JP2742953B2 - 分析方法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明の方法は分析方法、特に免疫学的測定方法に関
する。
する。
免疫学的及びその関連の技術は、血清試料中の抗原の
ような成分の測定に関して、臨床研究所において重要な
分析方法である。そのような物質はしばしば低濃度、す
なわち、ｎモル/l乃至ｐモル/l、いくつかの抗原に関し
てはそれよりも低い濃度で見出だされる。前記方法は、
通常、測定すべき検体に対して特異性を有する結合パー
トナーを用いることに基づき、この結合パートナーはし
ばしば固相、例えば、反応ウエル（reaction well）の
可塑性（plastic）表面又は可塑性（plastic）の粒子の
表面に結合する。
ような成分の測定に関して、臨床研究所において重要な
分析方法である。そのような物質はしばしば低濃度、す
なわち、ｎモル/l乃至ｐモル/l、いくつかの抗原に関し
てはそれよりも低い濃度で見出だされる。前記方法は、
通常、測定すべき検体に対して特異性を有する結合パー
トナーを用いることに基づき、この結合パートナーはし
ばしば固相、例えば、反応ウエル（reaction well）の
可塑性（plastic）表面又は可塑性（plastic）の粒子の
表面に結合する。
そのような方法（競合的結合ラジオイムノアッセイ）
の１つは、抗原又は他の測定すべき検体と同一の、放射
性標識した分子を用いている。従って、放射性同位元素
を用いて標識した抗原の一定量を少量の結合パートナー
の存在下で添加することによって、放射性同位元素で標
識した抗原と試料中の天然起源抗原との競合的結合が生
じ、このことによって、すでに確立された標準曲線によ
って抗原の濃度の測定を可能にする。
の１つは、抗原又は他の測定すべき検体と同一の、放射
性標識した分子を用いている。従って、放射性同位元素
を用いて標識した抗原の一定量を少量の結合パートナー
の存在下で添加することによって、放射性同位元素で標
識した抗原と試料中の天然起源抗原との競合的結合が生
じ、このことによって、すでに確立された標準曲線によ
って抗原の濃度の測定を可能にする。
そのような方法の他の種類（サンドイッチ法）は、よ
り多量の結合パートナーを用いる。結合パートナーは、
試料の検体に結合し、例えば、放射能、光吸収、蛍光発
光に基づいて読み取るために標識された抗原に結合する
第二指示物質結合パートナーを添加することにより、結
合した検体の量が示される。この種の方法は、競合的結
合測定法に比べしばしば非常に感受性が高く、従って、
通常好ましい。
り多量の結合パートナーを用いる。結合パートナーは、
試料の検体に結合し、例えば、放射能、光吸収、蛍光発
光に基づいて読み取るために標識された抗原に結合する
第二指示物質結合パートナーを添加することにより、結
合した検体の量が示される。この種の方法は、競合的結
合測定法に比べしばしば非常に感受性が高く、従って、
通常好ましい。
これらの方法のすべてに共通することは、読取りの前
に過剰の非結合の標識された成分を洗い落とさなければ
ならないことである。従って、遊離の標識された成分を
洗い落とすことを容易にするため、第一の結合パートナ
ーを固相に結合させることが便利である。
に過剰の非結合の標識された成分を洗い落とさなければ
ならないことである。従って、遊離の標識された成分を
洗い落とすことを容易にするため、第一の結合パートナ
ーを固相に結合させることが便利である。
そのような分析を実行するための共通の方法は、結合
パートナーをウエル（well）の表面に結合させることに
よって96（８×12）乃至400ulウエルのマイクロ力価プ
レートを製造することである。試料添加後のインキュベ
ーション中に、結合パートナーによってウエルの表面に
検体が結合される。その後に、標識された成分を添加し
検体に結合させる。そのプレートを洗浄し、遊離の標識
成分を除去した後に、そのプレートは、もし標識が可視
的信号を与える場合、例えば測光的に読まれる。
パートナーをウエル（well）の表面に結合させることに
よって96（８×12）乃至400ulウエルのマイクロ力価プ
レートを製造することである。試料添加後のインキュベ
ーション中に、結合パートナーによってウエルの表面に
検体が結合される。その後に、標識された成分を添加し
検体に結合させる。そのプレートを洗浄し、遊離の標識
成分を除去した後に、そのプレートは、もし標識が可視
的信号を与える場合、例えば測光的に読まれる。
結合パートナーを微細粒子の表面に結合させることに
よって、結合パートナーに被覆された大きな全表面を得
ることが可能であることが知られている。粒子は例え
ば、洗浄緩衝液を通すフィルター上に容易に固定される
ので、遊離の反応体から結合手を分離するという点か
ら、粒子も又固相として、適している。異なる試みとし
ては、過剰の試薬を洗い落とす一方、外部から適用した
磁石によって容器壁に固定化され得る鉄含有粒子を用い
ることがある。
よって、結合パートナーに被覆された大きな全表面を得
ることが可能であることが知られている。粒子は例え
ば、洗浄緩衝液を通すフィルター上に容易に固定される
ので、遊離の反応体から結合手を分離するという点か
ら、粒子も又固相として、適している。異なる試みとし
ては、過剰の試薬を洗い落とす一方、外部から適用した
磁石によって容器壁に固定化され得る鉄含有粒子を用い
ることがある。
上記の方法において、分離工程は、その操作コストの
重要な部分である。
重要な部分である。
しかし、測定の前に非結合指示薬を必ずしも除去しな
くても流動細胞計測法により粒子を基にした免疫測定分
析は読み取られることが知られている。流動細胞計測法
とは流体懸濁液中の粒子を分析する方法であり、その粒
子はどのような種類のものでもよく、細胞に限定されな
い。ノルウェー特許第144002号及び145176号には、励起
光が粒子の大きさに関連する分散光のパルス及びさらに
信号、例えば結合標識の粒子関連の量に関係する蛍光の
パルスの放出を生じる測光の測定領域に懸濁液中の単一
の粒子を通過させることによる通常の１つの方法が示さ
れている。適する電子検出器及びマイクロプロセッサー
電子機器により、通過する各粒子に対する結果を分類し
記憶装置に入れておく。このように、10,000乃至100,00
0の個々の粒子からの測定結果がデーター取得時間であ
る１分間で容易に得られる。流動細胞計測法の特徴は試
料流れの流体力学的集中の原則である。このことが(10u
m)3の位数の測定領域を生じさせる（励起／−検体領域
の内部の試料流れの容積）。従って、測定領域内の粒子
を囲んでいる液体中に存在する非結合標識の量は非常に
少なく測定に有意に影響を及ぼさない。このように読取
りの前に結合試薬がないように分離させる必要なく、流
動細胞計測法によって粒子を基にした分析の読みが成し
得る。そのような分析を均質、すなわち分離なしとい
う。
くても流動細胞計測法により粒子を基にした免疫測定分
析は読み取られることが知られている。流動細胞計測法
とは流体懸濁液中の粒子を分析する方法であり、その粒
子はどのような種類のものでもよく、細胞に限定されな
い。ノルウェー特許第144002号及び145176号には、励起
光が粒子の大きさに関連する分散光のパルス及びさらに
信号、例えば結合標識の粒子関連の量に関係する蛍光の
パルスの放出を生じる測光の測定領域に懸濁液中の単一
の粒子を通過させることによる通常の１つの方法が示さ
れている。適する電子検出器及びマイクロプロセッサー
電子機器により、通過する各粒子に対する結果を分類し
記憶装置に入れておく。このように、10,000乃至100,00
0の個々の粒子からの測定結果がデーター取得時間であ
る１分間で容易に得られる。流動細胞計測法の特徴は試
料流れの流体力学的集中の原則である。このことが(10u
m)3の位数の測定領域を生じさせる（励起／−検体領域
の内部の試料流れの容積）。従って、測定領域内の粒子
を囲んでいる液体中に存在する非結合標識の量は非常に
少なく測定に有意に影響を及ぼさない。このように読取
りの前に結合試薬がないように分離させる必要なく、流
動細胞計測法によって粒子を基にした分析の読みが成し
得る。そのような分析を均質、すなわち分離なしとい
う。
読取りの手段としての流動細胞計測法を使用すること
に関する１つの問題は、その方法の感度と動的範囲であ
る。高感度により、粒子当たりの結合検体（従って標
識）の合理的な量をもたせるために、試料中の検体の低
濃度においてさえ少量の結合粒子の使用をしなければな
らない。このことは流動細胞計測器の測定精度が標識か
らの信号の粒子当たりの強度に関するという事実によ
る。検体の高濃度を測定することができるようにするた
めに多量の結合粒子を用いることが望ましい。各粒子は
検体に対して一定数の結合部位を有するので、全粒子の
合計は一定の結合キャパシティを表し、結合キャパシテ
ィーが検体の最高の測定可能な濃度に関して上限を画定
する。標識された化合物の量は一定と仮定されるので検
体分子当たりの標識量は検体量が最大キャパシティを超
えて増加するにつれて減少する。利用できる標識量の増
加が溶液中の過剰の遊離している検体に結合するので飽
和濃度より高い検体濃度では粒子当たりの結合された標
識量は従って減少する。この事はよく知られた現象、フ
ック効果（Hook−effect）である。
に関する１つの問題は、その方法の感度と動的範囲であ
る。高感度により、粒子当たりの結合検体（従って標
識）の合理的な量をもたせるために、試料中の検体の低
濃度においてさえ少量の結合粒子の使用をしなければな
らない。このことは流動細胞計測器の測定精度が標識か
らの信号の粒子当たりの強度に関するという事実によ
る。検体の高濃度を測定することができるようにするた
めに多量の結合粒子を用いることが望ましい。各粒子は
検体に対して一定数の結合部位を有するので、全粒子の
合計は一定の結合キャパシティを表し、結合キャパシテ
ィーが検体の最高の測定可能な濃度に関して上限を画定
する。標識された化合物の量は一定と仮定されるので検
体分子当たりの標識量は検体量が最大キャパシティを超
えて増加するにつれて減少する。利用できる標識量の増
加が溶液中の過剰の遊離している検体に結合するので飽
和濃度より高い検体濃度では粒子当たりの結合された標
識量は従って減少する。この事はよく知られた現象、フ
ック効果（Hook−effect）である。
分析における結合パートナーの量を増加させ飽和が起
きる前に多量の検体の結合を可能にすることにより上記
のフック効果を防止し得ることは当業者によく知られて
いる。粒子を基にした分析において、このことは粒子当
たりの高結合キャパシティ及び測定される検体量に相関
して粒子数の増加を意味する。しかし、粒子数の増加は
試料中の一定の検体濃度における粒子当たりの結合をよ
り少なくすることになる。従って、このような試みはよ
り低い感度を与え、すなわち検体の最低の検出できる濃
度に対してのより高い限度を生じる。
きる前に多量の検体の結合を可能にすることにより上記
のフック効果を防止し得ることは当業者によく知られて
いる。粒子を基にした分析において、このことは粒子当
たりの高結合キャパシティ及び測定される検体量に相関
して粒子数の増加を意味する。しかし、粒子数の増加は
試料中の一定の検体濃度における粒子当たりの結合をよ
り少なくすることになる。従って、このような試みはよ
り低い感度を与え、すなわち検体の最低の検出できる濃
度に対してのより高い限度を生じる。
本発明は上記の問題を解決し、遊離の試薬と結合した
試薬の分離を必要としないということにおいて流動細胞
計測法の読取り有利さを活用させる。本発明は高感度の
達成を可能にし、同時に前記方法の有効な測定範囲を増
加させる。高感度及び測定範囲の増加という有利さに加
え、本発明の方法は測定の精度も改良する。
試薬の分離を必要としないということにおいて流動細胞
計測法の読取り有利さを活用させる。本発明は高感度の
達成を可能にし、同時に前記方法の有効な測定範囲を増
加させる。高感度及び測定範囲の増加という有利さに加
え、本発明の方法は測定の精度も改良する。
本明細書に関与するような分析において、試料の検体
濃度の関数（通常対数目盛りで表される）として、被覆
された固相に結合される標識の測定量を量的に示す標準
曲線を確立させることが必要である。試料中の検体濃度
を示す量軸に関する標準曲線の位置（左−右）を決定す
るのに左右する要因は検体に対する結合パートナーの親
和性であることは知られている。米国特許第4595661号
はこの原則に加え、検体に対して結合親和性のより低い
他の抗体に主抗体を加える免疫検定にこの事実を用いて
いる。この抗体は固相に結合され得るか又は、標識され
得る。前記特許は、そのような混合系で起こる２つの結
合反応から寄与率の合計の測定に基づいており、低親和
性の抗体は高リガンド濃度においてのみ重要な寄与を
し、従ってフック効果に先んじるものである。この理由
は、低親和性抗体のみに関して標準曲線は通常の抗体の
標準曲線に比較して右（高用量）にシフトするためであ
る。
濃度の関数（通常対数目盛りで表される）として、被覆
された固相に結合される標識の測定量を量的に示す標準
曲線を確立させることが必要である。試料中の検体濃度
を示す量軸に関する標準曲線の位置（左−右）を決定す
るのに左右する要因は検体に対する結合パートナーの親
和性であることは知られている。米国特許第4595661号
はこの原則に加え、検体に対して結合親和性のより低い
他の抗体に主抗体を加える免疫検定にこの事実を用いて
いる。この抗体は固相に結合され得るか又は、標識され
得る。前記特許は、そのような混合系で起こる２つの結
合反応から寄与率の合計の測定に基づいており、低親和
性の抗体は高リガンド濃度においてのみ重要な寄与を
し、従ってフック効果に先んじるものである。この理由
は、低親和性抗体のみに関して標準曲線は通常の抗体の
標準曲線に比較して右（高用量）にシフトするためであ
る。
パートナーに結合する高又は低親和性検体が、流動細
胞計測法で区別され得る異なるタイプの粒子に別々に被
覆されるなら、粒子の２成分の混合物を用いてのインキ
ュベーションの後に、高親和性結合パートナーによりそ
して低親和性結合パートナーにより結合される検体量は
流動細胞計測法によって同じ試料中で別々にしかし同時
に測定され得る。それによって主な目的は達せられ、す
なわち、フック効果を回避する。さらに他の方法と比較
すると本発明方法は以下の長所を有する： １）感度、すなわち主に高親和性結合パートナー及び非
特異的結合の程度により決定される検出される最低検体
濃度は、米国特許第4595661号のように結合に対する２
つの寄与率の合計のみが測定される系にわたって両結合
パラメーターが測定されるとき低親和性粒子の添加によ
って減少しない。
胞計測法で区別され得る異なるタイプの粒子に別々に被
覆されるなら、粒子の２成分の混合物を用いてのインキ
ュベーションの後に、高親和性結合パートナーによりそ
して低親和性結合パートナーにより結合される検体量は
流動細胞計測法によって同じ試料中で別々にしかし同時
に測定され得る。それによって主な目的は達せられ、す
なわち、フック効果を回避する。さらに他の方法と比較
すると本発明方法は以下の長所を有する： １）感度、すなわち主に高親和性結合パートナー及び非
特異的結合の程度により決定される検出される最低検体
濃度は、米国特許第4595661号のように結合に対する２
つの寄与率の合計のみが測定される系にわたって両結合
パラメーターが測定されるとき低親和性粒子の添加によ
って減少しない。
２）本発明方法は各粒子のタイプからの二重標準曲線を
用いる。従って、各試料の測定は２つの測定値を生じ、
その２つの値は問題のリガンド濃度に関する二重標準曲
線に一対として合致しなければならない。このことは、
合致しない１対の値は正常な分析の実施から逸脱してい
ることを示すので分析における付加的な信頼性を与え
る。
用いる。従って、各試料の測定は２つの測定値を生じ、
その２つの値は問題のリガンド濃度に関する二重標準曲
線に一対として合致しなければならない。このことは、
合致しない１対の値は正常な分析の実施から逸脱してい
ることを示すので分析における付加的な信頼性を与え
る。
３）検出器の動的範囲を利用するために、高親和性抗体
に対しては、より小さい粒子及び低親和性抗体に対して
は、より大きな粒子を用いることは有利である。それに
よって、各粒子タイプに対する最大測定値は比較できる
大きさになり、従って検出器を最適に用いる。米国特許
第4743542号には高リガンド濃度でのフック効果を回避
するための、よりありふれた提示が記載されている。そ
の原理は、単に標識された抗体に競合して非標識の抗体
を添加することである。このことは低特異性標識の多量
の抗体を用いることに相当し、従って、分析において増
加したキャパシティが得られ、フック効果の微候が高リ
ガンド濃度にシフトされることである。高リガンド濃度
での検出器範囲を超える測定値が増加するのを回避する
ために付加的試薬として非標識抗体が用いられ、このこ
とは初めの濃度での非特異的結合濃度も又維持する。従
って、得られるものは、より広い範囲の検体濃度をカバ
ーする。より緩やかな標準曲線である。しかし、その曲
線のより少ない勾配は未知の試料における検体濃度に、
より大きな不確実性を生じる。従って、その最終結果は
分析の有効な動的範囲においてほんのわずかに増加する
ことである。一方、本発明の方法は測定の感度又は精度
を損じることなく動的範囲を増加させる。
に対しては、より小さい粒子及び低親和性抗体に対して
は、より大きな粒子を用いることは有利である。それに
よって、各粒子タイプに対する最大測定値は比較できる
大きさになり、従って検出器を最適に用いる。米国特許
第4743542号には高リガンド濃度でのフック効果を回避
するための、よりありふれた提示が記載されている。そ
の原理は、単に標識された抗体に競合して非標識の抗体
を添加することである。このことは低特異性標識の多量
の抗体を用いることに相当し、従って、分析において増
加したキャパシティが得られ、フック効果の微候が高リ
ガンド濃度にシフトされることである。高リガンド濃度
での検出器範囲を超える測定値が増加するのを回避する
ために付加的試薬として非標識抗体が用いられ、このこ
とは初めの濃度での非特異的結合濃度も又維持する。従
って、得られるものは、より広い範囲の検体濃度をカバ
ーする。より緩やかな標準曲線である。しかし、その曲
線のより少ない勾配は未知の試料における検体濃度に、
より大きな不確実性を生じる。従って、その最終結果は
分析の有効な動的範囲においてほんのわずかに増加する
ことである。一方、本発明の方法は測定の感度又は精度
を損じることなく動的範囲を増加させる。
本発明により、分析されるべき各検体に関して、その
検体に対して特異的な結合パートナーを有する単分散粒
子を前記検体に結合させるのに用い、前記結合検体量を
示すのに標識されたリガンドを用い、前記粒子に結合さ
れた標識されたリガンドの量は流動細胞計測法により測
定され、分析する各検体に関して、一対の異なる粒子タ
イプが用いられ、前記対の２つの粒子タイプの各々の粒
子は同一の特異性を有するが前記検体に対する異なる結
合親和性を有する結合パートナーを保持し、分析する各
検体と反応し、標識されたリガンドにより標識された粒
子タイプの一対は流動細胞計測法により互いに又、分析
すべき他の検体の各々と反応した粒子タイプの一対と区
別できる。
検体に対して特異的な結合パートナーを有する単分散粒
子を前記検体に結合させるのに用い、前記結合検体量を
示すのに標識されたリガンドを用い、前記粒子に結合さ
れた標識されたリガンドの量は流動細胞計測法により測
定され、分析する各検体に関して、一対の異なる粒子タ
イプが用いられ、前記対の２つの粒子タイプの各々の粒
子は同一の特異性を有するが前記検体に対する異なる結
合親和性を有する結合パートナーを保持し、分析する各
検体と反応し、標識されたリガンドにより標識された粒
子タイプの一対は流動細胞計測法により互いに又、分析
すべき他の検体の各々と反応した粒子タイプの一対と区
別できる。
一般に、本発明の方法において用いられる粒子タイプ
は大きさを基準にして区別され得る。従来の流動細胞計
測法は光の散乱を用いて各粒子を検出し、そして光の散
乱の信号は粒子の大きさに比例し、それぞれの個体群の
大きさの範囲が重ならないという条件で異なる大きさの
粒子が容易に区別され得る。粒子の大きさも又、各粒子
による電気的インピーダンスの変化に基づいてクールタ
ー（Coulter）原理により決定される。同一の又は部分
的に重なるが異なるインピーダンス特性を有する大きさ
の範囲の粒子を区別するのにクールター原理を用いる。
は大きさを基準にして区別され得る。従来の流動細胞計
測法は光の散乱を用いて各粒子を検出し、そして光の散
乱の信号は粒子の大きさに比例し、それぞれの個体群の
大きさの範囲が重ならないという条件で異なる大きさの
粒子が容易に区別され得る。粒子の大きさも又、各粒子
による電気的インピーダンスの変化に基づいてクールタ
ー（Coulter）原理により決定される。同一の又は部分
的に重なるが異なるインピーダンス特性を有する大きさ
の範囲の粒子を区別するのにクールター原理を用いる。
１つより多い検体を分析する場合、全粒子タイプから
の信号が区別され得るように粒子タイプの対が用いられ
る。分析する試料中の各検体に関して用いられる標識が
同じ場合、それぞれの検体に対する粒子タイプの対が粒
子の特徴、例えば大きさに基づいて粒子タイプの他の対
と区別されなければならない。現在、入手可能なダイノ
スフェア（登録商標）（DynosphereTM）は約１％の光散
乱測定において相対標準偏差（CV）を有する完全な球体
である。従って、そのような粒子タイプのいくつかを混
合でき、流動細胞計測法光散乱ヒストグラムにおいてオ
ーバーラップしない個体群としてなお容易に同定され得
る。大きさ及び表面特性の均一性も又、粒子の抗原結合
特性に関して重要である。このことは、免疫蛍光検査法
又は他の信号において同一のタイプの粒子間の不一致が
より少なくなり、それによって、より正確に画定したヒ
ストグラム及び平均値が与えられる。
の信号が区別され得るように粒子タイプの対が用いられ
る。分析する試料中の各検体に関して用いられる標識が
同じ場合、それぞれの検体に対する粒子タイプの対が粒
子の特徴、例えば大きさに基づいて粒子タイプの他の対
と区別されなければならない。現在、入手可能なダイノ
スフェア（登録商標）（DynosphereTM）は約１％の光散
乱測定において相対標準偏差（CV）を有する完全な球体
である。従って、そのような粒子タイプのいくつかを混
合でき、流動細胞計測法光散乱ヒストグラムにおいてオ
ーバーラップしない個体群としてなお容易に同定され得
る。大きさ及び表面特性の均一性も又、粒子の抗原結合
特性に関して重要である。このことは、免疫蛍光検査法
又は他の信号において同一のタイプの粒子間の不一致が
より少なくなり、それによって、より正確に画定したヒ
ストグラム及び平均値が与えられる。
しかし、画検体に対して異なる標識を用いた場合、粒
子タイプの対は各検体に対して同一で有り得、標識から
の信号、例えば蛍光波長における量的な差はそれぞれの
粒子個体群を区別する。
子タイプの対は各検体に対して同一で有り得、標識から
の信号、例えば蛍光波長における量的な差はそれぞれの
粒子個体群を区別する。
本発明において用いる好ましい標識は、流動細胞計測
法に通常用いられる蛍光物質、例えばフルオレセイン又
はフィコエリトリンである。蛍光的に染色された球体
（直径0.10マイクロメーター）も又、標識として用いら
れる［サンダース（Saunders）らによるClin,Chem.31
巻、2020頁］。測光的信号を与える他の標識はコロイド
状の金粒子を含む。電気的インピーダンスにおいて重要
な差を与える標識は、例えば金のような金属粒子も又、
クールター原理により検出され得る信号を与えるのに用
いら得る一方、粒子タイプの違いは例えば光散乱法によ
り決定され得る。
法に通常用いられる蛍光物質、例えばフルオレセイン又
はフィコエリトリンである。蛍光的に染色された球体
（直径0.10マイクロメーター）も又、標識として用いら
れる［サンダース（Saunders）らによるClin,Chem.31
巻、2020頁］。測光的信号を与える他の標識はコロイド
状の金粒子を含む。電気的インピーダンスにおいて重要
な差を与える標識は、例えば金のような金属粒子も又、
クールター原理により検出され得る信号を与えるのに用
いら得る一方、粒子タイプの違いは例えば光散乱法によ
り決定され得る。
本発明の方法は適した特異的結合パートナーを保持す
る粒子を用いて広い範囲の検出を分析するのに用いられ
る。下記（そのような反応対において、どちらかのメン
バーが検出で有り得ることが認められる）を包含する関
与する検体及び結合パートナーの対は（ａ）抗原及び特
異的抗体、（ｂ）ホルモン及びホルモン受容体、（ｃ）
ハプテン及び抗ハプテン、（ｄ）ポリヌクレオチド及び
相補的ポリヌクレオチド、（ｅ）ポリヌクレオチド及び
ポリヌクレオチド結合蛋白、（ｆ）ビオチン及びアビジ
ン又はストレプトアビジン（Streptavidin）、（ｇ）酵
素及び酵素補因子及び（ｈ）レクチン及び特異的炭水化
物である。
る粒子を用いて広い範囲の検出を分析するのに用いられ
る。下記（そのような反応対において、どちらかのメン
バーが検出で有り得ることが認められる）を包含する関
与する検体及び結合パートナーの対は（ａ）抗原及び特
異的抗体、（ｂ）ホルモン及びホルモン受容体、（ｃ）
ハプテン及び抗ハプテン、（ｄ）ポリヌクレオチド及び
相補的ポリヌクレオチド、（ｅ）ポリヌクレオチド及び
ポリヌクレオチド結合蛋白、（ｆ）ビオチン及びアビジ
ン又はストレプトアビジン（Streptavidin）、（ｇ）酵
素及び酵素補因子及び（ｈ）レクチン及び特異的炭水化
物である。
上記対のメンバーは又、分析する他の分子に結合され
得る。従って、例えば、ビオチン又はハプテンが分析の
前の予備工程で検体に共有結合的に結合され得る。
得る。従って、例えば、ビオチン又はハプテンが分析の
前の予備工程で検体に共有結合的に結合され得る。
本発明分析の好ましい検体は抗原であり、好ましい結
合パートナーはモノクローナル抗体である。
合パートナーはモノクローナル抗体である。
本発明の方法は、主にサンドイッチ分析及びそれらの
変形体に適用される。従って、サンドイッチ分析におい
て、検体を粒子に結合させることができ、標識したリガ
ンドは、粒子との反応前又は後に検体に単に結合させ、
検体量に比例して信号を与える結合パートナーである。
標識したリガンドは、粒子を加える前又は後、又は同時
に試料に添加される。
変形体に適用される。従って、サンドイッチ分析におい
て、検体を粒子に結合させることができ、標識したリガ
ンドは、粒子との反応前又は後に検体に単に結合させ、
検体量に比例して信号を与える結合パートナーである。
標識したリガンドは、粒子を加える前又は後、又は同時
に試料に添加される。
本発明の他の特徴により、 （ａ）分析する各検体に対してその検体の第一の特異的
結合パートナーを保持する単分散粒子、 （ｂ）分析する各検体に対して、前記の第一の特定結合
パートナーと同じ特異性を有するが、前記検体に対して
異なる結合親和性を有する第二の特異的結合パートナー
を保持する単分散粒子、 （ｃ）標識したリガンド又は各結合検体量を示すための
要求を満たすリガンド から成り、単分散粒子（ａ）及び（ｂ）は互いに区別で
き、そして用いられるすべての粒子タイプがそれぞれの
検体との反応の後に流動細胞計測法により別々に測定さ
れるように、試料中の他の検体に相当するいずれの粒子
タイプからも区別でき、前記標識リガンドにより標識さ
れるようになる試料中の１つ以上の検体の流動細胞計測
法分析に用いるキットを提供する。
結合パートナーを保持する単分散粒子、 （ｂ）分析する各検体に対して、前記の第一の特定結合
パートナーと同じ特異性を有するが、前記検体に対して
異なる結合親和性を有する第二の特異的結合パートナー
を保持する単分散粒子、 （ｃ）標識したリガンド又は各結合検体量を示すための
要求を満たすリガンド から成り、単分散粒子（ａ）及び（ｂ）は互いに区別で
き、そして用いられるすべての粒子タイプがそれぞれの
検体との反応の後に流動細胞計測法により別々に測定さ
れるように、試料中の他の検体に相当するいずれの粒子
タイプからも区別でき、前記標識リガンドにより標識さ
れるようになる試料中の１つ以上の検体の流動細胞計測
法分析に用いるキットを提供する。
本二成分分析により得られる動的範囲における改良は
一対の粒子タイプを被覆するために用いる２つの結合パ
ートナー間の会合定数における差に非常に依存する。違
いが大きいほど２標準曲線間の分離は大きい。一般に、
会合定数において５−100倍の差が適切である。
一対の粒子タイプを被覆するために用いる２つの結合パ
ートナー間の会合定数における差に非常に依存する。違
いが大きいほど２標準曲線間の分離は大きい。一般に、
会合定数において５−100倍の差が適切である。
本二成分分析の増大する動的範囲は高親和性粒子によ
り与えられる高感度を構成することなく得られる。さら
に、分離がない分析の長所が失われるにもかかわらず、
非特異的結合が重要である場合において、分析の前に粒
子を洗浄することにより感度が増大され得る。
り与えられる高感度を構成することなく得られる。さら
に、分離がない分析の長所が失われるにもかかわらず、
非特異的結合が重要である場合において、分析の前に粒
子を洗浄することにより感度が増大され得る。
最近、ミクロ滴定プレートにおける従来のELISAに関
して、非特異結合における試料特異的変形物を評価する
重要性が指摘され、各試料に関して非特異的結合は無関
係な抗体で被覆したウエル中に観察される結合により個
々に測定される。このアプローチを、他の区別され得る
粒子タイプを導入することによる流動細胞計測法に基づ
く、分析するいずれかの検体に対しての親和性が０の無
関係の抗体で被覆した粒子に組み込むことができる。こ
のことは上記の二成分混合物に添加される第三の粒子大
きさであり得る。従来の分析に比し重要な長所はすべて
の測定が単一の試料においてなされることである。
して、非特異結合における試料特異的変形物を評価する
重要性が指摘され、各試料に関して非特異的結合は無関
係な抗体で被覆したウエル中に観察される結合により個
々に測定される。このアプローチを、他の区別され得る
粒子タイプを導入することによる流動細胞計測法に基づ
く、分析するいずれかの検体に対しての親和性が０の無
関係の抗体で被覆した粒子に組み込むことができる。こ
のことは上記の二成分混合物に添加される第三の粒子大
きさであり得る。従来の分析に比し重要な長所はすべて
の測定が単一の試料においてなされることである。
流動細胞計測法による２以上の異なる粒子タイプを結
合する抗原の同時測定により、例えば放射能測定に基づ
く単一の測定値に匹敵する増大した分析信頼度を生ず
る。第一に、試料の粒子タイプ関連ヒストグラムは同一
に設定された一連の試料を通して変わらないことが求め
られる。このことは流動細胞計測分析法の信頼度を確認
する。第二に、２つの測定値、例えば二重標準曲線に言
及する粒子の２つのタイプの平均蛍光強度から試料の抗
原濃度を決定することは、一対としての２つの測定値が
いずれの濃度についても二重標準曲線によく合致しない
場合に分析の正常実施からのずれを明らかにし得る。
合する抗原の同時測定により、例えば放射能測定に基づ
く単一の測定値に匹敵する増大した分析信頼度を生ず
る。第一に、試料の粒子タイプ関連ヒストグラムは同一
に設定された一連の試料を通して変わらないことが求め
られる。このことは流動細胞計測分析法の信頼度を確認
する。第二に、２つの測定値、例えば二重標準曲線に言
及する粒子の２つのタイプの平均蛍光強度から試料の抗
原濃度を決定することは、一対としての２つの測定値が
いずれの濃度についても二重標準曲線によく合致しない
場合に分析の正常実施からのずれを明らかにし得る。
本発明を下記の図を参照してさらに説明する。
第１図は、低濃度の抗原の存在下、粒子の２つのタイ
プに対する結合反応を表したものである。
プに対する結合反応を表したものである。
第２図は、高濃度の抗原の存在下、粒子の２つのタイ
プに対する結合反応を表したものである。
プに対する結合反応を表したものである。
第３図及び第４図は、流動細胞計測法により測定した
測定値の例を示すものである。
測定値の例を示すものである。
第５図は、本発明方法において用いる二重標準曲線の
実例である。
実例である。
第６図は、下記の実施例により得られたヒストグラム
を示すものである。
を示すものである。
第７図は、二重標準曲線及び下記実施例の結果に関す
る精度概略図を示すものである。
る精度概略図を示すものである。
（タイプａの）粒子１を測定する抗原上の結合部位
（エピトープ）指向の結合蛋白質２（モノクローナル抗
体）で被覆させる。この結合蛋白は抗原に対して非常に
高い結合親和性［会合定数（association constant）を
有するように選択される。２つの粒子タイプが蛍光測定
とは無関係に流動細胞計測法において同定され得る方法
において粒子３（タイプｂ）は粒子１（タイプａ）と異
なっている。異なる強度の光散乱信号を生じさせる異な
る大きさの粒子タイプを用いてこのことは容易に達成さ
れる。いくつかの流動細胞計測法においても利用できる
クールター原理に基づく粒子容量の測定（通過する粒子
によるオリフィス内の電気的インピーダンスにおける変
化の測定）は２つの粒子の達成の同定にも又、適してい
る。タイプｂの粒子を、結合蛋白質２と抗原の同一の結
合部位に対して特異性を有する、しかし結合蛋白質２よ
り会合定数が低い結合蛋白質４（モノクローナル抗体）
で被覆する。（親和性の違いは第１図及び第２図におけ
る抗体を示す線の太さで示されている。）粒子ａ及びｂ
のある所定の量に加え、試験試薬は一定量の標識抗体５
を含有する。この抗体は、抗体２及び４を結合させる部
位とは異なる結合部位に優先的に指向する。抗原分子当
たり２つの結合部位のそれぞれの１つのみが存在するな
ら、このことは粒子の凝集を防止するのでさらに都合が
よい。
（エピトープ）指向の結合蛋白質２（モノクローナル抗
体）で被覆させる。この結合蛋白は抗原に対して非常に
高い結合親和性［会合定数（association constant）を
有するように選択される。２つの粒子タイプが蛍光測定
とは無関係に流動細胞計測法において同定され得る方法
において粒子３（タイプｂ）は粒子１（タイプａ）と異
なっている。異なる強度の光散乱信号を生じさせる異な
る大きさの粒子タイプを用いてこのことは容易に達成さ
れる。いくつかの流動細胞計測法においても利用できる
クールター原理に基づく粒子容量の測定（通過する粒子
によるオリフィス内の電気的インピーダンスにおける変
化の測定）は２つの粒子の達成の同定にも又、適してい
る。タイプｂの粒子を、結合蛋白質２と抗原の同一の結
合部位に対して特異性を有する、しかし結合蛋白質２よ
り会合定数が低い結合蛋白質４（モノクローナル抗体）
で被覆する。（親和性の違いは第１図及び第２図におけ
る抗体を示す線の太さで示されている。）粒子ａ及びｂ
のある所定の量に加え、試験試薬は一定量の標識抗体５
を含有する。この抗体は、抗体２及び４を結合させる部
位とは異なる結合部位に優先的に指向する。抗原分子当
たり２つの結合部位のそれぞれの１つのみが存在するな
ら、このことは粒子の凝集を防止するのでさらに都合が
よい。
試料中抗原６が低濃度で存在する場合（第１図）はそ
の抗原は優先的にタイプａの粒子の高親和性結合部位に
結合する。従ってこの条件下では、タイプｂの粒子は微
量の抗原しか結合させない。従って指示抗体の二次結合
によりタイプａの粒子は一定の蛍光で検知される。一
方、タイプｂの粒子はこの条件下では極くわずかな蛍光
しか有さない。タイプａの粒子が光的低濃度で存在する
ので少量の抗原でさえ検知可能な粒子関連蛍光を生じ、
すなわち、高測定感度になる。
の抗原は優先的にタイプａの粒子の高親和性結合部位に
結合する。従ってこの条件下では、タイプｂの粒子は微
量の抗原しか結合させない。従って指示抗体の二次結合
によりタイプａの粒子は一定の蛍光で検知される。一
方、タイプｂの粒子はこの条件下では極くわずかな蛍光
しか有さない。タイプａの粒子が光的低濃度で存在する
ので少量の抗原でさえ検知可能な粒子関連蛍光を生じ、
すなわち、高測定感度になる。
抗原が高濃度に存在する場合（第２図）、タイプａ粒
子への結合は飽和される。過剰の抗原はタイプｂ粒子の
低親和性結合部位に結合する。それらは比較的高濃度で
存在し、従って飽和は特に高濃度の抗原に関してのみ起
こる。
子への結合は飽和される。過剰の抗原はタイプｂ粒子の
低親和性結合部位に結合する。それらは比較的高濃度で
存在し、従って飽和は特に高濃度の抗原に関してのみ起
こる。
第３図及び第４図中のパネルＡは光散乱信号の強度
（ｘ軸、等分目盛）の関数としての記録された事象数
（チャネル当たりのカウント、ｙ軸）のヒストグラムを
示す。粒子ａ及びｂの２つのタイプは明らかに分離した
個体群として見られる。パネルＢはタイプａ粒子に関す
る蛍光分布、すなわち、粒子当たりの蛍光強度（ｘ軸、
対数目盛）の関数としての記録された事象数（ｙ軸）を
示す。このヒストグラム中でデーターの取得はパネルＡ
の光分散分布中ウインドウａのゲートで制御され、すな
わち、光散乱上のウインドウａ内に記録された粒子のみ
がパネルＢのヒストグラム中に記録されたそれらの蛍光
量を有する。このように、パネルＢはタイプａ粒子の蛍
光分布を示す。同様に、タイプｂ粒子の蛍光分布はパネ
ルＣに記録されている。パネルＤは光散乱（ｙ軸、等分
目盛）及び蛍光（ｘ軸、対数目盛）におけるそれぞれの
値に従って２つの個体群ａ及びｂを示す２つのパラメー
タープロットである。この場合、そのヒストグラムはゲ
ートで制御する条件なく得られる。従って両個体群ａ及
びｂがパネルＤに現われる。
（ｘ軸、等分目盛）の関数としての記録された事象数
（チャネル当たりのカウント、ｙ軸）のヒストグラムを
示す。粒子ａ及びｂの２つのタイプは明らかに分離した
個体群として見られる。パネルＢはタイプａ粒子に関す
る蛍光分布、すなわち、粒子当たりの蛍光強度（ｘ軸、
対数目盛）の関数としての記録された事象数（ｙ軸）を
示す。このヒストグラム中でデーターの取得はパネルＡ
の光分散分布中ウインドウａのゲートで制御され、すな
わち、光散乱上のウインドウａ内に記録された粒子のみ
がパネルＢのヒストグラム中に記録されたそれらの蛍光
量を有する。このように、パネルＢはタイプａ粒子の蛍
光分布を示す。同様に、タイプｂ粒子の蛍光分布はパネ
ルＣに記録されている。パネルＤは光散乱（ｙ軸、等分
目盛）及び蛍光（ｘ軸、対数目盛）におけるそれぞれの
値に従って２つの個体群ａ及びｂを示す２つのパラメー
タープロットである。この場合、そのヒストグラムはゲ
ートで制御する条件なく得られる。従って両個体群ａ及
びｂがパネルＤに現われる。
第３図は小（タイプａ）粒子の高蛍光強度を示し、一
方、より大きい（タイプｂ）粒子に関連する蛍光はより
少ない。この結果は、抗原がタイプａ粒子に結合するの
が好ましい比較的低抗原濃度に相当する。
方、より大きい（タイプｂ）粒子に関連する蛍光はより
少ない。この結果は、抗原がタイプａ粒子に結合するの
が好ましい比較的低抗原濃度に相当する。
第４図は、両粒子タイプに対して強い蛍光を生ずる比
較的高抗原濃度に対応するデーターを示す。第３図及び
第４図に示されているような、該抗原の既知濃度の試料
の測定値から二重標準曲線が各試料中の両粒子タイプの
測定値から確立される。そのような曲線を第５図に示
す。ｘ軸は抗原の濃度（対数目盛）を示し、ｙ軸は２つ
のタイプの各々についての粒子当たりの平均蛍光（対数
目盛）を表す。第５図において、本発明が、タイプａ粒
子のみに基づく測定値（Ra）に比較して増大した動的測
定範囲（Ra＋ｂ）の方法を構成する方法も示されてい
る。
較的高抗原濃度に対応するデーターを示す。第３図及び
第４図に示されているような、該抗原の既知濃度の試料
の測定値から二重標準曲線が各試料中の両粒子タイプの
測定値から確立される。そのような曲線を第５図に示
す。ｘ軸は抗原の濃度（対数目盛）を示し、ｙ軸は２つ
のタイプの各々についての粒子当たりの平均蛍光（対数
目盛）を表す。第５図において、本発明が、タイプａ粒
子のみに基づく測定値（Ra）に比較して増大した動的測
定範囲（Ra＋ｂ）の方法を構成する方法も示されてい
る。
一般に、既知試料の抗原の濃度は、試料を用いてイン
キュベーションした後、タイプａ及びｂ粒子の蛍光強度
を流動細胞計測法において測定し、その後標準曲線（抗
原濃度が蛍光強度ａ及び蛍光強度ｂの両方の関数であ
る）から対応する抗原濃度を読み取ることにより決定し
得る。
キュベーションした後、タイプａ及びｂ粒子の蛍光強度
を流動細胞計測法において測定し、その後標準曲線（抗
原濃度が蛍光強度ａ及び蛍光強度ｂの両方の関数であ
る）から対応する抗原濃度を読み取ることにより決定し
得る。
本発明の試験は、１−10umの大きさの範囲のダイノス
フェア（登録商標）単分散粒子を用いて行われる。前記
粒子が表面積及び特徴と同様に大きさにおいても均一で
あることが重要な利点である。なぜなら、このことによ
り、被覆工程の後、粒子当たりの結合パートナーの量に
変動がより少なくなり、従って、検体と標識された試薬
の結合後、粒子当たりの蛍光の変動はより少なくなる。
流動細胞計測法は典型的には粒子関連蛍光のヒストグラ
ムの形態において10,000粒子の個体群からの結果を与え
るので、２試料間の粒子当たりの平均結合における差の
証明がより正確になるほど蛍光分布の変動がより少な
い。それに加え、大きさにおける均一性は、流動細胞計
測法により確実に同定されそして別個に分類されるべき
それらのためにａ及びｂの２つのタイプ間の平均サイズ
におけるより少ない差を要求する。このことは、同じ試
料中に１つより多い検体の濃度を決定するか又は同じ試
料中の１つより多い特定の検体の１つより多い形態を決
定するのに本発明が用いられる場合に特に重要である。
このことは、上記のように各検体特異性に対して１対の
粒子を用いることによりなされるが、混合物において用
いられるすべての粒子タイプが流動細胞計測法において
それらの異なる大きさと区別できる。
フェア（登録商標）単分散粒子を用いて行われる。前記
粒子が表面積及び特徴と同様に大きさにおいても均一で
あることが重要な利点である。なぜなら、このことによ
り、被覆工程の後、粒子当たりの結合パートナーの量に
変動がより少なくなり、従って、検体と標識された試薬
の結合後、粒子当たりの蛍光の変動はより少なくなる。
流動細胞計測法は典型的には粒子関連蛍光のヒストグラ
ムの形態において10,000粒子の個体群からの結果を与え
るので、２試料間の粒子当たりの平均結合における差の
証明がより正確になるほど蛍光分布の変動がより少な
い。それに加え、大きさにおける均一性は、流動細胞計
測法により確実に同定されそして別個に分類されるべき
それらのためにａ及びｂの２つのタイプ間の平均サイズ
におけるより少ない差を要求する。このことは、同じ試
料中に１つより多い検体の濃度を決定するか又は同じ試
料中の１つより多い特定の検体の１つより多い形態を決
定するのに本発明が用いられる場合に特に重要である。
このことは、上記のように各検体特異性に対して１対の
粒子を用いることによりなされるが、混合物において用
いられるすべての粒子タイプが流動細胞計測法において
それらの異なる大きさと区別できる。
本方法は、結合反応が完全に平衡に達した後に結果を
読むために用いられる。遊離の試薬の除去を有する分離
工程は逆の解離を開始するので、真の平衡は均質の分析
においてのみ存在する。従って、流動細胞計測法による
読取りは、分離に基づく方法に対抗するように真の平衡
での測定を可能にする。
読むために用いられる。遊離の試薬の除去を有する分離
工程は逆の解離を開始するので、真の平衡は均質の分析
においてのみ存在する。従って、流動細胞計測法による
読取りは、分離に基づく方法に対抗するように真の平衡
での測定を可能にする。
しかし、ある場合は、平衡に達する前に測定するのが
有利である。それによって２粒子間の結合動態における
差を活用する。すべての試薬は連続的に存在するので、
本発明は、時間の関数として粒子の連続的な測定を可能
にする。そのような適用において、流動細胞計測法では
試薬を試料と混合した後わずか数分で測定を開始でき
る。
有利である。それによって２粒子間の結合動態における
差を活用する。すべての試薬は連続的に存在するので、
本発明は、時間の関数として粒子の連続的な測定を可能
にする。そのような適用において、流動細胞計測法では
試薬を試料と混合した後わずか数分で測定を開始でき
る。
本発明は、それぞれの測定に関して、従来のような１
つでなく２つの量を測定することに基づいており、一組
の測定値と、対応する検体濃度との間に、より信頼でき
る関係が存在する。二重標準曲線（第５図）は２つの粒
子タイプに対する期待される蛍光強度の対応する値を定
めるものである。二重標準曲線中の濃度目盛上の良好に
定められた点に対応しない一対の値が記録される場合、
このことは分析の遂行においてエラーであるか又は未知
の要因であることを示し、従って信頼できない結果の警
告として役立つ。同様に、二重標準曲線によく合致する
一対の測定値は、対応する濃度を決定するのに１つの測
定パラメーターのみに基づいた方法に比較して信頼度を
増大させる。このことは、結果の信頼度の内在的制御を
与える。
つでなく２つの量を測定することに基づいており、一組
の測定値と、対応する検体濃度との間に、より信頼でき
る関係が存在する。二重標準曲線（第５図）は２つの粒
子タイプに対する期待される蛍光強度の対応する値を定
めるものである。二重標準曲線中の濃度目盛上の良好に
定められた点に対応しない一対の値が記録される場合、
このことは分析の遂行においてエラーであるか又は未知
の要因であることを示し、従って信頼できない結果の警
告として役立つ。同様に、二重標準曲線によく合致する
一対の測定値は、対応する濃度を決定するのに１つの測
定パラメーターのみに基づいた方法に比較して信頼度を
増大させる。このことは、結果の信頼度の内在的制御を
与える。
流動細胞計測法における測定は、光散乱又は、粒子混
合物から記録された同様のヒストグラム（第３図及び４
図、パネルＡ）は一連のすべての試料に対して本質的に
同一のままであることに内在的制御を有する。従って、
流動細胞計測法がうまく機能しないことにより生じ得る
エラーは容易に確定される。
合物から記録された同様のヒストグラム（第３図及び４
図、パネルＡ）は一連のすべての試料に対して本質的に
同一のままであることに内在的制御を有する。従って、
流動細胞計測法がうまく機能しないことにより生じ得る
エラーは容易に確定される。
試料中の未知の検体濃度の分析に対する適用に加え、
異なるタイプの粒子に被覆した既知の結合パートナーを
有する物質と比較することにより、１つのタイプの粒子
に結合された物質の結合親和性及び結合動態を決定する
のに本発明を用いることができ、そのような測定は、本
発明により、前記粒子の各々に結合する検体物質の量の
測定又は分析に基づいている。
異なるタイプの粒子に被覆した既知の結合パートナーを
有する物質と比較することにより、１つのタイプの粒子
に結合された物質の結合親和性及び結合動態を決定する
のに本発明を用いることができ、そのような測定は、本
発明により、前記粒子の各々に結合する検体物質の量の
測定又は分析に基づいている。
実施例 原料及び方法 ミクロスフェア粒子 ２つの、異なるサイズで、他の同一のタイプの粒子を
用いた。均質の特性を有する比較的大きい（１−100u
m）単分散粒子を製造する新しく開発された二工程方法
により粒子を製造した（UgelstadらによるAdv.Colloid
Interface Sci 12,101、1980年）。用いた粒子（直径7u
mのSS−072−Ｒ及び直径10umのSS−102−Ｒ）はそれぞ
れMP7及びMP10といわれ［ダイノ パーティクルス（Dyn
o Particles）、Ｎ−2001、リレストローム（Lillestro
m）、ノルウエー］、圧縮（compact）スチレンから製造
された。
用いた。均質の特性を有する比較的大きい（１−100u
m）単分散粒子を製造する新しく開発された二工程方法
により粒子を製造した（UgelstadらによるAdv.Colloid
Interface Sci 12,101、1980年）。用いた粒子（直径7u
mのSS−072−Ｒ及び直径10umのSS−102−Ｒ）はそれぞ
れMP7及びMP10といわれ［ダイノ パーティクルス（Dyn
o Particles）、Ｎ−2001、リレストローム（Lillestro
m）、ノルウエー］、圧縮（compact）スチレンから製造
された。
モノクローナル抗体 癌胚抗原（CEA）に対する３種の異なる抗体を用い
た。粒子被覆に用いた２種の抗体はCEA分子上の同一の
エピトープに対する交差反応を生じる抗体であった。よ
り小さいMP7粒子を被覆するのに用いられる抗体12−140
−５（IgG2a）は3.2.1010M-1の会合定数を有し、より大
きいMP10粒子に用いられる抗体12−140−10（IgG1）は
3.3.109M-1を有した。第三の抗体（12−140−１、IgG
1）を標識された抗体として用い、異なるCEAエピトープ
に指向し、２部位の免疫検定に対する要件を満たす。ビ
オチン−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（calbiochem）を用いてGuesdonらによるJ.H
istochem.Cytochem.、27巻、1131頁、1979年に記載され
ているようにこの抗体を本質的にビオチンに接合させ
た。各抗体分子に対して50のビオチン分子の割合を用
い、0.1モルのNaHCO3中、pH9.5、室温で16時間その反応
を行った。標識した抗体をPBS中バイオゲル（BioGel）P
30カラム（2.2×24cm）を通すゲル濾過法によって、遊
離のビオチンと分離させた。すべての抗体分子は機能的
に活性のビオチン残基を含有した。すべての３つの抗体
はマウスのモノクローナル抗体であった。
た。粒子被覆に用いた２種の抗体はCEA分子上の同一の
エピトープに対する交差反応を生じる抗体であった。よ
り小さいMP7粒子を被覆するのに用いられる抗体12−140
−５（IgG2a）は3.2.1010M-1の会合定数を有し、より大
きいMP10粒子に用いられる抗体12−140−10（IgG1）は
3.3.109M-1を有した。第三の抗体（12−140−１、IgG
1）を標識された抗体として用い、異なるCEAエピトープ
に指向し、２部位の免疫検定に対する要件を満たす。ビ
オチン−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（calbiochem）を用いてGuesdonらによるJ.H
istochem.Cytochem.、27巻、1131頁、1979年に記載され
ているようにこの抗体を本質的にビオチンに接合させ
た。各抗体分子に対して50のビオチン分子の割合を用
い、0.1モルのNaHCO3中、pH9.5、室温で16時間その反応
を行った。標識した抗体をPBS中バイオゲル（BioGel）P
30カラム（2.2×24cm）を通すゲル濾過法によって、遊
離のビオチンと分離させた。すべての抗体分子は機能的
に活性のビオチン残基を含有した。すべての３つの抗体
はマウスのモノクローナル抗体であった。
粒子被覆 第一抗体で粒子を被覆するのに物理的吸着が用いられ
た。1mgの抗体12−140−10をMP10粒子400mgとPBS5ml中
で室温においてゆっくりと転倒型回転を行って一晩イン
キュベーションを行った。12−150−５の抗体の吸着はP
BS2.5ml中抗体1mgとMP7粒子100mgを用いて行われた。粒
子を１％のBSA−PBS−NaN3中で３回洗浄した。粒子mg当
たり抗体4.6ugがMP7粒子に結合し、MP10粒子に2.0ug/mg
結合した。被覆したミクロスフェアは、用いる前に45℃
で貯蔵し、数か月に亘る貯蔵で表面からの抗体の解離は
ほんのわずかしか観察されなかった。
た。1mgの抗体12−140−10をMP10粒子400mgとPBS5ml中
で室温においてゆっくりと転倒型回転を行って一晩イン
キュベーションを行った。12−150−５の抗体の吸着はP
BS2.5ml中抗体1mgとMP7粒子100mgを用いて行われた。粒
子を１％のBSA−PBS−NaN3中で３回洗浄した。粒子mg当
たり抗体4.6ugがMP7粒子に結合し、MP10粒子に2.0ug/mg
結合した。被覆したミクロスフェアは、用いる前に45℃
で貯蔵し、数か月に亘る貯蔵で表面からの抗体の解離は
ほんのわずかしか観察されなかった。
CEA標準 純粋なCEAから、6750ug/lを含有するように希釈系を
作った（BormerによるClin.Biochem.15巻、128頁（1982
年））。
作った（BormerによるClin.Biochem.15巻、128頁（1982
年））。
測定工程 濃度範囲0.2ug/l乃至1350ug/lの、CEA1:3の希釈系列
をエッペンドルフ管に１％BSA−PBS中200ul試料として
作った。一部MP7粒子（9.106粒子/ml濃度）、一部MP10
粒子（15.106粒子/ml濃度）、一部第二ビオチン標識12
−140−１抗体（14ug/ml濃度）及び一部ストレプトアビ
ジン（Streptavidin）−フィコエリトリン接合［非希
釈、ベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメトリー
・システムズ（Becton Dickinson Immunocytometry Sys
tems、カリフォルニア州マウンテンビュウ］を含有する
試薬混合物から40ulを各CEA試料に添加し、上記の個々
の試薬濃度の24×希釈した。試料を暗所で、室温でゆっ
くりと倒置型回転を行い数時間インキュベートし、洗浄
せずに流動細胞計測法で直接分析した。
をエッペンドルフ管に１％BSA−PBS中200ul試料として
作った。一部MP7粒子（9.106粒子/ml濃度）、一部MP10
粒子（15.106粒子/ml濃度）、一部第二ビオチン標識12
−140−１抗体（14ug/ml濃度）及び一部ストレプトアビ
ジン（Streptavidin）−フィコエリトリン接合［非希
釈、ベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメトリー
・システムズ（Becton Dickinson Immunocytometry Sys
tems、カリフォルニア州マウンテンビュウ］を含有する
試薬混合物から40ulを各CEA試料に添加し、上記の個々
の試薬濃度の24×希釈した。試料を暗所で、室温でゆっ
くりと倒置型回転を行い数時間インキュベートし、洗浄
せずに流動細胞計測法で直接分析した。
流動細胞計測法分析 試料をフィコエリトリン蛍光の励起用アルゴンイオン
レーザーからの488nm線の600mWを用いてクールターエピ
ックス（Culter EPICS）Ｖ流動細胞計測法（クールター
・エピックス・ディビジョン、フロリダ州ハイアレア）
で分析した。検出は550−590nmの領域であった。２つの
個体群の各々に対する光分散ヒストグラムにおいて設置
されたウインドウでのゲーティングにより２粒子タイプ
MP7及びMP10を表す対数蛍光強度の個々のヒストグラム
を得た。対数蛍光ヒストグラムの平均チャネル数を粒子
関連蛍光抗体としてとった。
レーザーからの488nm線の600mWを用いてクールターエピ
ックス（Culter EPICS）Ｖ流動細胞計測法（クールター
・エピックス・ディビジョン、フロリダ州ハイアレア）
で分析した。検出は550−590nmの領域であった。２つの
個体群の各々に対する光分散ヒストグラムにおいて設置
されたウインドウでのゲーティングにより２粒子タイプ
MP7及びMP10を表す対数蛍光強度の個々のヒストグラム
を得た。対数蛍光ヒストグラムの平均チャネル数を粒子
関連蛍光抗体としてとった。
結果 第６図はCEA50ug/mlを含有する試料に対して記録され
た流動細胞計測法データーの例を示したものである。そ
れぞれ標識されたａ及びｂである２つの粒子個体群に対
する対数蛍光強度の個々のヒストグラム（パネルC:MP
7、パネルD:MP10）を、光散乱分布において設けたウイ
ンドウで蛍光データー取得をゲーティングすることによ
り得た。各蛍光ヒストグラムに対して平均チャネル数、
すなわち、対数蛍光強度の平均を粒子に結合する抗原の
測定値としてとった。対数蛍光強度に対する光散乱の２
パラメーターのヒストグラム（パネルＢ）は両粒子個体
群からの全体の相関するデーターを示した。
た流動細胞計測法データーの例を示したものである。そ
れぞれ標識されたａ及びｂである２つの粒子個体群に対
する対数蛍光強度の個々のヒストグラム（パネルC:MP
7、パネルD:MP10）を、光散乱分布において設けたウイ
ンドウで蛍光データー取得をゲーティングすることによ
り得た。各蛍光ヒストグラムに対して平均チャネル数、
すなわち、対数蛍光強度の平均を粒子に結合する抗原の
測定値としてとった。対数蛍光強度に対する光散乱の２
パラメーターのヒストグラム（パネルＢ）は両粒子個体
群からの全体の相関するデーターを示した。
第7A図が、試料のCEA濃度の関数としてMP7（ａ）及び
MP10（ｂ）粒子に対する蛍光文布の平均チャネル数をプ
ロットすることにより得られる二重標準曲線を示すもの
である。高親和性MP7粒子（ａ）は、0.2ug/l（1pM）で
すでに多くの結合を示し、一方MP10低親和性粒子（ｂ）
への結合はこの濃度では非特異的結合（NSB）に対して
示されたレベルと有意には異ならなかった。試薬を添加
しない粒子からの信号レベルもまた示されている
（Ｐ）。
MP10（ｂ）粒子に対する蛍光文布の平均チャネル数をプ
ロットすることにより得られる二重標準曲線を示すもの
である。高親和性MP7粒子（ａ）は、0.2ug/l（1pM）で
すでに多くの結合を示し、一方MP10低親和性粒子（ｂ）
への結合はこの濃度では非特異的結合（NSB）に対して
示されたレベルと有意には異ならなかった。試薬を添加
しない粒子からの信号レベルもまた示されている
（Ｐ）。
試験された低及び中濃度範囲を通して、高親和性粒子
は、より大きな低親和性粒子より高い蛍光を有した。し
かし、高親和性粒子に対する蛍光強度が高CEA濃度で水
平状態となり、最終的に、フック効果による結果として
減少し始めたのに対し、低親和性粒子に対して測定され
た蛍光強度はなおCEA濃度とともに増加した。
は、より大きな低親和性粒子より高い蛍光を有した。し
かし、高親和性粒子に対する蛍光強度が高CEA濃度で水
平状態となり、最終的に、フック効果による結果として
減少し始めたのに対し、低親和性粒子に対して測定され
た蛍光強度はなおCEA濃度とともに増加した。
第7B図は第7A図に示されたデーターから計算されるよ
うにこのタイプの分析に対する二倍精度プロフィールを
示すものである。この精度プロフィールは、分析に用い
た濃度範囲を超える一定の抗原濃度又は用量（Ｄ）の測
定においては、比較的不確実なプロットである［エキン
ズ（Ekins）らによるImmunoassays for Clinical Chemi
stry、２版、Churchill and Livingston、76頁（1983
年）］。その精度プロフィールは通常、異なる濃度での
並行試料全組から計算される。しかし、第7A図における
二重標準曲線からその精度プロフィールに関する標準曲
線の形の重要な影響がもたらされ得る。
うにこのタイプの分析に対する二倍精度プロフィールを
示すものである。この精度プロフィールは、分析に用い
た濃度範囲を超える一定の抗原濃度又は用量（Ｄ）の測
定においては、比較的不確実なプロットである［エキン
ズ（Ekins）らによるImmunoassays for Clinical Chemi
stry、２版、Churchill and Livingston、76頁（1983
年）］。その精度プロフィールは通常、異なる濃度での
並行試料全組から計算される。しかし、第7A図における
二重標準曲線からその精度プロフィールに関する標準曲
線の形の重要な影響がもたらされ得る。
第7B図は、反復する実験試料の並行ヒストグラム間の
平均チャネル値における2.0の差に基づく％でＤの相対
標準偏差値を示すものである。第7B図に、10％精度のレ
ベルに対応する分析の実施範囲を示すために水平線を引
いた。
平均チャネル値における2.0の差に基づく％でＤの相対
標準偏差値を示すものである。第7B図に、10％精度のレ
ベルに対応する分析の実施範囲を示すために水平線を引
いた。
10％精度のこのレベルでは、２倍精度プロフィール
は、30の動的範囲に対応する、約0.2乃至200ug/lの実施
範囲を意味する。高親和性粒子から得られる測定は低濃
度範囲において高精度を与え、低親和性粒子から得られ
る測定は高濃度範囲において高精度を与える。第7B図に
示されているように、高親和性粒子のみを用いることに
より得られた範囲は20か又は恐らく20未満に対応する。
は、30の動的範囲に対応する、約0.2乃至200ug/lの実施
範囲を意味する。高親和性粒子から得られる測定は低濃
度範囲において高精度を与え、低親和性粒子から得られ
る測定は高濃度範囲において高精度を与える。第7B図に
示されているように、高親和性粒子のみを用いることに
より得られた範囲は20か又は恐らく20未満に対応する。
Claims (11)
- 【請求項１】分析する各検体用に、試料中に前記検体に
結合するために前記検体に対して特異的結合パートナー
を有する単分散粒子を用い、前記結合検体量を示すため
に標識されたリガンドを用い、粒子に結合した標識され
たリガンドの量を流動細胞計測法により測定する、水性
試料における１以上の検体の分析方法において、分析す
る各検体用に一対の異なる粒子タイプを用い、前記一対
の２つの粒子タイプの各々の粒子が同一の特異性を有す
るが前記検体に対して異なる結合親和性を有する結合パ
ートナーを保持し、分析する各検体と反応し、標識され
たリガンドにより標識された一対の粒子タイプは、相互
にそして、分析する他の各検体と反応した対の粒子タイ
プと流動細胞計測法により区別され得ることを特徴とす
る方法。 - 【請求項２】分析する試料における１つより多い検体及
び用いるすべての単分散粒子タイプを流動細胞計測法に
より別個に決定する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】用いられるすべての単分散粒子タイプを粒
子サイズの違いにより流動細胞計測法で区別する、請求
項１又は請求項２に記載された方法。 - 【請求項４】前記標識は流動細胞計測法により量的に測
定し得る測光的信号を与える物質である、請求項１乃至
３のいずれか１請求項に記載の方法。 - 【請求項５】前記蛍光信号を又引き起こす光源により生
じる光の散乱を推定することにより粒子サイズの違いを
測定する、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】検体結合反応が平衡に達したときに流動細
胞計測法を行う、請求項１乃至５のいずれか１請求項に
記載の方法。 - 【請求項７】検体結合反応が平衡に達する前に流動細胞
計測法を行い、それによって前記結合反応の動態を調べ
る、請求項１乃至５のいずれか１請求項に記載の方法。 - 【請求項８】無関係な抗体を有する他のタイプの粒子を
含有し、それによって標識された結合パートナーの非特
異的結合のレベルの表示を与える、請求項１乃至７のい
ずれか１請求項に記載の方法。 - 【請求項９】検体及び結合パートナーの対が（ａ）抗原
及び特異的抗体、（ｂ）ホルモン及びホルモン受容体、
（ｃ）ハプテン及び抗ハプテン、（ｄ）ポリヌクレオチ
ド及び相補的ポリヌクレオチド、（ｅ）ポリヌクレオチ
ド及びポリヌクレオチド結合蛋白質、（ｆ）ビオチン及
びアビジン又はストレプトアビジン、（ｇ）酵素及び酵
素補因子及び（ｈ）レクチン（lectin）及び特異的炭水
化物から選択される、請求項１乃至８のいずれか１請求
項に記載の方法。 - 【請求項１０】前記検体が抗原でその結果結合パートナ
ーがモノクローナル抗体である、請求項９に記載の方
法。 - 【請求項１１】（ａ）分析する各抗体用に、その検体に
対する第一特異的結合パートナーを保持する単分散粒
子、 （ｂ）分析する各検体用に、前記第一特異的結合パート
ナーと同一の特異性を有するが、前記検体に対して異な
る結合親和性を有する第二特異的結合パートナーを保持
する単分散粒子、 （ｃ）各結合検体量の表示を与える標識されたリガンド
を含み、 単分散粒子（ａ）及び（ｂ）が相互に又、用いられるす
べての粒子タイプが、それぞれの検体と反応し、前記の
標識されたリガンドにより標識された後に流動細胞計測
法により別個に決定され得るように、試料中の他の検体
に対応するいずれの粒子タイプとも区別できる、試料中
の１つ以上の検体の流動細胞計測法に用いるキット。
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