JP3553601B2 - 検定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、分析対象を検定する方法およびそのような方法において有用なキットに関する。
分析対象の存在、および、望ましくは更にその濃度を、その分析対象に対して特異性を有する結合相手を用いて測定するための検定方法は、例えば生物化学および臨床化学の分野において、頻繁に見ることができる。即ち、例えば広範囲の免疫学的方法および関連方法が、特定の抗原に対する特異的抗体(例えばモノクローナル抗体)のような分析対象に対する適切な結合相手を用いて、血清中の抗原のような物質を測定する目的で提案されている。
このような方法の1つは競合的結合検定であり、この方法では、測定すべき分析対象の標識型(例えば放射標識されたもの)の既知量およびそれに対する結合相手の比較的少量の既知量を測定すべき分析対象と共にインキュベートし、これにより、標識物質と天然の分析対象とを結合相手に対して競合させる。その後、結合相手に結合した標識分析対象の量を測定し、その量に対して逆の相関を有する天然の分析対象の濃度を予め作成した標準曲線から求める。
もう1つの有用な方法はサンドイッチ検定である。これは過剰量の結合相手を用い、それに結合する分析対象を、やはり分析対象に対する親和性を有する標識リガンドで処理することにより標識する。次に結合し、標識された分析対象の量を測定し、標準検量線を参照することにより分析対象の濃度を求めることができる。
このようなサンドイッチ検定における結合相手と標識リガンドは、好ましくは、分析対象上の異なる結合部位(例えばエピトープ)に対して親和性を有する。リガンドを例えば、放射能、吸光度または蛍光に基づいて読み取ることができるように標識してよい。
サンドイッチ検定は競合的結合検定よりも感度が高い傾向があるため通常は好ましい。例えば臨床実験室における免疫検定においては、高い感度が必須であり、このような用例においては、例えばナノモル/l〜ピコモル/lまたはそれより低い濃度で血清中に存在する抗原を定量することが必要になる場合がある。
上記した両方の種類の検定における結合相手は、結合した分析対象および競合する、または、分析対象に結合した標識物質の単離を容易にするために、一般的に固体支持体にカップリングされる。即ち、例えば、結合相手は、反応容器の表面に、例えば適当なプラスチック素材から作成されたマイクロプレートのウエルの表面にカップリングさせることにより、未結合の過剰量の標識リガンドを除去するための洗浄を容易にすることができる。
あるいは、結合相手を、例えばポリスチレンまたはポリアクリレートのような適当なプラスチック材料から作成された粒子列の表面にカップリングさせてよい。次に遊離の標識からの結合分析対象/標識の分離を、例えば、濾過により、または、超常磁性体粒子を用いる場合は、磁場を適用することにより行ってよい。結合相手により広い総面積をコーティングするためには、粒子は顕微鏡レベルの大きさであることが好都合である。単一の大きさの粒子の使用は、粒子が標準的結合特性を示すことが確実になるという理由から好ましい。
上記した基礎的検定方法の不都合な点は、結合分析対象および標識の分離、および、未結合の標準物質を除去するための関連洗浄段階が、長時間を必要とし、労働集約的であるという固有の問題を有するためである。しかしながら、この問題は、フローサイトメトリーで粒子を分析する際には、粒子系検定の場合には原則的に回避できることが知られている。これには典型的には、連続する個々の粒子が励起光線の照射を受けるように光度系の測定領域に粒子懸濁液を通過させ、粒子の大きさに関連する散乱光のパルス、および別のシグナル、例えば、粒子に結合した標識物質の量および性質に関連する蛍光のパルスの発光を生じさせることが包含される。適当な電子的検出器およびマイクロプロセッサーを用いて結果を分類して保存し、104〜105の個々の粒子の測定結果を、例えば1分のデータ獲得時間のうちに容易に得ることができる。フローサイトメトリー中の試料流の流体力学的集中により測定領域(即ち励起/検出領域内の試料流の体積)を極めて小さく、典型的には(10μm)3のオーダーにまですることにより、測定される個々の粒子の周囲の液体中に存在する未結合の標識の量が無視できるものとなる。従って、フローサイトメトリー粒子分析の前に未結合の標識物質を分離する必要が無く、従ってこれは、均質的検定、即ち、無分離検定ということができる。
特にフローサイトメトリー方法を用いて実施されるものを含むサンドイッチ検定に関わる一般的な問題点は、その動的範囲が、高い分析対象濃度で生じるフック作用として知られる現象により制限される点である。即ち、結合相手は通常は固定された量で用いられるため、理論的な最大の検出可能な分析対象の濃度は分析対象に対する結合相手の使用可能な総結合容量により決定される。しかしながら、標識リガンドも通常は固定された量で用いられるため、結合分析対象あたりの使用可能な標識の量は、分析対象濃度がこの理論的最大値を超過する場合には、溶液中に残存する過剰量の未結合の分析対象への標識の結合が増大する結果、顕著に減少する。言い換えれば、未結合の過剰量の分析対象は、標識に対して結合分析対象と競合し、これにより、結合分析対象上に固定された標識の量は減少する。その結果、結合相手が飽和する濃度を超えて分析対象濃度が増加するに従って、結合分析対象/標識の観察される濃度は減少する。従って、分析対象濃度に対する結合標識に関わるシグナル強度の検量線は、最大値まで上昇した後は分析対象濃度が更に増加するに従って減少し、その結果、例えば試料の希釈や別の検定を含む更に別の段階を実施しない限り、シグナル強度を単一の濃度値に絶対的に対応させることは不可能である。
フック作用の発生は原則的には使用される結合相手の量を増大させることにより遅延されるが、フローサイトメトリーのような測定方法では正確に検出することのできる結果を得るには粒子当たりの結合分析対象/標識の特定の最小値が必要となるため、低い分析対象濃度では感度が低下することは不可避である。
米国特許出願4595661号は、免疫検定におけるフック作用は、場合により標識され、そして/または固体担体に結合され、そして、一次結合相手抗体および標識リガンドよりも標的抗原に対して低い親和性を有するようなもう1つの抗体を用いることにより低減されることを示唆している。この低親和性抗体は高い分析対象濃度では分析対象に結合することによりフック作用の発生を遅延させるが、バックグラウンド干渉や非特異的結合が増大する結果、低分析対象濃度での検定の感度がやはり低下するのである。
同様の試みが米国特許出願4743542号にも記載されており、この例では、原理はやはり、免疫検定において標識リガンドと競合する未標識の抗体を添加することである。抗原に対する別の試薬として作用することにより、この未標識抗体は抗原濃度を一次結合相手抗体の飽和が起こるまで上昇させ、これによりフック作用の発生を延期させる。全体的な作用は、より広い範囲の抗原濃度を対象にできるが傾きの小さい検量線になってしまうことであり、その結果、何れの測定抗原濃度においても不確実性が大きくなるという不都合な点を有する。
WO−A−8911101号は、フローサイトメトリーで判別可能な種々の単分散粒子にコーティングした高親和性および低親和性の結合相手をそれぞれ用いたより高度な検定方法を記載している。この二元粒子混合物および標識リガンドの所定量を、分析対象と共にインキュベートし、そしてその後得られた二種類の標識リガンド担持粒子を、独立して、ただし同時に、フローサイトメーターにより検出し、このようにして得られた2つの測定値から二重標準検量線を参照しながら分析対象の濃度を求めることができる。
この二重アフィニティー検定方法は、標識リガンドが典型的には分析対象の標識型である結合相手に対する親和性を有しなければならないような競合的結合検定、および、標識リガンドが分析対象に対する親和性を有さなければならないサンドイッチ検定の両方に適用してよい。全ての粒子の種類をフローサイトメトリーにより個別に判別できるように、複数の二元粒子混合物を用いて複数の分析対象を同時に検定することが可能である。
二重標準検量線を使用することは、1つの試料に対する2つの測定値が一対として二重曲線に適合しなければならないため、検定の精度を高め、異常な、または誤った結果の即時検出を可能にする。2種類の粒子は別々に測定されるため、主に高親和性結合相手の関数である低濃度における感度は、低親和性結合相手の存在により相殺されることなく、これが、高分析対象濃度における高精度測定を可能にし、フック作用より優先させることにより検定の動的範囲を増大させる。これは、標識された別の抗体を用いた場合に2つの結合反応に関与するものの合計のみを測定するため低い抗原濃度では感度が低下する米国特許出願4595661号に記載されている免疫検定とは対象的である。
本発明は高度の精密さと結び付いた広く動的な作用範囲及び迅速な処理時間が種々な二元検定系、すなわち結合相手の2つの独立して測定可能な形態によって達成され、そして結合相手の2つの形態を分析対象及び標識リガンドと同時にでなくむしろ連続的に反応させる場合、分析対象濃度を二重標準曲線を使用してこれら2つの形態から得られる読取り値から得られるという驚くべき発見に基づく。
かくして本発明の一つの態様により、試料を、分析対象と親和性を持つ固体支持された結合相手の2つの独立して測定可能な形態、及び分析対象又は結合相手と親和性を持つ標識リガンドと反応させることからなる試料中の分析対象の検定方法であって、前記固体支持された結合相手の2つの独立して測定可能な形態は標識リガンドを担持する固体支持された結合相手の結果として生じる2つの形態に関するシグナルは独立して測定することができ、それにより分析対象濃度は二重標準検量曲線を参照して得ることができるようになっている前記方法において、試料を固体支持された結合相手の第一の形態と、そして適当な時間間隔を置いた後固体支持された結合相手の第二の形態と反応させることを特徴とする前記方法が提供される。
いくつかの異なる検定系及び検出方法を本発明の方法に使用することができる。例えば、固体支持された結合相手の2つの形態には2つの型の結合相手でコートされた単分散粒子であって、前記2つの型は、例えば大きさに基づく顕微鏡検査又は写真判定、又は例えば後段で一層詳しく説明する大きさ又は電気インピーダンスに基づくフローサイトメトリーにより識別することができる前記粒子からなることがある。別法として、固体支持された結合相手の第一の形態は、例えばマイクロタイター板のウェルのコートされた計量棒又はコートされた表面であり、第二の形態は適当にコートされ、好ましくは単分散である超微粒子又はビーズからなり、これにより2つの形態は分離することができ、そして検定手順完了後例えば分光測光、ラジオメトリー又は写真法を適宜使用して検定することができる。その他の代替系には、第一の形態としてコートされた超微粒子及び第二の形態として適当にコートされたフィルターの使用が含まれる。
2つの型の粒子に付着している結合相手が同じ特異性としかしながら被検物質に対する異なる親和性の水準を持つことが要求されるWO−A−8911101に記述された分析方法とは対照的に、本発明の方法で使用する固体支持された結合相手の2つの形態は同じ結合相手を使用することができる。このような単一の結合相手の使用は好ましいことであり、なぜならそれは方法及びその物質要件の両方を単純にし、一組の結合相手の相対的親和力における変動から生じる誤差の可能性を除き、そして同じ特異性であるが異なる親和性を持つ一組の結合相手を適用することが困難な分析対象に方法を適用することを可能にする。本発明の方法を粒子系に適用する場合、WO−A−8911101の方法よりも粒子濃度及びインキュベーション時間のようなパラメータを最適化する能力の点でより大きな柔軟性を示すであろう。
しかしながら、特定の適用において固体支持された結合相手の2つの形態にとっては特異性及び/又は親和性が異なることが有利であり、そしてそのような方法が本発明に包含されることは理解されるであろう。
固体支持された結合相手の第一の形態は、好ましくは本発明において比較的少量で使用され、例えば第二の形態に関して10重量%より少ない量で使用される。被覆粒子の形態である場合、これらは粒子当たり結合量を最大にし、それにより低い分析対象濃度における本方法の感度を高めるように、結合相手を比較的高負荷で担持しそして比較的少数を使用するのが好ましい。
固体支持された結合相手の第二の形態は、試料中の溶液に残存する分析対象の迅速な結合を確実にするため、比較的多量を使用するのが好ましい。従って、固体支持された結合相手の第二の形態の実質的な量、例えば標識リガンドに対して過剰量の使用は、短い全検定時間が望まれる場合特に好ましい。固体支持体への結合相手の負荷の水準は決定的なことではなく、特定の検定系に適合するように選択してよい。例えば固体支持された結合相手の第一の形態の水準より低くてよく、なぜなら第二の形態の固体支持された結合相手の主要な貢献は高い分析対象濃度におけるものであり、感度すなわち最小の検出可能な分析対象濃度のために第二の形態への結合の水準を最大にする必要はないのである。
固体支持された結合相手の第二の形態のの実質的過剰量の添加は固体支持された結合相手の第一の形態への分析対象のそれ以上の結合を有効に防ぎ、従ってある意味において、未結合分析対象を定量的に検出可能な量で「洗浄除去する」一種の洗浄段階とみなすことができる。
固体支持された結合相手の第一及び第二の形態との反応の間の時間間隔は、所定の検定系にとって実質的一定に保たれているかぎり決定的なことではない。なぜなら分析の迅速性は本発明の方法によって得られる利点の一つであり、間隔は比較的短く、例えば約15分から2時間又はそれ以上に保たれるのが好ましい。
固体支持された結合相手の第二の形態の添加は、特に実質的過剰量で使用する場合、分析対象の固体支持された結合相手の第一の形態との反応を有効に冷却するから、本発明の方法においては固体支持された結合相手の第一の形態を分析対象と平衡に到達させる必要がなく、例えば高い感度を得るために低濃度の固体支持された結合相手の第一の形態を使用する系においては24時間を要することがある。このことは全部の検定を例えば1〜2時間の短時間で完了しうることを可能にする点で本発明の実質的な利益である。
最大の再現性のためには、標識リガンドを担持する固体支持された結合相手の2つの形態に関するシグナルの検出は、好ましくは固体支持された結合相手の第二の形態との反応後あらかじめ決めた時間間隔で実施すべきであるが、多くの場合、このことは迅速は平衡が好ましくは実質的過剰量の固体支持された結合相手の第二の形態を添加することにより達成されることを考慮すると決定的ではないであろう。従って、5分から2時間の範囲の時間間隔が便利である。測定手順の自動化は、例えば非平衡条件下であらかじめ決めた間隔で測定することにより、短いインキュベーショ時間後に正確な検定を可能にするであろう。
添付の図面は本発明を例示しており、なんら本発明を制限するものではないが、図1は系の蛍光強度に対する分析対象濃度の対数プロットからなる代表的な二重標準曲線を示しており、この系においては、固体支持された結合相手の二つの形態は例えば大きさが異なる第一及び第二の粒子型p1及びp2からなり、標識リガンドは分析対象に対して親和性を示す蛍光標識を持ち、そして検出はフローサイトメトリーによる。図2Aは実施例に記述したように実験により得られた二重標準曲線を表し、図2Bは2つの曲線の二重精密プロフィールを表す。
図1から理解されるように、そのような系においては2つの検量曲線が互いに非対称的に分布するように粒子p1及びp2への結合相手の負荷、使用する粒子の量及び二つの粒子型の添加の間の時間間隔のような分析パラメータを選択することが容易に可能である。同様な非対称的に分布する検量曲線はその他の二元検定系、例えば二元粒子系の検鏡分析、マイクロタイター板/超微粒子系、超微粒子/フィルター系の使用などを含む系において同様に得ることができる。
例示のフローサイトメトリーの具体例において、検量曲線の非対称は点AとBの間のいずれの分析対象濃度についてもp1及びp2粒子の特異的且つ特徴的な一組の蛍光強度の値が存在し、p1粒子の飽和結合の開始に対応する点C及びp2粒子への標識リガンドの最大結合に対応する点Dを優に超える例外的に広い動的な作用範囲にわたって濃度測定が可能になる。分析対象濃度の不偏推定値Xは各々の標準曲線からの可観測値r1とr2により、この値が一組として二重標準曲線に適合すべきであることを考慮にいれて求められる2つの濃度x1とx2の線形組み合わせとして得ることができる。改良された濃度の推定値は関係式X=ax1+(1−a)x2から求めることができ、この場合、aの値は結果として生じるXの分散が最小になるように統計的理論により決定される。
効果の先送り又は回避に努力するUS−A−4595661及びUS−A−4743542に開示されたような先行技術の方法とは対称的に、本発明の方法はその動的な範囲を広げるためにフック効果(hook effect)の実際的且つ積極的な利用を計っていることは前述のことから明白であろう。このようにして70〜80倍に及ぶ作用範囲を実現することが可能となるであろう。
判別可能な粒子型を使用する本発明の方法の態様は適当な数の標識リガンド、第一の粒子型p1,p1′,p1″‥‥などのセット、及び第二の粒子型p2,p2′,p2″‥‥などのセットを利用することにより、すべての個々の粒子型p1,p1′,p1″‥‥、p2,p2′,p2″‥‥などを例えばフローサイトメトリーにより別々に判別可能であり、種々のp1/p2,p1′/p2′,p1″/p2″‥‥などの粒子ペアの組み合わせについて適当数の二重標準検量曲線が参照されることを条件として、多数の分析対象の同時検定に使用しうることが理解されるであろう。
本発明の方法のそのような態様は、所望により検定手順の中で非特定的結合の水準の指示を与えるように適合させることもできる。従って、検定される分析対象(1つ又は複数)に対して親和力のない結合相手、例えば無関連抗体をコートした1つ又は複数のさらに別の判別可能な粒子型、そのような粒子から例えばフローサイトメトリーの中で得られ、それに非特異的に結合した分析対象/標識の量の尺度を与えるシグナルを使用することが可能である。例えば、第一のそのようなさらに別の判別可能な粒子型(例えば比較的少量を)を第一の粒子型p1及びいずれかの別の粒子型p1′,p1″‥‥‥などと共に、そして第二のそのようなさらに別の判別可能な粒子型(例えば比較的大量を、所望により標識リガンドに対して過剰量又は実質的過剰量を)を第二の粒子型p2及びいずれかの別の粒子型p2′,p2″‥‥などと共に添加すると好都合であろう。
判別可能な粒子型を使用する本発明の方法の態様は、試料がp1及びp2の粒子型の1つ又は複数のセットと反応した後残存する未結合の標識リガンドの水準の指示を与えるように付加的に又は代替的に適合させることができる。典型的には、この方法は標識リガンド(1つ又は複数)に親和性を持つ1つ又は複数のさらに別の判別可能な粒子型p3を、例えばp1及びp2型粒子の添加後又はp2型粒子と同時に添加し、その後これらp3型粒子からのシグナル並びにp1及びp2型粒子からのシグナルを検出することを含む。
このように検出した残存未結合標識リガンドの量は分析対象濃度との相関を保持しており、サンドイッチアッセイにおいては分析対象濃度の増加と共に減少し、そして競合的分析においては分析対象濃度の増加と共に増加する。従ってp1,p2及びp3粒子のシグナルが関与して二重標準曲線により与えられるよりずっと高い精密さの分析対象濃度の推定値を与える三重標準曲線を作ることが可能である。
本発明の方法のこの変法の一つの利点はp3型粒子による未結合標識リガンドの有効な「洗浄除去」が標識リガンドを含む非特異的結合を減少させるか又は実質的完全に除去さえもし、それにより低い分析対象濃度における検定系の感度に加わる制約を最小にするか又は除去する。
この本発明方法の変法によるサンドイッチアッセイにおいては、標識リガンドに必要な親和性を与えるためp3型粒子を分析対象で都合よくコートすることができる。分析対象は、標識リガンドが親和性を示す結合部位がそこで反応するように遊離のままであるように結合すべきであることは理解されるであろう。従ってp1及び/又はp2型粒子に使用されるように最初にp3型粒子を結合相手でコートし、その後分析対象がこのようにコートされたp3型粒子に結合しうるようにし、所望により固体剤又は架橋剤を使用して結合を強化するのが好都合であろう。結合相手及び標識リガンドは通常分析対象の異なる結合部位に親和性を示すので、このようにp3型粒子に結合した分析対象は通常標識リガンドに対しても親和性を示す。
もしくはp3型粒子をサンドイッチイムノアッセイ系において、結合部位を模倣し標識リガンドがそれに対して親和性を示す抗イディオタイプ抗体でコートしてよい。
標識リガンドが結合相手に対して親和性を示すこの本発明の方法の変法による競合的分析法においては、p3型粒子を例えば標識リガンドの標識部位に親和性を示す物質でコートしてよく、その一例としては抗FITC抗体がある。
一般にフローサイトメトリー検出を使用する本発明による分析法においては、種々の粒子型を大きさにより区別するのが都合よく、これは慣用のフローサイトメーターが粒子により散乱される光の量に基づいて粒子サイズを測定できるからである。異なる組成、直径、反応性表面基などを持つ広範囲の型の単一サイズ化粒子を商業的に入手することができ、例えばDyno Particles,Lillestroem,Norwayから市販されており、そしてそのような粒子の適当なセットを本発明に使用することができる。そのような粒子は高度に単一サイズ化されており、例えば試料母集団の光散乱測定値においては1%を超えない相対的標準偏差を示し、実質的な数のそのような粒子型を混合しそして容易にフローサイトメトリー光散乱ヒストグラムにおける部分的に重複しない母集団として確認することができる。
粒子サイズの差異の結果としての電気的インピーダンスの差異により粒子が判別されるコールター原理を代替的又は付加的に利用することができる。
前述のように、多数の試料を同時に分析しなければならない場合、すべての個々の粒子が別々に例えばフローサイトメトリーにより判別できることが必要である。従って同じ標識リガンドをすべての分析対象にする場合、種々のペアp1/p2,p1′/p2′,p1″/p2″‥‥などの各々の個々の粒子型、すべてのp3粒子型及びすべての無関連抗体を担持する粒子型について検出可能な粒子特性により他の粒子型から判別できることが必要である。一方異なる標識を各分析対象について使用する場合、粒子型の種々のペアを標識からのシグナル例えば蛍光シグナルの波長における定性的差異により相互に判別することが可能になり、その結果、もし望むならすべてのp1,p1′,p1″‥‥などの粒子型について同じ大きさの粒子を使用すること、すべてのp2,p2′,p2″‥‥などの粒子型について同じ大きさの粒子の異なるセットを使用することができるであろう。ある場合、例えば分析対象が限定された特異性を持つ抗体の場合、異なる標識例えば異なる蛍光の色のそれを異なる量の種々の下位クラスの分析対象、例えばイソタイプクラスの特異抗体を定量するのに利用できるであろう。
本発明の方法に使用する固体支持体系のコーティングはこの技術分野の標準の方法を使用して実行することができる。例えば単一サイズ化粒子系をイムノアッセイ方法に使用するため抗体でコートする方法はClin.Chem.,39巻(1993年),2174〜2181頁にFrengen等により、及びそこに含まれる参照文献、並びにJ.Immunol.Meth.,126巻(1990年),183〜189頁にLindmo等により記述されている。
本発明の方法に使用される好ましい標識は蛍光測光法的フローサイトメトリーに一般に使用されるような蛍光物質、例えばフルオレセイン又はフィコエリトリン、又は遅延タイムリソルブド蛍光のための蛍光色素が使用される。そのような標識は所望により例えばClin,Chem.,31巻,2020頁にSaunders等により記述されているように、例えば0.10ミクロンの直径を持つ蛍光着色された微小球の形態でよい。測光法シグナルを生じるその他の標識は金属をベースとする系例えばコロイド状金粒子のゾルである。電気的インピーダンスに有意な差を生じることが可能な標識例えば金属(例えば金)をコールター原理により検出することができるシグナルを与えるために使用することができ、次いで粒子型の差異を光分散のような寸法依存特性により測定される。
前に述べたように標識リガンドは通常あらかじめ決めた量を使用し、そして競合的バインディングアッセイの場合は結合相手又はサンドイッチアッセイの場合は分析対象と親和性を持つようなものでなければならない。本発明の好ましい特徴を表す後者の型の方法においては、標識リガンド及び結合相手は分析対象の異なる結合部位(例えばエピトープ)に付着するのが好ましい。
一般に標識リガンドはいずれの形態の固体支持された結合相手ともその前、後又は同時に添加してよい。都合のよい方法は試料を標識リガンドと固体支持された結合相手の第一の形態との混合物に添加し、次いで第二の形態をあらかじめ決めた時間間隔の後に添加することである。
本発明の方法は広い範囲の分析対象を分析するために使用することができ、特定の分析対象にとって唯一の限定的要件は適当な固体支持系の表面に結合することが可能な特異的結合相手の存在である。分析対象及び結合相手ペアは例えば次の組合せ:
(a)抗原と特異的抗体;
(b)ホルモンとホルモンリセプター;
(c)ハプテンと抗ハプテン;
(d)ポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチド;
(e)ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド結合蛋白;
(f)ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン;
(g)酵素と酵素補因子;及び
(h)レクチンと特異的炭水化物
から選ぶことができ、このうちペアのいずれかの一方は分析対象であり、他方は結合相手である。
上記ペアの一つの一員例えばビオチン又はハプテンは所望により他の分子に付着させ、次に得られる「二次」分子を分析して「一次」分子の濃度を間接的に求めることができる。
抗原は本発明の方法に使用される好ましい分析対象の一つの範疇であり、その結果好ましい結合相手はモノクローナル抗体である。
本発明のさらに別の特徴により試料中の分析対象を検定するために使用するキットが提供され、これは
(i)各々が分析対象に親和性を持つ結合相手を担持するか又は担持するように適合されている個体支持体系の2つの別個の形態;及び
(ii)分析対象又は結合相手に親和性を持つ標識リガンド
からなり、前記固体支持体系の2つの形態は検定手順において各形態に結合してくる標識リガンドの量が独立して測定されるようになっている。
固体支持体系の2つの形態は、例えばフローサイトメトリーで判別される異なる大きさを持つ単一分散粒子のセットを含むのが有利である。そのような粒子は選ばれた結合相手を吸着するか又はそれに結合できるように選ばれた結合相手をコートするか又はその表面に吸着部位又は反応性基を担持してよい。キットの一つの好ましい変形においては固体支持体系の2つの形態が同じ結合相手を担持し、他の変形においては結合相手が異なってもよい。本発明のキットは試料中の多数の分析対象を同時に検定できるように固体支持体系好ましくは異なる型の単分散粒子の多数のペアを含んでよい。
本発明のキットは所望により、分析対象に対して親和性を持たない結合相手又は標識リガンドに対して親和性を持つ物質(例えば前にp3型粒子に関連して説明したような)を担持するか又は担持するように適合された一つ又は複数のさらに別の判別できる固体支持体系を代替的に又は付加的に包含してよい。
以下に記載する非限定的な実施例は本発明を説明するためのものである。
実施例
被験分析対象はα−胎児性蛋白(AFP)であり、供給源は患者血清であり、Norwegian Radium Hospitalで分析して3×106kIU/l含有していた。一連の既知濃度の標準溶液を分析用緩衝液(後述)で連続希釈することにより調製した。
固体支持された結合相手の2種類の形態は、表面エポキシ基を有し、それぞれ直径6.5及び7.5μmの大孔性アクリレート粒子(SINIEF,Trondheim,Norwayが開発、以下それぞれMP6.5及びMP7.5と略記する)とした。両方の粒子型はNorwegian Radium Hospitalで樹立され、AFPのエピトープに親和性を持つマウスモノクローナル抗体K57を用いて、Frengen等により、Clin.Chem.,39巻(1993年),2174〜2181頁に記述された方法により、150μg K57/mg粒子を使用してコートした。
標準リガンドはNorwegian Radium Hospitalで樹立され、AFPの異なるエピトープに親和性を持つマウスモノクローナル抗体K52から調製した。これを、ビオチンの抗体に対するモル比10:1でビオチンと反応させ、得られたビオチニル化K52(1.9mg/l)をストレプトアビジン−R−フィコエリトリン(Becton Dickinson)と6:1v/vの比で混合した。
操作において用いた分析用緩衝液はリットル当たりウシ血清アルブミン10g、ナトリウムアジド1g、及びツイーン20の1mlを含有するリン酸塩緩衝食塩水とした。
各々の一連の分析用試薬試験官において、標準抗体40μl及び分析用緩衝液100μlを血清試料20μlと混合した。最低15分間インキュベートした後、分析用緩衝液で46mg/l(100,000粒子/ml)の濃度に希釈したMP6.5の懸濁液40μlを添加した。混合物を水平回転振とう機上、室温で1時間インキュベートした後、分析用緩衝液で900mg/lの濃度に希釈したMP7.5の懸濁液40μlを添加した。試験官をさらに水平回転振とう機上でインキュベートした。各試験官の内容物の少量を1及び2時間のインキュベーション後、あらかじめ洗浄することなくフローサイトメーターで測定した。
フローサイトメトリーによる蛍光及び散乱光測定を、75ワットの水銀キセノン灯を装着したSkatron Argusフローサイトメーターを用いて実行した。使用したフィルターブロックは波長範囲510〜560nmで励起し、590〜640nmで蛍光測定を行った。粒子に関わる光散乱及び蛍光シグナルを同時に測定し、相関2パラメータヒストグラムとして登録した。光散乱ヒストグラムの適切なウインドーをゲートとすることにより、異なる粒子型の蛍光強度ヒストグラムを得た。対数蛍光ヒストグラムのメジアンチャンネルを粒子関連蛍光の尺度として記録した。
1及び2時間の最終インキュベーション後同時測定したMP6.5(p1)粒子及びMP7.5(p2)粒子の標準曲線を図2Aに示す。1時間の最終インキュベーション後のMP6.5の結果は円で表し、2時間の最終インキュベーション後のMP6.5の結果は星型で表し、1時間の最終インキュベーション後のMP7.5の結果は四角で表し、そして2時間の最終インキュベーション後のMP7.5の結果は十字で表す。MP7.5(p2)粒子の添加後異なるインキュベーションを表すその他のデータ(図示しない)は、この添加が分析対象のp1への一層の結合をもたらすという有効で印象的な効果を確認しており、そしてp2の添加後平衡が速やかに達成されることも示している。
図2Aの結果はMP6.5及びMP7.5の両方の粒子への結合は30,000kIU/lより低いAFP濃度の場合、これらの時間間隔にわたって事実上一定であることを示している。より高い分析対象濃度、延長されたインキュベーションは両粒子型への徐々に増加する結合を生じる。
図2Bに示すMP6.5及びMP7.5粒子についての精密プロフィールは変動係数(CV)
〔式中、R1は対数蛍光強度のチャンネル数として表した粒子(i)の測定された応答であり、σR1は1時間の最終インキュベーションを使用して各標準について2つの平行検定から得られる相当する標準偏差デアリ、そしてDは用量(すなわち、AFPの濃度)を表す〕として表される。
MP6.5及びMP7.5粒子の精密プロフィールは、標準曲線のいずれか一方又は両方が<0.6−>3×106kIU/lAFPの濃度範囲全体にわたってCV<10%であることを示している。
使用するMP6.5の低濃度は高い感度を保証する。20倍の高濃度でのMP7.5粒子の使用はより不十分な感度をもたらすが、この粒子に関連する応答はMP6.5標準曲線が下降し始めるAFP濃度を超えて増加する。かくして2つの標準曲線は協同して<0.6−>3×106kIU/lの範囲にわたってAFP濃度の明白な測定を与える。
分析対象の存在、および、望ましくは更にその濃度を、その分析対象に対して特異性を有する結合相手を用いて測定するための検定方法は、例えば生物化学および臨床化学の分野において、頻繁に見ることができる。即ち、例えば広範囲の免疫学的方法および関連方法が、特定の抗原に対する特異的抗体(例えばモノクローナル抗体)のような分析対象に対する適切な結合相手を用いて、血清中の抗原のような物質を測定する目的で提案されている。
このような方法の1つは競合的結合検定であり、この方法では、測定すべき分析対象の標識型(例えば放射標識されたもの)の既知量およびそれに対する結合相手の比較的少量の既知量を測定すべき分析対象と共にインキュベートし、これにより、標識物質と天然の分析対象とを結合相手に対して競合させる。その後、結合相手に結合した標識分析対象の量を測定し、その量に対して逆の相関を有する天然の分析対象の濃度を予め作成した標準曲線から求める。
もう1つの有用な方法はサンドイッチ検定である。これは過剰量の結合相手を用い、それに結合する分析対象を、やはり分析対象に対する親和性を有する標識リガンドで処理することにより標識する。次に結合し、標識された分析対象の量を測定し、標準検量線を参照することにより分析対象の濃度を求めることができる。
このようなサンドイッチ検定における結合相手と標識リガンドは、好ましくは、分析対象上の異なる結合部位(例えばエピトープ)に対して親和性を有する。リガンドを例えば、放射能、吸光度または蛍光に基づいて読み取ることができるように標識してよい。
サンドイッチ検定は競合的結合検定よりも感度が高い傾向があるため通常は好ましい。例えば臨床実験室における免疫検定においては、高い感度が必須であり、このような用例においては、例えばナノモル/l〜ピコモル/lまたはそれより低い濃度で血清中に存在する抗原を定量することが必要になる場合がある。
上記した両方の種類の検定における結合相手は、結合した分析対象および競合する、または、分析対象に結合した標識物質の単離を容易にするために、一般的に固体支持体にカップリングされる。即ち、例えば、結合相手は、反応容器の表面に、例えば適当なプラスチック素材から作成されたマイクロプレートのウエルの表面にカップリングさせることにより、未結合の過剰量の標識リガンドを除去するための洗浄を容易にすることができる。
あるいは、結合相手を、例えばポリスチレンまたはポリアクリレートのような適当なプラスチック材料から作成された粒子列の表面にカップリングさせてよい。次に遊離の標識からの結合分析対象/標識の分離を、例えば、濾過により、または、超常磁性体粒子を用いる場合は、磁場を適用することにより行ってよい。結合相手により広い総面積をコーティングするためには、粒子は顕微鏡レベルの大きさであることが好都合である。単一の大きさの粒子の使用は、粒子が標準的結合特性を示すことが確実になるという理由から好ましい。
上記した基礎的検定方法の不都合な点は、結合分析対象および標識の分離、および、未結合の標準物質を除去するための関連洗浄段階が、長時間を必要とし、労働集約的であるという固有の問題を有するためである。しかしながら、この問題は、フローサイトメトリーで粒子を分析する際には、粒子系検定の場合には原則的に回避できることが知られている。これには典型的には、連続する個々の粒子が励起光線の照射を受けるように光度系の測定領域に粒子懸濁液を通過させ、粒子の大きさに関連する散乱光のパルス、および別のシグナル、例えば、粒子に結合した標識物質の量および性質に関連する蛍光のパルスの発光を生じさせることが包含される。適当な電子的検出器およびマイクロプロセッサーを用いて結果を分類して保存し、104〜105の個々の粒子の測定結果を、例えば1分のデータ獲得時間のうちに容易に得ることができる。フローサイトメトリー中の試料流の流体力学的集中により測定領域(即ち励起/検出領域内の試料流の体積)を極めて小さく、典型的には(10μm)3のオーダーにまですることにより、測定される個々の粒子の周囲の液体中に存在する未結合の標識の量が無視できるものとなる。従って、フローサイトメトリー粒子分析の前に未結合の標識物質を分離する必要が無く、従ってこれは、均質的検定、即ち、無分離検定ということができる。
特にフローサイトメトリー方法を用いて実施されるものを含むサンドイッチ検定に関わる一般的な問題点は、その動的範囲が、高い分析対象濃度で生じるフック作用として知られる現象により制限される点である。即ち、結合相手は通常は固定された量で用いられるため、理論的な最大の検出可能な分析対象の濃度は分析対象に対する結合相手の使用可能な総結合容量により決定される。しかしながら、標識リガンドも通常は固定された量で用いられるため、結合分析対象あたりの使用可能な標識の量は、分析対象濃度がこの理論的最大値を超過する場合には、溶液中に残存する過剰量の未結合の分析対象への標識の結合が増大する結果、顕著に減少する。言い換えれば、未結合の過剰量の分析対象は、標識に対して結合分析対象と競合し、これにより、結合分析対象上に固定された標識の量は減少する。その結果、結合相手が飽和する濃度を超えて分析対象濃度が増加するに従って、結合分析対象/標識の観察される濃度は減少する。従って、分析対象濃度に対する結合標識に関わるシグナル強度の検量線は、最大値まで上昇した後は分析対象濃度が更に増加するに従って減少し、その結果、例えば試料の希釈や別の検定を含む更に別の段階を実施しない限り、シグナル強度を単一の濃度値に絶対的に対応させることは不可能である。
フック作用の発生は原則的には使用される結合相手の量を増大させることにより遅延されるが、フローサイトメトリーのような測定方法では正確に検出することのできる結果を得るには粒子当たりの結合分析対象/標識の特定の最小値が必要となるため、低い分析対象濃度では感度が低下することは不可避である。
米国特許出願4595661号は、免疫検定におけるフック作用は、場合により標識され、そして/または固体担体に結合され、そして、一次結合相手抗体および標識リガンドよりも標的抗原に対して低い親和性を有するようなもう1つの抗体を用いることにより低減されることを示唆している。この低親和性抗体は高い分析対象濃度では分析対象に結合することによりフック作用の発生を遅延させるが、バックグラウンド干渉や非特異的結合が増大する結果、低分析対象濃度での検定の感度がやはり低下するのである。
同様の試みが米国特許出願4743542号にも記載されており、この例では、原理はやはり、免疫検定において標識リガンドと競合する未標識の抗体を添加することである。抗原に対する別の試薬として作用することにより、この未標識抗体は抗原濃度を一次結合相手抗体の飽和が起こるまで上昇させ、これによりフック作用の発生を延期させる。全体的な作用は、より広い範囲の抗原濃度を対象にできるが傾きの小さい検量線になってしまうことであり、その結果、何れの測定抗原濃度においても不確実性が大きくなるという不都合な点を有する。
WO−A−8911101号は、フローサイトメトリーで判別可能な種々の単分散粒子にコーティングした高親和性および低親和性の結合相手をそれぞれ用いたより高度な検定方法を記載している。この二元粒子混合物および標識リガンドの所定量を、分析対象と共にインキュベートし、そしてその後得られた二種類の標識リガンド担持粒子を、独立して、ただし同時に、フローサイトメーターにより検出し、このようにして得られた2つの測定値から二重標準検量線を参照しながら分析対象の濃度を求めることができる。
この二重アフィニティー検定方法は、標識リガンドが典型的には分析対象の標識型である結合相手に対する親和性を有しなければならないような競合的結合検定、および、標識リガンドが分析対象に対する親和性を有さなければならないサンドイッチ検定の両方に適用してよい。全ての粒子の種類をフローサイトメトリーにより個別に判別できるように、複数の二元粒子混合物を用いて複数の分析対象を同時に検定することが可能である。
二重標準検量線を使用することは、1つの試料に対する2つの測定値が一対として二重曲線に適合しなければならないため、検定の精度を高め、異常な、または誤った結果の即時検出を可能にする。2種類の粒子は別々に測定されるため、主に高親和性結合相手の関数である低濃度における感度は、低親和性結合相手の存在により相殺されることなく、これが、高分析対象濃度における高精度測定を可能にし、フック作用より優先させることにより検定の動的範囲を増大させる。これは、標識された別の抗体を用いた場合に2つの結合反応に関与するものの合計のみを測定するため低い抗原濃度では感度が低下する米国特許出願4595661号に記載されている免疫検定とは対象的である。
本発明は高度の精密さと結び付いた広く動的な作用範囲及び迅速な処理時間が種々な二元検定系、すなわち結合相手の2つの独立して測定可能な形態によって達成され、そして結合相手の2つの形態を分析対象及び標識リガンドと同時にでなくむしろ連続的に反応させる場合、分析対象濃度を二重標準曲線を使用してこれら2つの形態から得られる読取り値から得られるという驚くべき発見に基づく。
かくして本発明の一つの態様により、試料を、分析対象と親和性を持つ固体支持された結合相手の2つの独立して測定可能な形態、及び分析対象又は結合相手と親和性を持つ標識リガンドと反応させることからなる試料中の分析対象の検定方法であって、前記固体支持された結合相手の2つの独立して測定可能な形態は標識リガンドを担持する固体支持された結合相手の結果として生じる2つの形態に関するシグナルは独立して測定することができ、それにより分析対象濃度は二重標準検量曲線を参照して得ることができるようになっている前記方法において、試料を固体支持された結合相手の第一の形態と、そして適当な時間間隔を置いた後固体支持された結合相手の第二の形態と反応させることを特徴とする前記方法が提供される。
いくつかの異なる検定系及び検出方法を本発明の方法に使用することができる。例えば、固体支持された結合相手の2つの形態には2つの型の結合相手でコートされた単分散粒子であって、前記2つの型は、例えば大きさに基づく顕微鏡検査又は写真判定、又は例えば後段で一層詳しく説明する大きさ又は電気インピーダンスに基づくフローサイトメトリーにより識別することができる前記粒子からなることがある。別法として、固体支持された結合相手の第一の形態は、例えばマイクロタイター板のウェルのコートされた計量棒又はコートされた表面であり、第二の形態は適当にコートされ、好ましくは単分散である超微粒子又はビーズからなり、これにより2つの形態は分離することができ、そして検定手順完了後例えば分光測光、ラジオメトリー又は写真法を適宜使用して検定することができる。その他の代替系には、第一の形態としてコートされた超微粒子及び第二の形態として適当にコートされたフィルターの使用が含まれる。
2つの型の粒子に付着している結合相手が同じ特異性としかしながら被検物質に対する異なる親和性の水準を持つことが要求されるWO−A−8911101に記述された分析方法とは対照的に、本発明の方法で使用する固体支持された結合相手の2つの形態は同じ結合相手を使用することができる。このような単一の結合相手の使用は好ましいことであり、なぜならそれは方法及びその物質要件の両方を単純にし、一組の結合相手の相対的親和力における変動から生じる誤差の可能性を除き、そして同じ特異性であるが異なる親和性を持つ一組の結合相手を適用することが困難な分析対象に方法を適用することを可能にする。本発明の方法を粒子系に適用する場合、WO−A−8911101の方法よりも粒子濃度及びインキュベーション時間のようなパラメータを最適化する能力の点でより大きな柔軟性を示すであろう。
しかしながら、特定の適用において固体支持された結合相手の2つの形態にとっては特異性及び/又は親和性が異なることが有利であり、そしてそのような方法が本発明に包含されることは理解されるであろう。
固体支持された結合相手の第一の形態は、好ましくは本発明において比較的少量で使用され、例えば第二の形態に関して10重量%より少ない量で使用される。被覆粒子の形態である場合、これらは粒子当たり結合量を最大にし、それにより低い分析対象濃度における本方法の感度を高めるように、結合相手を比較的高負荷で担持しそして比較的少数を使用するのが好ましい。
固体支持された結合相手の第二の形態は、試料中の溶液に残存する分析対象の迅速な結合を確実にするため、比較的多量を使用するのが好ましい。従って、固体支持された結合相手の第二の形態の実質的な量、例えば標識リガンドに対して過剰量の使用は、短い全検定時間が望まれる場合特に好ましい。固体支持体への結合相手の負荷の水準は決定的なことではなく、特定の検定系に適合するように選択してよい。例えば固体支持された結合相手の第一の形態の水準より低くてよく、なぜなら第二の形態の固体支持された結合相手の主要な貢献は高い分析対象濃度におけるものであり、感度すなわち最小の検出可能な分析対象濃度のために第二の形態への結合の水準を最大にする必要はないのである。
固体支持された結合相手の第二の形態のの実質的過剰量の添加は固体支持された結合相手の第一の形態への分析対象のそれ以上の結合を有効に防ぎ、従ってある意味において、未結合分析対象を定量的に検出可能な量で「洗浄除去する」一種の洗浄段階とみなすことができる。
固体支持された結合相手の第一及び第二の形態との反応の間の時間間隔は、所定の検定系にとって実質的一定に保たれているかぎり決定的なことではない。なぜなら分析の迅速性は本発明の方法によって得られる利点の一つであり、間隔は比較的短く、例えば約15分から2時間又はそれ以上に保たれるのが好ましい。
固体支持された結合相手の第二の形態の添加は、特に実質的過剰量で使用する場合、分析対象の固体支持された結合相手の第一の形態との反応を有効に冷却するから、本発明の方法においては固体支持された結合相手の第一の形態を分析対象と平衡に到達させる必要がなく、例えば高い感度を得るために低濃度の固体支持された結合相手の第一の形態を使用する系においては24時間を要することがある。このことは全部の検定を例えば1〜2時間の短時間で完了しうることを可能にする点で本発明の実質的な利益である。
最大の再現性のためには、標識リガンドを担持する固体支持された結合相手の2つの形態に関するシグナルの検出は、好ましくは固体支持された結合相手の第二の形態との反応後あらかじめ決めた時間間隔で実施すべきであるが、多くの場合、このことは迅速は平衡が好ましくは実質的過剰量の固体支持された結合相手の第二の形態を添加することにより達成されることを考慮すると決定的ではないであろう。従って、5分から2時間の範囲の時間間隔が便利である。測定手順の自動化は、例えば非平衡条件下であらかじめ決めた間隔で測定することにより、短いインキュベーショ時間後に正確な検定を可能にするであろう。
添付の図面は本発明を例示しており、なんら本発明を制限するものではないが、図1は系の蛍光強度に対する分析対象濃度の対数プロットからなる代表的な二重標準曲線を示しており、この系においては、固体支持された結合相手の二つの形態は例えば大きさが異なる第一及び第二の粒子型p1及びp2からなり、標識リガンドは分析対象に対して親和性を示す蛍光標識を持ち、そして検出はフローサイトメトリーによる。図2Aは実施例に記述したように実験により得られた二重標準曲線を表し、図2Bは2つの曲線の二重精密プロフィールを表す。
図1から理解されるように、そのような系においては2つの検量曲線が互いに非対称的に分布するように粒子p1及びp2への結合相手の負荷、使用する粒子の量及び二つの粒子型の添加の間の時間間隔のような分析パラメータを選択することが容易に可能である。同様な非対称的に分布する検量曲線はその他の二元検定系、例えば二元粒子系の検鏡分析、マイクロタイター板/超微粒子系、超微粒子/フィルター系の使用などを含む系において同様に得ることができる。
例示のフローサイトメトリーの具体例において、検量曲線の非対称は点AとBの間のいずれの分析対象濃度についてもp1及びp2粒子の特異的且つ特徴的な一組の蛍光強度の値が存在し、p1粒子の飽和結合の開始に対応する点C及びp2粒子への標識リガンドの最大結合に対応する点Dを優に超える例外的に広い動的な作用範囲にわたって濃度測定が可能になる。分析対象濃度の不偏推定値Xは各々の標準曲線からの可観測値r1とr2により、この値が一組として二重標準曲線に適合すべきであることを考慮にいれて求められる2つの濃度x1とx2の線形組み合わせとして得ることができる。改良された濃度の推定値は関係式X=ax1+(1−a)x2から求めることができ、この場合、aの値は結果として生じるXの分散が最小になるように統計的理論により決定される。
効果の先送り又は回避に努力するUS−A−4595661及びUS−A−4743542に開示されたような先行技術の方法とは対称的に、本発明の方法はその動的な範囲を広げるためにフック効果(hook effect)の実際的且つ積極的な利用を計っていることは前述のことから明白であろう。このようにして70〜80倍に及ぶ作用範囲を実現することが可能となるであろう。
判別可能な粒子型を使用する本発明の方法の態様は適当な数の標識リガンド、第一の粒子型p1,p1′,p1″‥‥などのセット、及び第二の粒子型p2,p2′,p2″‥‥などのセットを利用することにより、すべての個々の粒子型p1,p1′,p1″‥‥、p2,p2′,p2″‥‥などを例えばフローサイトメトリーにより別々に判別可能であり、種々のp1/p2,p1′/p2′,p1″/p2″‥‥などの粒子ペアの組み合わせについて適当数の二重標準検量曲線が参照されることを条件として、多数の分析対象の同時検定に使用しうることが理解されるであろう。
本発明の方法のそのような態様は、所望により検定手順の中で非特定的結合の水準の指示を与えるように適合させることもできる。従って、検定される分析対象(1つ又は複数)に対して親和力のない結合相手、例えば無関連抗体をコートした1つ又は複数のさらに別の判別可能な粒子型、そのような粒子から例えばフローサイトメトリーの中で得られ、それに非特異的に結合した分析対象/標識の量の尺度を与えるシグナルを使用することが可能である。例えば、第一のそのようなさらに別の判別可能な粒子型(例えば比較的少量を)を第一の粒子型p1及びいずれかの別の粒子型p1′,p1″‥‥‥などと共に、そして第二のそのようなさらに別の判別可能な粒子型(例えば比較的大量を、所望により標識リガンドに対して過剰量又は実質的過剰量を)を第二の粒子型p2及びいずれかの別の粒子型p2′,p2″‥‥などと共に添加すると好都合であろう。
判別可能な粒子型を使用する本発明の方法の態様は、試料がp1及びp2の粒子型の1つ又は複数のセットと反応した後残存する未結合の標識リガンドの水準の指示を与えるように付加的に又は代替的に適合させることができる。典型的には、この方法は標識リガンド(1つ又は複数)に親和性を持つ1つ又は複数のさらに別の判別可能な粒子型p3を、例えばp1及びp2型粒子の添加後又はp2型粒子と同時に添加し、その後これらp3型粒子からのシグナル並びにp1及びp2型粒子からのシグナルを検出することを含む。
このように検出した残存未結合標識リガンドの量は分析対象濃度との相関を保持しており、サンドイッチアッセイにおいては分析対象濃度の増加と共に減少し、そして競合的分析においては分析対象濃度の増加と共に増加する。従ってp1,p2及びp3粒子のシグナルが関与して二重標準曲線により与えられるよりずっと高い精密さの分析対象濃度の推定値を与える三重標準曲線を作ることが可能である。
本発明の方法のこの変法の一つの利点はp3型粒子による未結合標識リガンドの有効な「洗浄除去」が標識リガンドを含む非特異的結合を減少させるか又は実質的完全に除去さえもし、それにより低い分析対象濃度における検定系の感度に加わる制約を最小にするか又は除去する。
この本発明方法の変法によるサンドイッチアッセイにおいては、標識リガンドに必要な親和性を与えるためp3型粒子を分析対象で都合よくコートすることができる。分析対象は、標識リガンドが親和性を示す結合部位がそこで反応するように遊離のままであるように結合すべきであることは理解されるであろう。従ってp1及び/又はp2型粒子に使用されるように最初にp3型粒子を結合相手でコートし、その後分析対象がこのようにコートされたp3型粒子に結合しうるようにし、所望により固体剤又は架橋剤を使用して結合を強化するのが好都合であろう。結合相手及び標識リガンドは通常分析対象の異なる結合部位に親和性を示すので、このようにp3型粒子に結合した分析対象は通常標識リガンドに対しても親和性を示す。
もしくはp3型粒子をサンドイッチイムノアッセイ系において、結合部位を模倣し標識リガンドがそれに対して親和性を示す抗イディオタイプ抗体でコートしてよい。
標識リガンドが結合相手に対して親和性を示すこの本発明の方法の変法による競合的分析法においては、p3型粒子を例えば標識リガンドの標識部位に親和性を示す物質でコートしてよく、その一例としては抗FITC抗体がある。
一般にフローサイトメトリー検出を使用する本発明による分析法においては、種々の粒子型を大きさにより区別するのが都合よく、これは慣用のフローサイトメーターが粒子により散乱される光の量に基づいて粒子サイズを測定できるからである。異なる組成、直径、反応性表面基などを持つ広範囲の型の単一サイズ化粒子を商業的に入手することができ、例えばDyno Particles,Lillestroem,Norwayから市販されており、そしてそのような粒子の適当なセットを本発明に使用することができる。そのような粒子は高度に単一サイズ化されており、例えば試料母集団の光散乱測定値においては1%を超えない相対的標準偏差を示し、実質的な数のそのような粒子型を混合しそして容易にフローサイトメトリー光散乱ヒストグラムにおける部分的に重複しない母集団として確認することができる。
粒子サイズの差異の結果としての電気的インピーダンスの差異により粒子が判別されるコールター原理を代替的又は付加的に利用することができる。
前述のように、多数の試料を同時に分析しなければならない場合、すべての個々の粒子が別々に例えばフローサイトメトリーにより判別できることが必要である。従って同じ標識リガンドをすべての分析対象にする場合、種々のペアp1/p2,p1′/p2′,p1″/p2″‥‥などの各々の個々の粒子型、すべてのp3粒子型及びすべての無関連抗体を担持する粒子型について検出可能な粒子特性により他の粒子型から判別できることが必要である。一方異なる標識を各分析対象について使用する場合、粒子型の種々のペアを標識からのシグナル例えば蛍光シグナルの波長における定性的差異により相互に判別することが可能になり、その結果、もし望むならすべてのp1,p1′,p1″‥‥などの粒子型について同じ大きさの粒子を使用すること、すべてのp2,p2′,p2″‥‥などの粒子型について同じ大きさの粒子の異なるセットを使用することができるであろう。ある場合、例えば分析対象が限定された特異性を持つ抗体の場合、異なる標識例えば異なる蛍光の色のそれを異なる量の種々の下位クラスの分析対象、例えばイソタイプクラスの特異抗体を定量するのに利用できるであろう。
本発明の方法に使用する固体支持体系のコーティングはこの技術分野の標準の方法を使用して実行することができる。例えば単一サイズ化粒子系をイムノアッセイ方法に使用するため抗体でコートする方法はClin.Chem.,39巻(1993年),2174〜2181頁にFrengen等により、及びそこに含まれる参照文献、並びにJ.Immunol.Meth.,126巻(1990年),183〜189頁にLindmo等により記述されている。
本発明の方法に使用される好ましい標識は蛍光測光法的フローサイトメトリーに一般に使用されるような蛍光物質、例えばフルオレセイン又はフィコエリトリン、又は遅延タイムリソルブド蛍光のための蛍光色素が使用される。そのような標識は所望により例えばClin,Chem.,31巻,2020頁にSaunders等により記述されているように、例えば0.10ミクロンの直径を持つ蛍光着色された微小球の形態でよい。測光法シグナルを生じるその他の標識は金属をベースとする系例えばコロイド状金粒子のゾルである。電気的インピーダンスに有意な差を生じることが可能な標識例えば金属(例えば金)をコールター原理により検出することができるシグナルを与えるために使用することができ、次いで粒子型の差異を光分散のような寸法依存特性により測定される。
前に述べたように標識リガンドは通常あらかじめ決めた量を使用し、そして競合的バインディングアッセイの場合は結合相手又はサンドイッチアッセイの場合は分析対象と親和性を持つようなものでなければならない。本発明の好ましい特徴を表す後者の型の方法においては、標識リガンド及び結合相手は分析対象の異なる結合部位(例えばエピトープ)に付着するのが好ましい。
一般に標識リガンドはいずれの形態の固体支持された結合相手ともその前、後又は同時に添加してよい。都合のよい方法は試料を標識リガンドと固体支持された結合相手の第一の形態との混合物に添加し、次いで第二の形態をあらかじめ決めた時間間隔の後に添加することである。
本発明の方法は広い範囲の分析対象を分析するために使用することができ、特定の分析対象にとって唯一の限定的要件は適当な固体支持系の表面に結合することが可能な特異的結合相手の存在である。分析対象及び結合相手ペアは例えば次の組合せ:
(a)抗原と特異的抗体;
(b)ホルモンとホルモンリセプター;
(c)ハプテンと抗ハプテン;
(d)ポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチド;
(e)ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド結合蛋白;
(f)ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン;
(g)酵素と酵素補因子;及び
(h)レクチンと特異的炭水化物
から選ぶことができ、このうちペアのいずれかの一方は分析対象であり、他方は結合相手である。
上記ペアの一つの一員例えばビオチン又はハプテンは所望により他の分子に付着させ、次に得られる「二次」分子を分析して「一次」分子の濃度を間接的に求めることができる。
抗原は本発明の方法に使用される好ましい分析対象の一つの範疇であり、その結果好ましい結合相手はモノクローナル抗体である。
本発明のさらに別の特徴により試料中の分析対象を検定するために使用するキットが提供され、これは
(i)各々が分析対象に親和性を持つ結合相手を担持するか又は担持するように適合されている個体支持体系の2つの別個の形態;及び
(ii)分析対象又は結合相手に親和性を持つ標識リガンド
からなり、前記固体支持体系の2つの形態は検定手順において各形態に結合してくる標識リガンドの量が独立して測定されるようになっている。
固体支持体系の2つの形態は、例えばフローサイトメトリーで判別される異なる大きさを持つ単一分散粒子のセットを含むのが有利である。そのような粒子は選ばれた結合相手を吸着するか又はそれに結合できるように選ばれた結合相手をコートするか又はその表面に吸着部位又は反応性基を担持してよい。キットの一つの好ましい変形においては固体支持体系の2つの形態が同じ結合相手を担持し、他の変形においては結合相手が異なってもよい。本発明のキットは試料中の多数の分析対象を同時に検定できるように固体支持体系好ましくは異なる型の単分散粒子の多数のペアを含んでよい。
本発明のキットは所望により、分析対象に対して親和性を持たない結合相手又は標識リガンドに対して親和性を持つ物質(例えば前にp3型粒子に関連して説明したような)を担持するか又は担持するように適合された一つ又は複数のさらに別の判別できる固体支持体系を代替的に又は付加的に包含してよい。
以下に記載する非限定的な実施例は本発明を説明するためのものである。
実施例
被験分析対象はα−胎児性蛋白(AFP)であり、供給源は患者血清であり、Norwegian Radium Hospitalで分析して3×106kIU/l含有していた。一連の既知濃度の標準溶液を分析用緩衝液(後述)で連続希釈することにより調製した。
固体支持された結合相手の2種類の形態は、表面エポキシ基を有し、それぞれ直径6.5及び7.5μmの大孔性アクリレート粒子(SINIEF,Trondheim,Norwayが開発、以下それぞれMP6.5及びMP7.5と略記する)とした。両方の粒子型はNorwegian Radium Hospitalで樹立され、AFPのエピトープに親和性を持つマウスモノクローナル抗体K57を用いて、Frengen等により、Clin.Chem.,39巻(1993年),2174〜2181頁に記述された方法により、150μg K57/mg粒子を使用してコートした。
標準リガンドはNorwegian Radium Hospitalで樹立され、AFPの異なるエピトープに親和性を持つマウスモノクローナル抗体K52から調製した。これを、ビオチンの抗体に対するモル比10:1でビオチンと反応させ、得られたビオチニル化K52(1.9mg/l)をストレプトアビジン−R−フィコエリトリン(Becton Dickinson)と6:1v/vの比で混合した。
操作において用いた分析用緩衝液はリットル当たりウシ血清アルブミン10g、ナトリウムアジド1g、及びツイーン20の1mlを含有するリン酸塩緩衝食塩水とした。
各々の一連の分析用試薬試験官において、標準抗体40μl及び分析用緩衝液100μlを血清試料20μlと混合した。最低15分間インキュベートした後、分析用緩衝液で46mg/l(100,000粒子/ml)の濃度に希釈したMP6.5の懸濁液40μlを添加した。混合物を水平回転振とう機上、室温で1時間インキュベートした後、分析用緩衝液で900mg/lの濃度に希釈したMP7.5の懸濁液40μlを添加した。試験官をさらに水平回転振とう機上でインキュベートした。各試験官の内容物の少量を1及び2時間のインキュベーション後、あらかじめ洗浄することなくフローサイトメーターで測定した。
フローサイトメトリーによる蛍光及び散乱光測定を、75ワットの水銀キセノン灯を装着したSkatron Argusフローサイトメーターを用いて実行した。使用したフィルターブロックは波長範囲510〜560nmで励起し、590〜640nmで蛍光測定を行った。粒子に関わる光散乱及び蛍光シグナルを同時に測定し、相関2パラメータヒストグラムとして登録した。光散乱ヒストグラムの適切なウインドーをゲートとすることにより、異なる粒子型の蛍光強度ヒストグラムを得た。対数蛍光ヒストグラムのメジアンチャンネルを粒子関連蛍光の尺度として記録した。
1及び2時間の最終インキュベーション後同時測定したMP6.5(p1)粒子及びMP7.5(p2)粒子の標準曲線を図2Aに示す。1時間の最終インキュベーション後のMP6.5の結果は円で表し、2時間の最終インキュベーション後のMP6.5の結果は星型で表し、1時間の最終インキュベーション後のMP7.5の結果は四角で表し、そして2時間の最終インキュベーション後のMP7.5の結果は十字で表す。MP7.5(p2)粒子の添加後異なるインキュベーションを表すその他のデータ(図示しない)は、この添加が分析対象のp1への一層の結合をもたらすという有効で印象的な効果を確認しており、そしてp2の添加後平衡が速やかに達成されることも示している。
図2Aの結果はMP6.5及びMP7.5の両方の粒子への結合は30,000kIU/lより低いAFP濃度の場合、これらの時間間隔にわたって事実上一定であることを示している。より高い分析対象濃度、延長されたインキュベーションは両粒子型への徐々に増加する結合を生じる。
図2Bに示すMP6.5及びMP7.5粒子についての精密プロフィールは変動係数(CV)
〔式中、R1は対数蛍光強度のチャンネル数として表した粒子(i)の測定された応答であり、σR1は1時間の最終インキュベーションを使用して各標準について2つの平行検定から得られる相当する標準偏差デアリ、そしてDは用量(すなわち、AFPの濃度)を表す〕として表される。
MP6.5及びMP7.5粒子の精密プロフィールは、標準曲線のいずれか一方又は両方が<0.6−>3×106kIU/lAFPの濃度範囲全体にわたってCV<10%であることを示している。
使用するMP6.5の低濃度は高い感度を保証する。20倍の高濃度でのMP7.5粒子の使用はより不十分な感度をもたらすが、この粒子に関連する応答はMP6.5標準曲線が下降し始めるAFP濃度を超えて増加する。かくして2つの標準曲線は協同して<0.6−>3×106kIU/lの範囲にわたってAFP濃度の明白な測定を与える。
Claims (18)
- 試料を、分析対象に対して親和性を持つ固体支持された結合相手の2つの独立して測定可能な形態と、そして分析対象又は結合相手に対して親和性を持つ標識リガンドと反応させることからなる試料中の分析対象の検定方法であって、固体支持された結合相手の前記2つの独立して測定可能な形態は標識リガンドを担持する固体支持された結合相手の結果として生じる2つの形態に関連するシグナルを独立して測定することができ、それにより分析対象濃度を二重標準検量曲線を参照して得ることができるようになっている前記方法において、試料を固体支持された結合相手の第一の形態と、そしてある時間間隔の後固体支持された結合相手の第二の形態と反応させることを特徴とする前記方法。
- 固体支持された結合相手の前記2つの形態のための固体支持体が単分散粒子の2つの判別可能な型を含む請求項1記載の方法。
- 単分散粒子の前記2つの型が大きさに基づいて判別可能である請求項2記載の方法。
- 単分散粒子の前記2つの型がフローサイトメトリーにより検出される請求項2又は請求項3記載の方法。
- 固体支持された結合相手の第一の形態を固体支持された結合相手の第二の形態に関して少ない量で使用する請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 固体支持された結合相手の第二の形態を標識リガンドに関して過剰量を使用する請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 分析対象に対して親和力のない結合相手をコートした単分散粒子の1つ又はそれ以上のさらに別の判別可能な型も添加し、そしてそれから得られるシグナルを分析対象及び/又は標識リガンドの非特異的結合の尺度を与えるために使用する請求項2〜6のいずれか一項記載の方法。
- 標識リガンドに対して親和力を有する物質をコートした単分散粒子の1つ又はそれ以上のさらに別の判別可能な型も添加し、そしてそれから得られるシグナルを残存する未結合標識リガンド又は未結合標識リガンド−分析対象複合体の尺度を与えるために使用する請求項2〜7のいずれか一項記載の方法。
- 多数の分析対象を、適当な数の標識リガンド及び判別可能な粒子型のセットを使用して同時に検定する請求項2〜8のいずれか一項記載の方法。
- 標識リガンドの標識成分が蛍光物質である請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 分析対象が抗原であり、そしてそれに対する結合相手がモノクローナル抗体である請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 同じ結合相手を固体支持された結合相手の2つの独立して測定可能な形態に使用する請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 試料中の分析対象の検定に使用するためのキットであって、そのキットは
(i)各々が分析対象に対して親和性を持つ同じ結合相手を担持する固体支持体系の2つの別個の形態;及び
(ii)分析対象又は結合相手に対して親和性を持つ標識リガンドからなり、固体支持体系の2つの形態は検定手順において各形態に結合してくる標識リガンドの量が独立して測定されるようになっている前記キット。 - 固体支持体系の前記2つの別個の形態が判別可能な単分散粒子のセットを含む請求項13記載のキット。
- 単分散粒子のセットが大きさにより判別可能である請求項14記載のキット。
- 分析対象に対して親和力のない結合相手を担持するか又は担持するように適合されている1つ又はそれ以上のさらに別の判別可能な固体支持体系を含む請求項13〜15のいずれか一項記載のキット。
- 標識リガンドに対して親和性を持つ物質を担持するか又は担持するように適合されている1つ又はそれ以上のさらに別の判別可能な固体支持体系を含む請求項13〜16のいずれか一項記載のキット。
- 固体支持体系(i)の別個の形態の多数のペアを含む請求項13〜17のいずれか一項記載のキット。
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