結合に関してサンプル中の被検体と競合する。混合物は、さまざまな複合体の形成を可能にする条件下でインキュベーションされる。したがって、第１および第２のクラスの粒子の結合パートナーに結合した被検体を含む、それぞれ第１および第２の複合体の形成に加えて、前記標識されたリガンドに結合した第１のクラスの粒子の第１の結合パートナーを含む第３の複合体、および／または、前記標識されたリガンドに結合した第２のクラスの粒子の第１の結合パートナーを含む第４の複合体も形成される。第３の複合体の標識は第１の信号を発生し、第４の複合体の標識は第２の信号を発生して、第１および第２の信号は前記サンプル中の被検体の濃度に反比例する。

ここで用いられるところの「リガンド」という用語は、（サンドイッチアッセイの場合に）被検体か、（競合的アッセイの場合に）被検体−結合パートナーかのいずれかに特異的に結合する、化学的部分（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｉｅｔｙ）を指す。前記リガンドは、天然のものであってもよく、人工的に調製されたものであってもよい。本発明は、アッセイにおいて形成されたさまざまな複合体を検出する１つの手段として標識されたリガンドを利用する。前記標識されたリガンドは、通常は予め定められた量で用いられ、（競合的結合アッセイの場合には）第１の結合パートナーに対する親和性を有するか、サンドイッチアッセイの場合には被検体に対する親和性を有する。後者のタイプの手順では、前記標識されたリガンドと第１の結合パートナーとは、前記被検体の異なる結合部位、例えばエピトープに、結合することが好ましい。

本発明の方法は、適当な数のコーティングされた粒子のセットと、（サンドイッチアッセイについては）適当な数の第２の結合パートナーまたは（競合的アッセイについては）適当な数の標識された被検体類似体とを用いることにより、複数の被検体の同時アッセイに利用される場合もある。より具体的には、本発明は複数被検体の同時アッセイ方法を提供し、該方法はアッセイされるべき被検体の数に等しい複数のセットのコーティングされた粒子を最初に用意することを含む。本方法では、コーティングされた粒子の各セットは、特定の関心のある被検体に対して特異的で、別々に測定することができる。アッセイされるべき特定の被検体用にコーティングされた粒子の各セットは、セットに特異的な被検体に対する第１の結合パートナーでコーティングされた第１のクラスの粒子と、同一のセットに特異的な被検体に対する第１の結合パートナーでコーティングされた第２のクラスの粒子とを少なくとも含み、各セットの第１および第２のクラスは独立に測定することができる。各セットにおいて、１のクラスの粒子は他のクラスの粒子より大きい。

前記サンプルは、それぞれの関心のある被検体について複合体のセットの形成を可能にする条件で、コーティングされた粒子のセットの存在下、同時にインキュベーションされる。被検体当たり各セットの複合体は、第１のクラスの粒子に固定化された第１の結合パートナーに結合したセット特異的な被検体を含む第１の複合体、および／または、第２のクラスの前記粒子に固定化された第１の結合パートナーに結合したセット特異的な被検体を含む第２の複合体を含む。

予め定められたインキュベーション期間の後、各セットのコーティングされた粒子によって形成された第１および／または第２の複合体のそれぞれの量が測定され、この量がサンプル中の被検体の濃度を決定する。

複数の被検体が同時にアッセイされるときには、例えばフロー・サイトメトリーによって、個々のクラスの全てが別々に弁別可能であることが必要である。例を示すと、第２の結合パートナーまたは標識された類似体は、サンプル中のさまざまな被検体の異なる量を定量するために、例えば異なる色の蛍光を有する部分のような、異なる標識で標識されることがある。

本発明のアッセイ法のプロトコールは、用いられるシステム、アッセイの感度、アッセイの実行速度、被検体の特性等に応じて大幅に変更されることがある。上記のとおり、アッセイは、２または３以上のクラスのコーティングされた粒子とサンプルとを同時に化合することを含む。組み合わされた前記粒子のクラスは、サンプルおよび標識されたリガンドと同時に、あるいは、逐次的に化合されることがある。

本発明の１の実施態様では、フロー・サイトメトリーが、前記複合体の形成を検出し、随意で該複合体の定量を行い、その情報をサンプル中に存在する関心のある被検体の量の検出および測定に関連付けるために用いられる。代替的に、スキャニング・サイトメータ（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）のような、他の粒子読みとりシステム（ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｒｅａｄｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ）が用いられる場合がある。

複数被検体の同時分析を行う本発明の方法は、反射光および標識されたリガンドからの発光の側方散乱および／または前方散乱を同時に記録できるフロー・サイトメータの能力に依存する。フロー・サイトメータが用いられるときには、前記粒子は、シース流（ｓｈｅａｔｈｅｄ ｓｔｒｅａｍ）中の単一の縦列になってフロー・セルを貫流する間に、一度に１個ずつ読みとられる。１の実施態様では、標識されたリガンドは、適当な波長のエネルギーでの励起により検出可能な標識を提供する、蛍光部分（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｏｉｅｔｙ）を含む。前記粒子は、例えばサイズ、材料、標識等のような、各粒子が属するクラスを同定する識別特性を測定することにより、そして、前記標識を計測する、各粒子からの分析信号を測定することにより、一度に１個ずつ読みとられる。粒子は、発光して多数の検出器に当たる励起光に遭遇する。これらの検出器の位置および波長応答範囲は、複数のパラメータの同時測定を可能にする。これらのパラメータは、前方散乱強度と、光路内の粒子のサイズによって決定される反射レーザ光の側方散乱と、リガンドの蛍光部分に相関する光路に垂直に発光した蛍光の強度とを含む。したがって、粒子のサイズおよび蛍光部分の蛍光の両方が同時に測定および記録される。信号はデジタル形式に変換され、各粒子に関連する測定値のセットに束ねられる。

束ねられた前記測定値は、各粒子について粒子特異性および被検体信号を決定するために分析される場合がある。同一のクラスの複数粒子からの被検体信号は、例えばビーズのそれぞれからの被検体信号の平均値を計算することによって、組み合わされる場合がある。代替的に、前記粒子のそれぞれから被検体信号の中央値を計算するような、さまざまな「ロバストな手段（ｒｏｂｕｓｔ ｍｅａｎｓ）」のアルゴリズムが用いられる場合がある。

１または２以上のクラスの属する場合がある、特異性が共通な粒子のグループからの複合被検体信号は、被検体濃度が既知である較正用サンプルの反応から得られた信号の「標準曲線」からの複合信号の集合と比較され、これから被検体濃度が決定される場合がある。典型的には、粒子のクラス当たり１つの標準曲線が得られるが、しかし、２以上のクラスからの標準曲線が複合されて、当業者に知られた方法に従って「二重標準曲線」に複合される場合がある。同一の被検体について別々の標準曲線がある場合、例えば、直径が小さい方の粒子のクラスからの結果が１００を超えるときには小さい方の直径の粒子からの結果を使い、直径が大きい方の粒子のクラスからの結果が１０未満のときには大きい方の直径の粒子からの結果を使い、結果が１０ないし１００のときには２つのクラスからの結果の平均を使う、というような、アッセイ結果を測定するガイドラインが提供されることがある。

２以上の物理的効果が異なるサイズの粒子から生成する信号の量を支配するため、各粒子からの信号の予想される量と、被検体濃度との関係は、経験的に決定するのが一番よい。これは、アッセイ条件下で２つのサイズの粒子のアリコートを既知の被検体濃度の較正物（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒｓ）とともにインキュベーションすることによって実施されて、複合標準曲線を得る場合がある。未知のサンプルの濃度がこの複合標準曲線を参照して決定される場合がある。前記曲線の両極端では、１つの粒子サイズだけが有用な信号を発生する。すなわち、大きい方の粒子を含む第１のクラスのコーティングされた粒子は低い被検体濃度で有用な信号を発生し、小さい方の粒子を含む第２のクラスのコーティングされた粒子は高い被検体濃度で有用な信号を発生する。被検体濃度の中間の範囲では、両方のサイズの粒子が有用な信号を発生する。被検体濃度は、両方の粒子サイズからの測定値を用いる複合的な複数パラメータの標準曲線を用いることによって、この範囲ではより正確に測定できる場合がある。

典型的には前記リガンドの標識として用いられる蛍光部分は、吸光（光学濃度）か、適当な波長のエネルギーによって励起されるときの粒子の発光かの量の変化をもたらす。適当な蛍光色素は、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアナート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド標識、フルオレスカミン、テトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、近赤外色素、ランタニド錯体、デュオクローム（Ｄｕｏｃｈｒｏｍｅ）、ＰＥタンデム、ウルトラライト（ｕｌｔｒａｌｉｔｅ）７００およびテキサス・レッド、シアニン色素、環ロック（ｒｉｎｇ−ｌｏｃｋｅｄ）色素等を含むがこれらに限られない。本発明で用いるのに適当なその他の標識は、燐光部分、化学発光部分または生物発光部分を含む。これらの発光標識が色素として用いられるときには、レーザは必要ではないので、派生する装置（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ａｐｐａｒａｔｕｓ）は、流体力学的な装置と、適当な電子機器を備えた光検出器とを用いる。

コーティングされた粒子に結合した被検体の量は、以下の数式１で記述される。

上記の数式１において、Γはモル／ｃｍ^２単位の結合した被検体の表面濃度で、ｃ_０はモル／ｃｍ^３単位の被検体の初期濃度で、Ｄはｃｍ^２／秒単位の被検体の拡散定数で、Ｄａは、ダムケーラー（Ｄａｍｋｏｅｈｌｅｒ）数（拡散定数に対する表面捕捉速度の比）であって、以下の数式２のとおり計算される。

上記の数式２で、Ｒは粒子の半径で、τは以下の数式３のとおり計算される時定数である。

上記の数式３で、ｋ_ｆは反応前進速度定数で、Γ_０はモル／ｃｍ^２単位の結合パートナーの表面濃度で、▲オーバーライン（￣）付きのイタリック体小文字のｔ▼は、秒単位の反応時間ｔについて、

▲オーバーライン付きのイタリック体小文字のｔ▼＝ｔ／τ

として計算される、換算時間（ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｉｍｅ）である。

粒子の直径が被検体の特徴的な拡散距離に比べて小さいときには、被検体は粒子表面積の単位当たり一定の速度で捕捉される。大きい粒子は小さい粒子より多くの被検体分子を捕捉する。この依存性は、粒子表面積によるものであって、粒子の直径の２乗とともに変化する。平衡になるまで置いておくと、大きい粒子および小さい粒子は類似の被検体濃度で利用可能なリガンドを飽和するだろうが、これは異なる信号レベルで起こる。

大抵の実用的なリガンドアッセイは平衡からほど遠いところで実行される。それらの範囲の限界は、検出器システムの応答限界が原因である。標識されたリガンドは、単一の標識が結合する（低分子に典型的な）場合もあるが、あるいは、少数の（例えば２−１０個の）標識を有する（抗体に典型的な）場合もある。本発明は、それぞれの結合の事象について、非常に大きい蛍光信号が発生するように、１００−１００，０００個の蛍光標識で標識されたリガンドに結合する小さな粒子を使用することを意図する。結合の事象（例えば、標識されたリガンドによる、粒子に固定化された被検体または被検体類似体の特異的な捕捉）１回当たり多数の蛍光部分（例えば標識されたリガンド）を用いることは、非常に低濃度の被検体については検出可能性を向上させるが、検出器を過負荷にすることによって、高濃度の側での定量を制限する。大きい粒子からの信号は、小さい粒子からの信号よりもはるかに低い被検体の濃度で検出システムの限界に到達してしまう。したがって、２以上のサイズの粒子を使うことは、異なるサイズの粒子が同一の結合パートナーでコーティングされていて、同一の表面濃度が用いられるときであっても、アッセイのダイナミックレンジを拡張する。

粒子の直径が被検体の自由拡散距離に比べて大きいときには、アッセイは拡散律速的になる。これは、異なるサイズの粒子の間の信号の差を小さくし、このアプローチの有効性を限定する。しかし、本発明のアッセイに用いられる粒子は非常に小さいため、これはあまり頻繁には起こらない。また、アッセイが拡散律速的である場合には、粒子の直径に正比例して変化するだけであるとしても、信号の違いがある。

本発明は、本発明の方法を実施するための試薬を含むキットをも意図する。前記キットは、別々の容器に収納するあるいは予め混合した状態で、関心のある被検体に対する結合パートナーでコーティングされた、第１および第２のクラスの粒子を含むセットを含む。前記キットは、検出可能な標識、特に、励起エネルギーに曝されると検出可能な蛍光を発生する蛍光部分で標識されたリガンドであって、サンプル被検体または固定化された結合パートナーに結合することができて、サンプル中の被検体の検出を可能にする、別の容器に収容された標識されたリガンドを追加的に含む場合がある。

本発明のアッセイ法は、さまざまなサンプル中の被検体を検出するために用いることができる。ここで用いられるところの「サンプル」という用語は、関心のある被検体を含むことが疑われるいずれかのサンプルを指す。試験サンプルは、未処理（未希釈）の場合か、あるいは、分析前に、価格的および／または物理的に処理され、希釈され、または濃縮される場合かがある。サンプルの例は、全血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、尿、羊水、尿、排泄物、粘液、および、細胞または組織の抽出物を含む生理的な液体と、関心のある被検体を含むことが疑われるいずれかの他のタイプの液体、組織または材料とのような生物学的な供給源由来のサンプルを含むが、これらに限られない。

本発明の方法は、（１）サンプル希釈およびやり直しをしないでアッセイのダイナミックレンジを拡張し、システムのスループット全体を向上させること（２）単一のタイプの捕捉リガンドでダイナミックレンジを拡張し、複数の捕捉リガンドを開発する複雑さを回避すること、および（３）単一リガンド−粒子をコーティングするプロトコールを可能にし、異なる表面リガンド濃度の代替的なプロトコールを開発する複雑さを回避することを含む、本発明の技術分野における他の方法に比べて複数の有利な点を提供する。

本発明は、その本質的な特徴を逸脱することなく他の具体的な形式で実施される場合がある。以上に説明された実施態様は、全ての点で、例示的とみなされるべきであって、制限的とみなされるべきではない。実際、当業者は、ここに示した開示に基づいて、過度の実験を要することなく、さらなる実施態様を考えつき、製作することが容易にできる。したがって、本発明の範囲は、上記の説明よりもむしろ添付した特許請求の範囲によって示される。前記特許請求の範囲の均等物の意味および範囲内にある全ての変更は、それらの範囲内に含まれるべきである。

Claims (45)

1. サンプル中の被検体をアッセイする方法であって、
   （ａ）（ｉ）第１の被検体特異的な結合パートナーを固定化した第１のクラスの粒子と、
   （ｉｉ）第２の被検体特異的な結合パートナーを固定化した第２のクラスの粒子とを少なくとも含むコーティングされた粒子のセットを用意すること、
   （ｂ）第１のクラスの粒子に固定化された第１の結合パートナーに結合した前記被検体を含む第１の複合体、および／または、第２のクラスの粒子に固定化された第２の結合パートナーに結合した前記被検体を含む第２の複合体の形成を可能にする条件で、前記粒子のセットの存在下に前記サンプルを同時にインキュベーションすること、
   （ｃ）第１の複合体および／または第２の複合体の量を前記サンプル中の被検体の濃度に関係づけること、および、
   （ｄ）前記被検体の濃度を決定することを含み、
   第１および第２のクラスのコーティングされた粒子は独立に測定可能で、第１のクラスの粒子は第２のクラスの粒子より小さく、第１の結合パートナーと第２の結合パートナーとは前記被検体に対する特異性および結合親和性が同一である、サンプル中の被検体をアッセイする方法。
2. 第１のクラスの粒子に固定化された第１の被検体特異的な結合パートナーは、第２のクラスの粒子に固定化された第２の被検体特異的な結合パートナーと同一の種である、請求項１に記載の方法。
3. 第１のクラスの粒子に固定化された第１の被検体特異的な結合パートナーは、第２のクラスの粒子に固定化された第２の被検体特異的な結合パートナーと異なる種である、請求項１に記載の方法。
4. 前記被検体に対する標識された第３の結合パートナーを含み標識されたリガンドを用意すること、および、
   前記標識されたリガンドが第１および／または第２の複合体の前記被検体に結合することを可能にする条件で、前記粒子のセットとともに前記標識されたリガンドの既知量をインキュベーションすることを含み、
   前記決定することは、第１および／または第２の複合体の被検体に結合した標識されたリガンドによって発生したそれぞれ第１および／または第２の信号を検出することを含み、
   前記信号は前記被検体の濃度に正比例する、請求項１に記載の方法。
5. 前記濃度は複合較正曲線を参照して決定される、請求項４に記載の方法。
6. 前記標識は、蛍光部分、燐光部分、化学発光部分または生物発光部分からなるグループから選択される、請求項４に記載の方法。
7. 前記被検体の標識類似体を含む標識されたリガンドを用意すること、および、
   前記粒子のセットとともに前記標識されたリガンドの既知量をインキュベーションすることを含み、
   前記標識類似体は、第１の結合パートナーに結合し、第１のクラスの粒子に固定化された第１の結合パートナーに結合した前記標識類似体を含む第３の複合体を形成することに関して、および／または、第２の結合パートナーに結合し、第２のクラスの粒子に固定化された第２の結合パートナーに結合した前記標識類似体を含む第４の複合体を形成することに関して、前記被検体と競合し、
   前記決定することは、第３および／または第４の複合体によって発生する信号を検出することを含み、
   前記信号は、前記サンプルの被検体の濃度に反比例する、請求項１に記載の方法。
8. 前記濃度は複合較正曲線を参照して決定される、請求項７に記載の方法。
9. 前記標識は、蛍光部分、燐光部分、化学発光部分または生物発光部分からなるグループから選択される、請求項７に記載の方法。
10. 第１および第２のクラスの粒子は同じタイプの材料でできている、請求項１に記載の方法。
11. 第１および第２のクラスの粒子は異なるタイプの材料でできている、請求項１に記載の方法。
12. 第１および第２のクラスの粒子はサイズに基づいて決定される、請求項１に記載の方法。
13. 第１および第２のクラスの粒子はそれぞれ第１および第２の弁別可能な色素を含む、請求項１に記載の方法。
14. 前記被検体の濃度はフロー・サイトメトリーによって測定される、請求項１に記載の方法。
15. 前記被検体の濃度はスキャニング・サイトメトリーによって測定される、請求項１に記載の方法。
16. 第１および第２のクラスの粒子の直径の比は約１：１．４ないし１：４である、請求項１に記載の方法。
17. 第１のクラスの粒子の直径は約３マイクロメータで、第２のクラスの粒子の直径は約４ないし１２マイクロメータである、請求項１６に記載の方法。
18. 第１または第２の結合パートナーに結合する被検体の量は数式１で決定され、
    

    

    数式１において、Γはモル／ｃｍ^２単位の結合した被検体の表面濃度で、ｃ_０はモル／ｃｍ^３単位の被検体の初期濃度で、Ｄはｃｍ^２／秒単位の被検体の拡散定数で、Ｄａは、拡散定数に対する表面捕捉速度の比である、請求項１に記載の方法。
19. Ｄａは数式２で計算され、
    

    

    数式２において、Ｒは粒子の半径で、τは数式３のとおり計算され、
    

    

    数式３において、ｋ_ｆは反応前進速度定数で、Γ_０はモル／ｃｍ^２単位の結合パートナーの表面濃度で、▲オーバーライン（￣）付きのイタリック体小文字のｔ▼は、秒単位の反応時間ｔについて、
    
    ▲オーバーライン付きのイタリック体小文字のｔ▼＝ｔ／τ
    
    として計算される、請求項２１に記載の方法。
20. 複数の被検体が、弁別可能なクラスの粒子と、標識された被検体類似体または標識された被検体との予め定められた数のセットを用いてアッセイされる、請求項４に記載の方法。
21. 複数の被検体が、弁別可能なクラスの粒子と、標識された被検体類似体または標識された被検体との予め定められた数のセットを用いてアッセイされる、請求項７に記載の方法。
22. サンプル中の複数の被検体をアッセイする方法であって、
    （ａ）アッセイされるべき被検体の数に等しいコーティングされた粒子の複数のセットを用意すること、
    （ｂ）各被検体ごとの複合体のセットの形成を可能にする条件で、コーティングされた粒子の前記セットの存在下に前記サンプルを同時にインキュベーションすること、
    （ｃ）各セットのコーティングされた粒子によって形成された、第１の複合体および／または第２の複合体の量を前記サンプル中の被検体の濃度に関係づけること、および、
    （ｄ）前記被検体の濃度を決定することを含み、
    コーティングされた粒子の各セットは、関心のある特定の被検体に対して特異的で、別々に測定することができ、
    各セットは、
    （ｉ）第１の結合パートナーを固定化した第１のクラスの粒子と、
    （ｉｉ）第２の結合パートナーを固定化した第２のクラスの粒子とを少なくとも含み、
    第１および第２のクラスのコーティングされた粒子は、独立に測定することができ、第１のクラスの粒子は第２のクラスの粒子より小さく、
    第１の結合パートナーと第２の結合パートナーとはセット特異的な被検体に対する特異性および結合親和性が同じであり、
    各セットの複合体は、第１のクラスの粒子に固定化された第１の結合パートナーに結合した前記セット特異的な被検体を含む第１の複合体、および／または、第２のクラスの粒子に固定化された第２の結合パートナーに結合した前記セット特異的な被検体を含む第２の複合体を含む、サンプル中の複数の被検体をアッセイする方法。
23. アッセイされるべき被検体の数に等しい複数の標識されたリガンドを用意すること、および、
    第１および／または第２の複合体の各被検体が該被検体に特異的な標識されたリガンドに結合することを可能にする条件で、前記標識されたリガンドの既知量を、前記サンプルと、前記複数のセットとともにインキュベーションすることを含み、
    各標識されたリガンドは、特定の被検体に対して特異的な第３の結合パートナーを含み、前記決定することは、第１および／または第２の複合体の被検体に結合した前記標識されたリガンドによって発生する、それぞれ第１および／または第２の信号を検出することを含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記標識は、蛍光部分、燐光部分、化学発光部分または生物発光部分からなるグループから選択される、請求項２３に記載の方法。
25. 複数の標識されたリガンドを用意すること、および
    前記サンプルと、コーティングされた粒子の前記セットとともに、前記標識されたリガンドの既知量をインキュベーションすることを含み、
    各リガンドは、特定の被検体の標識された類似体を含み、
    前記標識された類似体は、第１および第２の結合パートナーに結合することについて前記被検体と競合し、
    前記標識された類似体のそれぞれは、第１のクラスの第１の粒子の第１の結合パートナーに結合した前記標識された類似体を含む第３の複合体、および／または、第２のクラスの粒子の第２の結合パートナーに結合した前記標識された類似体を含む第４の複合体を形成し、
    前記決定することは、第３および／または第４の複合体のそれぞれから発生する信号を検出することを含み、
    前記信号は、前記サンプルの被検体の濃度に反比例する、請求項２２に記載の方法。
26. 前記標識は、蛍光部分、燐光部分、化学発光部分または生物発光部分からなるグループから選択される、請求項２５に記載の方法。
27. 各セットの第１および第２のクラスの粒子は、それぞれ、第１および第２の弁別可能な色素を含む、請求項２２に記載の方法。
28. 各セットの第１および第２のクラスの粒子は同じタイプの材料でできている、請求項２２に記載の方法。
29. 各セットの第１および第２のクラスの粒子は異なるタイプの材料でできている、請求項２２に記載の方法。
30. 前記被検体のそれぞれの濃度はフロー・サイトメトリーによって測定される、請求項２２に記載の方法。
31. 前記被検体のそれぞれの濃度はスキャニング・サイトメトリーによって測定される、請求項２２に記載の方法。
32. 前記セットのそれぞれの第１および第２の粒子の直径の比は、約１：１．４ないし１：４の間である、請求項２２に記載の方法。
33. 第１のクラスの粒子の直径は約３マイクロメータで、第２のクラスの粒子の直径は約４ないし１２マイクロメータである、請求項３２に記載の方法。
34. 試験サンプル中の被検体をアッセイするためのキットであって、
    （ａ）（ｉ）第１の被検体特異的な結合パートナーを固定化した第１のクラスの粒子と、
    （ｉｉ）第２の被検体特異的な結合パートナーを固定化した第２のクラスの粒子とを少なくとも含むコーティングされた粒子のセットと、
    （ｂ）標識されたリガンドとを含み、
    第１および第２のクラスの粒子は独立に決定することができ、
    第１のクラスの粒子は、第２のクラスの粒子より小さく、
    第１の結合パートナーと第２の結合パートナーとは特異性および結合親和性が同じである、試験サンプル中の被検体をアッセイするためのキット。
35. 第１および第２のクラスの粒子は同一の容器手段に収容されている、請求項３４に記載のキット。
36. 第１および第２のクラスの粒子は別々の容器手段に収容されている、請求項３４に記載のキット。
37. 第１のクラスの粒子に固定化された第１の被検体特異的な結合パートナーは、第２のクラスの粒子に固定化された第２の被検体特異的な結合パートナーと同じ種である、請求項３４に記載のキット。
38. 第１のクラスの粒子に固定化された第１の被検体特異的な結合パートナーは、第２のクラスの粒子に固定化された第２の被検体特異的な結合パートナーとは異なる種である、請求項３４に記載のキット。
39. 前記標識は、蛍光部分、燐光部分、化学発光部分または生物発光部分からなるグループから選択される、請求項３４に記載のキット。
40. 第１および第２のクラスの粒子は同じタイプの材料でできている、請求項３４に記載のキット。
41. 第１および第２クラスの粒子は異なるタイプの材料でできている、請求項３４に記載のキット。
42. 第１および第２のクラスの粒子はサイズに基づいて決定される、請求項３４に記載のキット。
43. 第１および第２のクラスの粒子は、それぞれ第１および第２の弁別可能な色素を含む、請求項３４に記載のキット。
44. 第１および第２のクラスの粒子の直径の比は、約１：１．４ないし１：４である、請求項３４に記載のキット。
45. 第１のクラスの粒子の直径は、約３マイクロメータで、第２のクラスの粒子の直径は約４ないし１２マイクロメータである、請求項４４に記載のキット。