JPH06317592A - 生体特異的検定法 - Google Patents
生体特異的検定法Info
- Publication number
- JPH06317592A JPH06317592A JP6042782A JP4278294A JPH06317592A JP H06317592 A JPH06317592 A JP H06317592A JP 6042782 A JP6042782 A JP 6042782A JP 4278294 A JP4278294 A JP 4278294A JP H06317592 A JPH06317592 A JP H06317592A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- assay
- microparticles
- analyte
- sample
- labeled
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/968—High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/973—Simultaneous determination of more than one analyte
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
- Y10S436/814—Pregnancy
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
- Y10S436/817—Steroids or hormones
- Y10S436/818—Human chorionic gonadotropin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/825—Pretreatment for removal of interfering factors from sample
Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、生体特異的検定法を提供すること
を目的とする。 【構成】 本法においては、検定されるべき分析物を結
合している生体アフィニティー反応体A で被覆されてい
る微粒子、分析されるべきサンプル、及び標識された生
体アフィニティー反応体B を混合し、結合反応後、微粒
子に結合した標識された生体アフィニティー反応体B か
らのシグナル強度を、上記サンプル中の分析物の濃度の
測定のために定量する。本発明に従えば、サンプル及び
微粒子の量を、そのサンプルの分析物がある量の微粒子
に結合した後、それぞれの個々の微粒子が、典型的な分
析物濃度の全範囲にわたり、そのサンプルのその分析物
濃度の測定を可能にするようなシグナル強度を放射し、
そしてそれぞれの微粒子からのシグナル強度を別々に測
定するような検定において、使用する。
を目的とする。 【構成】 本法においては、検定されるべき分析物を結
合している生体アフィニティー反応体A で被覆されてい
る微粒子、分析されるべきサンプル、及び標識された生
体アフィニティー反応体B を混合し、結合反応後、微粒
子に結合した標識された生体アフィニティー反応体B か
らのシグナル強度を、上記サンプル中の分析物の濃度の
測定のために定量する。本発明に従えば、サンプル及び
微粒子の量を、そのサンプルの分析物がある量の微粒子
に結合した後、それぞれの個々の微粒子が、典型的な分
析物濃度の全範囲にわたり、そのサンプルのその分析物
濃度の測定を可能にするようなシグナル強度を放射し、
そしてそれぞれの微粒子からのシグナル強度を別々に測
定するような検定において、使用する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生体特異的検定法であ
って、検定されるべき分析物が、その分析物を結合する
生体アフィニティー反応体を通して、微粒子の表面に結
合し、そして個々の微粒子に結合した分析物の量を測定
するような検定法に関する。
って、検定されるべき分析物が、その分析物を結合する
生体アフィニティー反応体を通して、微粒子の表面に結
合し、そして個々の微粒子に結合した分析物の量を測定
するような検定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】本発明の背景を明らかにするために本明
細書中で使用する刊行物及び他の物、並びに特に、その
実務に関する追加の詳細を提供するためのケースを、引
用により本明細書中に取り込む。伝統的に、ラジオイム
ノアッセイは、その始まりにおいて、試験管及び複雑な
分離法を使用して、溶液中で行われた。固相技術の出現
により、放射性同位体が、種々の標識により置き換えら
れ、そして特に、モノクロナール抗体が増加する数の用
途において、使用されてきた。上記の改良は、より広い
範囲の伝統的な免疫検定及び利用可能な他の生体アフィ
ニティー検定法( 例えば、Alternative Immunoassays,
W.P. Collins, Wiley,Chichester 1985及びLuminescenc
e Immunoassay and Molecular Applications,Ed. Knox
van Dyke, CRC Press, Boston 1990及びR.P. Ekins et
al., Clin. Chem. 1991; 37:1955-1967)を作ってきた。
固相検定は、競合的及び非競合的な検定の分野の両方に
おいて定例的な検定法になっており、そして伝統的な試
験管は、しばしば、他の固相装置により置き換えられて
きた。このマイクロタイター・プレートは、Wallac Oy
(Turku, Finland) がそれらのDELFIA技術を導入したと
き、1984年に定例的なホルモン検定のために固相として
導入された。他の商業的企業も、類似の定例的な検定に
おいてマイクロタイター・プレートを改良したが、これ
らは、異なる標識付け技術に基づいている。
細書中で使用する刊行物及び他の物、並びに特に、その
実務に関する追加の詳細を提供するためのケースを、引
用により本明細書中に取り込む。伝統的に、ラジオイム
ノアッセイは、その始まりにおいて、試験管及び複雑な
分離法を使用して、溶液中で行われた。固相技術の出現
により、放射性同位体が、種々の標識により置き換えら
れ、そして特に、モノクロナール抗体が増加する数の用
途において、使用されてきた。上記の改良は、より広い
範囲の伝統的な免疫検定及び利用可能な他の生体アフィ
ニティー検定法( 例えば、Alternative Immunoassays,
W.P. Collins, Wiley,Chichester 1985及びLuminescenc
e Immunoassay and Molecular Applications,Ed. Knox
van Dyke, CRC Press, Boston 1990及びR.P. Ekins et
al., Clin. Chem. 1991; 37:1955-1967)を作ってきた。
固相検定は、競合的及び非競合的な検定の分野の両方に
おいて定例的な検定法になっており、そして伝統的な試
験管は、しばしば、他の固相装置により置き換えられて
きた。このマイクロタイター・プレートは、Wallac Oy
(Turku, Finland) がそれらのDELFIA技術を導入したと
き、1984年に定例的なホルモン検定のために固相として
導入された。他の商業的企業も、類似の定例的な検定に
おいてマイクロタイター・プレートを改良したが、これ
らは、異なる標識付け技術に基づいている。
【０００３】異なる材料から作られた微粒子が、しばし
ば、生体アフィニティー検定のための別の固相として使
用されてきた( 例えば、Molday W.J. et al., J. Cell.
Biol.: 1975: 64, 75及びNustad K. et al.: Microshe
res. Medical and biological applications, Ed. A. R
ebaum and Z.A. Toekes, Boca Raton, Florida, CRCPre
ss 1988) 。マイクロタイター・プレートと比較して、
この微粒子は、幾つかの利点を、例えば、製造規模によ
り容易に改良できる生体アフィニティー反応体のための
固定化方法、並びに微粒子を使用するときに得られるよ
り高い反応速度を提供する。この微粒子会合固相の能力
は、問題の方法に最適な粒子の量を単に計量配分するこ
とにより容易に制御することもできる。微粒子の最も大
きな利点は、伝統的に、液体の取扱( 例えば、洗浄) に
関連してきた。磁気微小球の導入により、この問題は、
部分的に克服され、そして近年、増大する数の商業的に
自動化された免疫検定法がそれらの使用に基づいてき
た。今日、新規の製造方法が、正確かつ再生産可能なサ
イズ( 例えば、直径0.04〜100 μm)の微粒子の製造を可
能にしている。また、その微粒子上への生体アフィニテ
ィー反応体の固定化も、様々な化学的方法により行われ
ることができる。
ば、生体アフィニティー検定のための別の固相として使
用されてきた( 例えば、Molday W.J. et al., J. Cell.
Biol.: 1975: 64, 75及びNustad K. et al.: Microshe
res. Medical and biological applications, Ed. A. R
ebaum and Z.A. Toekes, Boca Raton, Florida, CRCPre
ss 1988) 。マイクロタイター・プレートと比較して、
この微粒子は、幾つかの利点を、例えば、製造規模によ
り容易に改良できる生体アフィニティー反応体のための
固定化方法、並びに微粒子を使用するときに得られるよ
り高い反応速度を提供する。この微粒子会合固相の能力
は、問題の方法に最適な粒子の量を単に計量配分するこ
とにより容易に制御することもできる。微粒子の最も大
きな利点は、伝統的に、液体の取扱( 例えば、洗浄) に
関連してきた。磁気微小球の導入により、この問題は、
部分的に克服され、そして近年、増大する数の商業的に
自動化された免疫検定法がそれらの使用に基づいてき
た。今日、新規の製造方法が、正確かつ再生産可能なサ
イズ( 例えば、直径0.04〜100 μm)の微粒子の製造を可
能にしている。また、その微粒子上への生体アフィニテ
ィー反応体の固定化も、様々な化学的方法により行われ
ることができる。
【０００４】上記の競合的な生体特異的検定法を、以下
のように記載することができる: 微粒子を生体アフィニ
ティー試薬A により被覆し、その結合部位について、一
方で、そのサンプル中に含まれる分析物が競合し、そし
て他方で、生体アフィニティー試薬B も、本ケースにお
いては、適切に標識された分析物も、その結合部位につ
いて競合する。免疫検定の場合においては、生体特異的
試薬B は、標識された抗原であろうし、その抗原は、そ
のサンプル中に含まれる抗原と同じであり、又は好適に
標識されたそれらの誘導体と同じである。サンプル中に
含まれる分析物及び標識された分析物が上記の生体アフ
ィニティー試薬A の結合部位について競合するので、反
応体A を介して微粒子に結合する標識の量及びその結果
としてのその微粒子からのシグナルは、そのサンプル中
の分析物の濃度に関して反比例するであろう。上記の非
競合的な生体特異的検定法を、以下のように記載するこ
とができる:微粒子を生体アフィニティー試薬A により
被覆し、その結合部位は、そのサンプル中に含まれる分
析物と結合するだけである。本ケースにおいては、その
サンプル中に含まれる分析物に対して向けられた好適に
標識された反応体である生体アフィニティー反応体B
は、上記の生体アフィニティー反応体A を介して微粒子
に結合した分析物により結合される。免疫検定の場合に
おいては、生体アフィニティー反応体B は、そのサンプ
ル中に含まれる抗原に対して向けられた標識された抗体
であろう。反応体A を介して微粒子に結合する標識の量
及びその結果としてのその微粒子からのシグナル強度
は、そのサンプル中の分析物の濃度に関して比例するで
あろう。
のように記載することができる: 微粒子を生体アフィニ
ティー試薬A により被覆し、その結合部位について、一
方で、そのサンプル中に含まれる分析物が競合し、そし
て他方で、生体アフィニティー試薬B も、本ケースにお
いては、適切に標識された分析物も、その結合部位につ
いて競合する。免疫検定の場合においては、生体特異的
試薬B は、標識された抗原であろうし、その抗原は、そ
のサンプル中に含まれる抗原と同じであり、又は好適に
標識されたそれらの誘導体と同じである。サンプル中に
含まれる分析物及び標識された分析物が上記の生体アフ
ィニティー試薬A の結合部位について競合するので、反
応体A を介して微粒子に結合する標識の量及びその結果
としてのその微粒子からのシグナルは、そのサンプル中
の分析物の濃度に関して反比例するであろう。上記の非
競合的な生体特異的検定法を、以下のように記載するこ
とができる:微粒子を生体アフィニティー試薬A により
被覆し、その結合部位は、そのサンプル中に含まれる分
析物と結合するだけである。本ケースにおいては、その
サンプル中に含まれる分析物に対して向けられた好適に
標識された反応体である生体アフィニティー反応体B
は、上記の生体アフィニティー反応体A を介して微粒子
に結合した分析物により結合される。免疫検定の場合に
おいては、生体アフィニティー反応体B は、そのサンプ
ル中に含まれる抗原に対して向けられた標識された抗体
であろう。反応体A を介して微粒子に結合する標識の量
及びその結果としてのその微粒子からのシグナル強度
は、そのサンプル中の分析物の濃度に関して比例するで
あろう。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記の競合的及び非競
合的な免疫検定の感度は、先に広く討議されている(Eki
ns R.P. et al., Pure and Appl. Chem., 1985; 57: 47
3-482 及びEkins R.P. et al., Clin. Chem., 1991; 3
7: 1955-1967)。本発明に関しては、それぞれの検定原
理の感度及び機能に影響を及ぼす要因を考慮することが
不可欠である。アフィニティー定数K をもつ抗体( 生体
アフィニティー反応体) を使用するときの競合的免疫検
定における最大感度は、ゼロ濃度におけるそのシグナル
強度の相対誤差をK により除すことにより得られるであ
ろう。このシグナル強度の誤差は、2 つの成分、すなわ
ち、ピペット操作及び他の操作による実験的な誤差成
分、及びシグナル強度測定成分、例えば、シグナル強度
測定の統計的な誤差により、影響されるであろう。簡単
にするために、シグナル強度測定による誤差を、0とみ
なすと、それは、普通には、その標識の比活性が高いと
きの場合である。競合的検定の達成可能な最大の感度
は、目下、ε/Kである( ここで、εは、実験的要因によ
る結合した相対誤差である。) 。例えば、上記の実験誤
差が、1%のオーダーを有していると仮定すれば; 可能な
限り高いアフィニティー定数、例えば、1012l/mol をも
つ抗体を使用して、その時、達成できる最大感度は、0.
01ピコモル/lのオーダーを有する。この感度の定義は、
上記の実験誤差が殆ど完全に取り除かれること(<0.1%)
ができない場合には、非常に高い比活性をもつ標識の使
用において得られるであろう感度の利点がないというこ
とも、証明している。
合的な免疫検定の感度は、先に広く討議されている(Eki
ns R.P. et al., Pure and Appl. Chem., 1985; 57: 47
3-482 及びEkins R.P. et al., Clin. Chem., 1991; 3
7: 1955-1967)。本発明に関しては、それぞれの検定原
理の感度及び機能に影響を及ぼす要因を考慮することが
不可欠である。アフィニティー定数K をもつ抗体( 生体
アフィニティー反応体) を使用するときの競合的免疫検
定における最大感度は、ゼロ濃度におけるそのシグナル
強度の相対誤差をK により除すことにより得られるであ
ろう。このシグナル強度の誤差は、2 つの成分、すなわ
ち、ピペット操作及び他の操作による実験的な誤差成
分、及びシグナル強度測定成分、例えば、シグナル強度
測定の統計的な誤差により、影響されるであろう。簡単
にするために、シグナル強度測定による誤差を、0とみ
なすと、それは、普通には、その標識の比活性が高いと
きの場合である。競合的検定の達成可能な最大の感度
は、目下、ε/Kである( ここで、εは、実験的要因によ
る結合した相対誤差である。) 。例えば、上記の実験誤
差が、1%のオーダーを有していると仮定すれば; 可能な
限り高いアフィニティー定数、例えば、1012l/mol をも
つ抗体を使用して、その時、達成できる最大感度は、0.
01ピコモル/lのオーダーを有する。この感度の定義は、
上記の実験誤差が殆ど完全に取り除かれること(<0.1%)
ができない場合には、非常に高い比活性をもつ標識の使
用において得られるであろう感度の利点がないというこ
とも、証明している。
【０００６】同様に、非競合的なものの感度に影響を与
える要因は、以下の: a)分析物が省かれたときのシグナル強度の相対誤差(
α) 、すなわち、標識された抗体( 生体アフィニティー
反応体) の非特異的な結合による誤差、 b)非特異的に結合した標識された抗体の相対量(k) 、及
び、 c)その抗体のアフィニティー定数(K)である。非競合的
検定の感度は、この時、k/K x αである。競合及び非競
合検定の両方の感度は、使用される抗体のアフィニティ
ー定数に関して反比例するが、非競合的検定は、一方
で、標識された抗体の非特異的結合による相対誤差によ
り、他方で、その標識された抗体の相対的な結合によ
り、影響を受け、それらの両方が、例えば、1%の値にあ
てがわれることができるであろう。非競合的検定の最大
感度は、この時、0.0001 x 1/K又は0.1 fmol/ l であ
り、使用される抗体のアフィニティー定数が1012l/mol
の場合には、これは、普通には、可能な最も高い値であ
ると考えられる。非競合的な検定においては、その標識
の比活性を考慮することが賢明である。なぜなら、それ
は、要因a)及びb)に影響を与え、そしてその検定の感度
を改善する可能性を提供するからである。生体アフィニ
ティー反応に基づく検定においては、様々な測定の感度
を構造的に限定する要因をも考慮しなければならない;
このことは、本発明に関しても不可欠である。なぜな
ら、測定値が、存在する非常に少量の分析物をもつ個々
の微粒子から取り出されるであろうからである。
える要因は、以下の: a)分析物が省かれたときのシグナル強度の相対誤差(
α) 、すなわち、標識された抗体( 生体アフィニティー
反応体) の非特異的な結合による誤差、 b)非特異的に結合した標識された抗体の相対量(k) 、及
び、 c)その抗体のアフィニティー定数(K)である。非競合的
検定の感度は、この時、k/K x αである。競合及び非競
合検定の両方の感度は、使用される抗体のアフィニティ
ー定数に関して反比例するが、非競合的検定は、一方
で、標識された抗体の非特異的結合による相対誤差によ
り、他方で、その標識された抗体の相対的な結合によ
り、影響を受け、それらの両方が、例えば、1%の値にあ
てがわれることができるであろう。非競合的検定の最大
感度は、この時、0.0001 x 1/K又は0.1 fmol/ l であ
り、使用される抗体のアフィニティー定数が1012l/mol
の場合には、これは、普通には、可能な最も高い値であ
ると考えられる。非競合的な検定においては、その標識
の比活性を考慮することが賢明である。なぜなら、それ
は、要因a)及びb)に影響を与え、そしてその検定の感度
を改善する可能性を提供するからである。生体アフィニ
ティー反応に基づく検定においては、様々な測定の感度
を構造的に限定する要因をも考慮しなければならない;
このことは、本発明に関しても不可欠である。なぜな
ら、測定値が、存在する非常に少量の分析物をもつ個々
の微粒子から取り出されるであろうからである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、その検定法中
において、検定されるべき分析物を結合している生体ア
フィニティー反応体A で被覆されている微粒子; 分析さ
れるべきサンプル、及び標識された生体アフィニティー
反応体B を、混合するような生体特異的検定法に関す
る。この結合反応後、上記微粒子に結合した標識された
生体アフィニティー反応体B からのシグナル強度を、上
記サンプル中の分析物の濃度の測定のために定量する。
本発明に従えば、そのサンプルの分析物がある量の微粒
子に結合した後、それぞれの個々の微粒子が、典型的な
分析物濃度の全範囲にわたり、そのサンプルのその分析
物濃度の測定を可能にするようなシグナル強度を放射す
る、ような量のサンプル及び微粒子を、その検定におい
て使用し、そして、それぞれの微粒子からのシグナル強
度を別々に測定する。
において、検定されるべき分析物を結合している生体ア
フィニティー反応体A で被覆されている微粒子; 分析さ
れるべきサンプル、及び標識された生体アフィニティー
反応体B を、混合するような生体特異的検定法に関す
る。この結合反応後、上記微粒子に結合した標識された
生体アフィニティー反応体B からのシグナル強度を、上
記サンプル中の分析物の濃度の測定のために定量する。
本発明に従えば、そのサンプルの分析物がある量の微粒
子に結合した後、それぞれの個々の微粒子が、典型的な
分析物濃度の全範囲にわたり、そのサンプルのその分析
物濃度の測定を可能にするようなシグナル強度を放射す
る、ような量のサンプル及び微粒子を、その検定におい
て使用し、そして、それぞれの微粒子からのシグナル強
度を別々に測定する。
【０００８】本発明は、使用された高感度の標識技術に
より、個々の微粒子の表面に結合された分析物の測定を
可能にするような量の微粒子を選択することにより、最
小の分析物濃度における、かつ、最小容量における、サ
ンプル中の分析物の検定を可能にする。この生体特異的
な反応は、免疫検定、核酸ハイブリダイゼーション検
定、リガンド- レクチン検定又はリガンド- レセプタ検
定であることができる。この生体アフィニティー反応
は、有利には、1mm 未満の直径をもつ微粒子上で行われ
ることができる。この微粒子の表面上の分析物濃度は、
標識された生体アフィニティー反応体B であって、その
標識が、蛍光、時間分解蛍光、化学発光若しくは生物発
光を放射するものであるようなものよって、測定される
ことができる。本発明は、個々の微粒子からの分析物の
最も高く且つ最も低い濃度の両方の測定を可能にする。
本検定の感度及び測定レンジは、本検定中で使用される
微粒子の量により制御される。
より、個々の微粒子の表面に結合された分析物の測定を
可能にするような量の微粒子を選択することにより、最
小の分析物濃度における、かつ、最小容量における、サ
ンプル中の分析物の検定を可能にする。この生体特異的
な反応は、免疫検定、核酸ハイブリダイゼーション検
定、リガンド- レクチン検定又はリガンド- レセプタ検
定であることができる。この生体アフィニティー反応
は、有利には、1mm 未満の直径をもつ微粒子上で行われ
ることができる。この微粒子の表面上の分析物濃度は、
標識された生体アフィニティー反応体B であって、その
標識が、蛍光、時間分解蛍光、化学発光若しくは生物発
光を放射するものであるようなものよって、測定される
ことができる。本発明は、個々の微粒子からの分析物の
最も高く且つ最も低い濃度の両方の測定を可能にする。
本検定の感度及び測定レンジは、本検定中で使用される
微粒子の量により制御される。
【０００９】本発明は、多くのタイプの生体特異的アフ
ィニティー反応に使用することができる。但し、最も一
般的に使用されるものは、免疫化学反応である。それ
故、本発明を免疫化学的検定として優先的に記載する。
関連の生体特異的アフィニティー反応( 免疫反応) は、
競合的又は非競合的のいずれかであることができる。両
方の免疫検定の原理は、一般的に、公知である。上記の
免疫検定法の感度に影響を与える要因が知られており、
そしてその検定の最適な感度を計算することができる。
上記の競合的検定において達成できる最も高い感度は、
約10 fmol/l である。この感度を、その使用される標識
の比活性を増加させることにより改善することができ
る。感度は、最小抗体濃度を使用することにより、ある
程度まで改善されることができる。この競合的検定にお
いては、測定されるべき標識からのシグナル強度は、検
定されるべきサンプル( 分析物) の濃度に関して反比例
する。非競合的検定において達成されることができる可
能な限り最も高い感度は、約0.1 〜0.01 fmol/l であ
る。。この感度は、非常に高い比活性をもつ標識を使用
することができる場合に、強化されることができる。こ
の感度は、その検定の背景( その表面への非特異的な結
合) が低く残る場合に、標識された抗体の可能な限りの
最も高い濃度により、ある程度まで改善されることがで
きる。非競合的検定においては、測定されるべき標識か
らのシグナル強度は、検定されるべきサンプル( 分析
物) の濃度に関して比例する。
ィニティー反応に使用することができる。但し、最も一
般的に使用されるものは、免疫化学反応である。それ
故、本発明を免疫化学的検定として優先的に記載する。
関連の生体特異的アフィニティー反応( 免疫反応) は、
競合的又は非競合的のいずれかであることができる。両
方の免疫検定の原理は、一般的に、公知である。上記の
免疫検定法の感度に影響を与える要因が知られており、
そしてその検定の最適な感度を計算することができる。
上記の競合的検定において達成できる最も高い感度は、
約10 fmol/l である。この感度を、その使用される標識
の比活性を増加させることにより改善することができ
る。感度は、最小抗体濃度を使用することにより、ある
程度まで改善されることができる。この競合的検定にお
いては、測定されるべき標識からのシグナル強度は、検
定されるべきサンプル( 分析物) の濃度に関して反比例
する。非競合的検定において達成されることができる可
能な限り最も高い感度は、約0.1 〜0.01 fmol/l であ
る。。この感度は、非常に高い比活性をもつ標識を使用
することができる場合に、強化されることができる。こ
の感度は、その検定の背景( その表面への非特異的な結
合) が低く残る場合に、標識された抗体の可能な限りの
最も高い濃度により、ある程度まで改善されることがで
きる。非競合的検定においては、測定されるべき標識か
らのシグナル強度は、検定されるべきサンプル( 分析
物) の濃度に関して比例する。
【００１０】上記の競合的な免疫検定においては、検定
されるべき分析物の測定レンジが、典型的に、100 倍で
ある、すなわち、最も低い測定値に対する最も高い測定
値の比が100 である程広いということ予想することがで
きる。競合的検定においては、最も低い濃度が、最も強
いシグナルを与え、そして最も高い濃度が、最も弱いシ
グナルを与える。微粒子の使用に基づく競合的検定にお
いては、その測定値は、個々の粒子から取り出され、そ
の最も低い濃度及びその最も高い濃度の両方から、その
シグナル強度を測定することができなければならない。
我々が、検定されるべきサンプルについて、1 〜0.01 p
mol/l の測定レンジを仮定する場合は、その時は、それ
ぞれ、0.01 pmol/l の濃度が、最も強いシグナルし、そ
して、1pmol/lが、最も弱いシグナルに対応する。本例
の分析物の濃度は、1 〜0.01 attomol/ μl であり、こ
れは、1 μl のサンプル容量( 検定されるべき分析物の
1〜0.01 attomol) を使用するとき、単一の微粒子か
ら、最も高い(0.01 attomolのサンプル) 及び最も低い
(1 attomolのサンプル) のシグナル強度の両方を、測定
できなければならないということを、意味している。こ
のことは、競合する分析物の濃度が低いとき、可能な限
り最も高い数の分析物、すなわち、生体アフィニティー
反応体分子が、特異的抗体、すなわち、第二生体アフィ
ニティー反応体で被覆された単一の微粒子の表面に特異
的に結合するであろうということを意味している。この
最も低い分析物の濃度は、それぞれ、1 μl のサンプル
容量が、検定されるべき分析物の約6,000 分子を含み、
一方、最も高い濃度が、マイクロリッター中の約600,00
0 分子に対応することを意味している。
されるべき分析物の測定レンジが、典型的に、100 倍で
ある、すなわち、最も低い測定値に対する最も高い測定
値の比が100 である程広いということ予想することがで
きる。競合的検定においては、最も低い濃度が、最も強
いシグナルを与え、そして最も高い濃度が、最も弱いシ
グナルを与える。微粒子の使用に基づく競合的検定にお
いては、その測定値は、個々の粒子から取り出され、そ
の最も低い濃度及びその最も高い濃度の両方から、その
シグナル強度を測定することができなければならない。
我々が、検定されるべきサンプルについて、1 〜0.01 p
mol/l の測定レンジを仮定する場合は、その時は、それ
ぞれ、0.01 pmol/l の濃度が、最も強いシグナルし、そ
して、1pmol/lが、最も弱いシグナルに対応する。本例
の分析物の濃度は、1 〜0.01 attomol/ μl であり、こ
れは、1 μl のサンプル容量( 検定されるべき分析物の
1〜0.01 attomol) を使用するとき、単一の微粒子か
ら、最も高い(0.01 attomolのサンプル) 及び最も低い
(1 attomolのサンプル) のシグナル強度の両方を、測定
できなければならないということを、意味している。こ
のことは、競合する分析物の濃度が低いとき、可能な限
り最も高い数の分析物、すなわち、生体アフィニティー
反応体分子が、特異的抗体、すなわち、第二生体アフィ
ニティー反応体で被覆された単一の微粒子の表面に特異
的に結合するであろうということを意味している。この
最も低い分析物の濃度は、それぞれ、1 μl のサンプル
容量が、検定されるべき分析物の約6,000 分子を含み、
一方、最も高い濃度が、マイクロリッター中の約600,00
0 分子に対応することを意味している。
【００１１】分析物の濃度の増加に伴い、約100%から約
5 〜25% まで、そのシグナル強度が減少するのが、競合
的検定の典型である。微粒子の量及びそれらの上に被覆
された分析物特異的抗体の量は、その最も高いサンプル
濃度において、75〜95% の(検定されるべき分析物によ
る標識された分析物の) 置き換えを可能にするように、
最小のサンプル容量に調整されるであろう。このこと
は、さらに、標識技術の使用により、個々の微粒子の表
面から、その残りのシグナル強度が再現性をもって測定
されることを可能にし、そして同時に、その最も低い分
析物濃度に対応する( その被覆された微粒子へのその標
識された分析の特異的結合による) シグナル強度は、個
々の粒子の結合能力を超えることはないであろう。この
測定レンジは、測定値が常に個々の微粒子から取り出さ
れることができるようなやり方で、その検定方法におい
て使用する微粒子及び抗体の量を変更することにより、
それぞれの検定のために調整される。
5 〜25% まで、そのシグナル強度が減少するのが、競合
的検定の典型である。微粒子の量及びそれらの上に被覆
された分析物特異的抗体の量は、その最も高いサンプル
濃度において、75〜95% の(検定されるべき分析物によ
る標識された分析物の) 置き換えを可能にするように、
最小のサンプル容量に調整されるであろう。このこと
は、さらに、標識技術の使用により、個々の微粒子の表
面から、その残りのシグナル強度が再現性をもって測定
されることを可能にし、そして同時に、その最も低い分
析物濃度に対応する( その被覆された微粒子へのその標
識された分析の特異的結合による) シグナル強度は、個
々の粒子の結合能力を超えることはないであろう。この
測定レンジは、測定値が常に個々の微粒子から取り出さ
れることができるようなやり方で、その検定方法におい
て使用する微粒子及び抗体の量を変更することにより、
それぞれの検定のために調整される。
【００１２】非競合的免疫検定の感度は、最もよくて
も、0.01〜0.1 fmol/lであり、そしてその測定レンジ
は、典型的には、100 倍を超える、すなわち、最も低い
測定値に対する最も高い測定値の比が100 より大きい。
本検定において測定されるシグナル強度は、検定される
べき分析物の濃度に関して比例する。検定されるべき分
析物に必要な0.01 pmol/l の感度のためには、そして1,
000 倍の測定レンジを予想すれば、1 μl のサンプル容
量は、検定されるべき分析物の0.01〜10 attomolを含む
であろう。この標識技術の感度が1 微小球当たり約6,00
0 分子であり、そしてシグナル強度がその分析物の濃度
に比例する場合には、1 つの微粒子が1 μl中に含まれ
る分析物に結合することが可能であり、そしてその分析
物の量を測定することができる。上記の標識技術の感度
が良好な場合又はより多数の標識分子がその標識された
分析物特異的抗体( 生体アフィニティー反応体) に結合
する場合には、本検定において使用される微小球の量
を、そのサンプル容量を変更することなく増加させるこ
とができる。したがって、上記の標識技術の感度がより
低い場合には、この検定の感度は減少するであろうし、
又は単一の微粒子の表面上に要求される分析物の量はよ
り大きなサンプル容量から来なくてなならなず、しかし
ながら、このことは、その測定レンジを限定する。上記
の分析物特異的抗体又は生体アフィニティー反応体によ
り被覆された、本検定において使用される微粒子の量並
びに微粒子当たりの分析物の量は、その分析物の最小濃
度及び容量が、個々の微粒子の表面に結合するために十
分な分析物を含むように調整されるであろうし、そして
標識された特異的抗体( 標識された生体アフィニティー
反応体) による及び使用される高感度の標識技術による
個々の微粒子からの測定のために十分なものであろう。
要求される測定レンジ及びその測定の感度は、その検定
において使用される微粒子の量を調整することにより、
そして必要な場合にはサンプル容量を調整することによ
り、制御されるであろう。
も、0.01〜0.1 fmol/lであり、そしてその測定レンジ
は、典型的には、100 倍を超える、すなわち、最も低い
測定値に対する最も高い測定値の比が100 より大きい。
本検定において測定されるシグナル強度は、検定される
べき分析物の濃度に関して比例する。検定されるべき分
析物に必要な0.01 pmol/l の感度のためには、そして1,
000 倍の測定レンジを予想すれば、1 μl のサンプル容
量は、検定されるべき分析物の0.01〜10 attomolを含む
であろう。この標識技術の感度が1 微小球当たり約6,00
0 分子であり、そしてシグナル強度がその分析物の濃度
に比例する場合には、1 つの微粒子が1 μl中に含まれ
る分析物に結合することが可能であり、そしてその分析
物の量を測定することができる。上記の標識技術の感度
が良好な場合又はより多数の標識分子がその標識された
分析物特異的抗体( 生体アフィニティー反応体) に結合
する場合には、本検定において使用される微小球の量
を、そのサンプル容量を変更することなく増加させるこ
とができる。したがって、上記の標識技術の感度がより
低い場合には、この検定の感度は減少するであろうし、
又は単一の微粒子の表面上に要求される分析物の量はよ
り大きなサンプル容量から来なくてなならなず、しかし
ながら、このことは、その測定レンジを限定する。上記
の分析物特異的抗体又は生体アフィニティー反応体によ
り被覆された、本検定において使用される微粒子の量並
びに微粒子当たりの分析物の量は、その分析物の最小濃
度及び容量が、個々の微粒子の表面に結合するために十
分な分析物を含むように調整されるであろうし、そして
標識された特異的抗体( 標識された生体アフィニティー
反応体) による及び使用される高感度の標識技術による
個々の微粒子からの測定のために十分なものであろう。
要求される測定レンジ及びその測定の感度は、その検定
において使用される微粒子の量を調整することにより、
そして必要な場合にはサンプル容量を調整することによ
り、制御されるであろう。
【００１３】他の特異的生体アフィニティー検定、例え
ば、核酸ハイブリダイゼーション検定、リガンド- レク
チン検定及びリガンド- レセプタ検定を、先に記載した
ような免疫検定法に対して比較することができる。個々
の微粒子を、例えば、フロー・サイトメーター、時間-
分解(time-resolved) 顕微鏡又は時間- 分解マイクロ蛍
光計により、あるいは、時間- 分解技術( US 5,028,54
5; Seveus L et al., Cytometry 13: 329-338 (1992))
の使用に基づく他の測定装置により、検定することがで
きる。
ば、核酸ハイブリダイゼーション検定、リガンド- レク
チン検定及びリガンド- レセプタ検定を、先に記載した
ような免疫検定法に対して比較することができる。個々
の微粒子を、例えば、フロー・サイトメーター、時間-
分解(time-resolved) 顕微鏡又は時間- 分解マイクロ蛍
光計により、あるいは、時間- 分解技術( US 5,028,54
5; Seveus L et al., Cytometry 13: 329-338 (1992))
の使用に基づく他の測定装置により、検定することがで
きる。
【００１４】また、微小球を、結局は、幾つかの分析物
が同一サンプル容量において同時に検定されるところの
多変数検定において使用することができる。この多変数
検定においては、微粒子の混合物であってこの中で異な
る分析物について検定する粒子が分析物特異的生体アフ
ィニティー反応体により被覆されているものを使用す
る。測定を行うとき、分析物特異的微粒子カテゴリー
を、例えば、サイズ、蛍光時間- 分解蛍光、化学発光又
は生物発光に基づき同定する。生体アフィニティー反応
に基づく、微粒子を使用する多変数検定を、本法に従っ
て行う。幾つかの分析物が同時に検定される場合におい
ては、その検定において使用される分析物特異的微粒子
の量を、先の原理に従う分析物に従って調整する。
が同一サンプル容量において同時に検定されるところの
多変数検定において使用することができる。この多変数
検定においては、微粒子の混合物であってこの中で異な
る分析物について検定する粒子が分析物特異的生体アフ
ィニティー反応体により被覆されているものを使用す
る。測定を行うとき、分析物特異的微粒子カテゴリー
を、例えば、サイズ、蛍光時間- 分解蛍光、化学発光又
は生物発光に基づき同定する。生体アフィニティー反応
に基づく、微粒子を使用する多変数検定を、本法に従っ
て行う。幾つかの分析物が同時に検定される場合におい
ては、その検定において使用される分析物特異的微粒子
の量を、先の原理に従う分析物に従って調整する。
【００１５】
【実施例】本発明を、以下の比限定的な例により説明す
ることもできるであろう。例1 微粒子当たりの標識( 蛍光Euキレート) の定量及びモデ
ルとして非競合的hCG検定を使用した個々の微粒子から
のイムノアッセイ測定並びに時間- 分解蛍光に基づく測
定 上記のhCG(hCG=ヒト絨毛膜ゴナドトロピン(human chori
onic gonadotrophin)検定を、ビオチン化されており、
そしてストレプトアビジンにより被覆されている20μm
の微粒子に結合れているβ- サブユニットに対する特異
的モノクロナール抗体による、非競合的イムノアッセイ
として行った。この標識された生体アフィニティー反応
体をhCG のαサブユニットを特異的に認識する、蛍光Eu
キレートにより標識されたモノクロナール抗体であっ
た。このイムノアッセイを、1 段階において行った。こ
の間、抗体被覆された微粒子、hCG 換算標準(2-10,000
U/l、ここで、U/l=単位/l) 、及び標識された抗体は、
全て同時に存在する。このイムノアッセイ後、多数の微
粒子を、計数によりチェックし、そしてこのEu濃度を、
DELFIA検定溶液であって次に微粒子当たりのEu分子の量
の計算を可能にするもの、を使用することにより既知の
微粒子量から測定した。さらに、個々の微粒子を、蛍光
Euキレートにより標識されたhCG 特異的抗体の微粒子当
たりの濃度の測定を可能にする時間- 分解マイクロ蛍光
計により測定した。例として表わしたhCG 検定は、完全
には最適化されなかった。 結果: 表1 は、20μm 微粒子を使用したときの上記hCG
検定の結果を示している。これらの条件において、最も
低いhCG 濃度は、微粒子当たり約5,000 Eu分子をもたら
し、その実験内の変動は、やはり広かった。さらに、そ
の測定レンジは、少なくとも1,000 倍である。図1 は、
時間- 分解マイクロ蛍光計により個々の微粒子を測定す
ることにより作ったhCG についての換算曲線を示してい
る。
ることもできるであろう。例1 微粒子当たりの標識( 蛍光Euキレート) の定量及びモデ
ルとして非競合的hCG検定を使用した個々の微粒子から
のイムノアッセイ測定並びに時間- 分解蛍光に基づく測
定 上記のhCG(hCG=ヒト絨毛膜ゴナドトロピン(human chori
onic gonadotrophin)検定を、ビオチン化されており、
そしてストレプトアビジンにより被覆されている20μm
の微粒子に結合れているβ- サブユニットに対する特異
的モノクロナール抗体による、非競合的イムノアッセイ
として行った。この標識された生体アフィニティー反応
体をhCG のαサブユニットを特異的に認識する、蛍光Eu
キレートにより標識されたモノクロナール抗体であっ
た。このイムノアッセイを、1 段階において行った。こ
の間、抗体被覆された微粒子、hCG 換算標準(2-10,000
U/l、ここで、U/l=単位/l) 、及び標識された抗体は、
全て同時に存在する。このイムノアッセイ後、多数の微
粒子を、計数によりチェックし、そしてこのEu濃度を、
DELFIA検定溶液であって次に微粒子当たりのEu分子の量
の計算を可能にするもの、を使用することにより既知の
微粒子量から測定した。さらに、個々の微粒子を、蛍光
Euキレートにより標識されたhCG 特異的抗体の微粒子当
たりの濃度の測定を可能にする時間- 分解マイクロ蛍光
計により測定した。例として表わしたhCG 検定は、完全
には最適化されなかった。 結果: 表1 は、20μm 微粒子を使用したときの上記hCG
検定の結果を示している。これらの条件において、最も
低いhCG 濃度は、微粒子当たり約5,000 Eu分子をもたら
し、その実験内の変動は、やはり広かった。さらに、そ
の測定レンジは、少なくとも1,000 倍である。図1 は、
時間- 分解マイクロ蛍光計により個々の微粒子を測定す
ることにより作ったhCG についての換算曲線を示してい
る。
【００１６】例2 モデルとして非競合的hCG 検定を使用した検定の感度に
対する抗体( 生体アフィニティー反応体) により被覆さ
れた微粒子量の効果並びに時間- 分解蛍光に基づくマイ
クロ蛍光計による個々の微粒子の測定 hCG のイムノアッセイを、先の例に従って行った。20μ
l の全容量、3 濃度の換算標準(0、250 、及び2,500 U/
l)及び3 つの異なる量の微粒子を、本検定において使用
した、免疫応答後、個々の微粒子を、時間- 分解マイク
ロ蛍光計により測定した。 結果: 表2 及び図2 は、個々の微粒子から測定されたシ
グナル強度( 光子/ 秒/粒子）に対する微粒子の量の効
果を示しており; より少量の微粒子により、そのサンプ
ル中のhCG(分析物) が、個々の微粒子の表面上でより高
い濃度において結合されるであろうし; この検定の感度
及びその測定レンジは、必要な場合には、個々の微粒子
からの測定を可能にするように、その微粒子の量及びそ
のサンプル容量により調整されることができる。この検
定の再現性を、より多数の個々の微粒子を測定すること
により改善することができる。
対する抗体( 生体アフィニティー反応体) により被覆さ
れた微粒子量の効果並びに時間- 分解蛍光に基づくマイ
クロ蛍光計による個々の微粒子の測定 hCG のイムノアッセイを、先の例に従って行った。20μ
l の全容量、3 濃度の換算標準(0、250 、及び2,500 U/
l)及び3 つの異なる量の微粒子を、本検定において使用
した、免疫応答後、個々の微粒子を、時間- 分解マイク
ロ蛍光計により測定した。 結果: 表2 及び図2 は、個々の微粒子から測定されたシ
グナル強度( 光子/ 秒/粒子）に対する微粒子の量の効
果を示しており; より少量の微粒子により、そのサンプ
ル中のhCG(分析物) が、個々の微粒子の表面上でより高
い濃度において結合されるであろうし; この検定の感度
及びその測定レンジは、必要な場合には、個々の微粒子
からの測定を可能にするように、その微粒子の量及びそ
のサンプル容量により調整されることができる。この検
定の再現性を、より多数の個々の微粒子を測定すること
により改善することができる。
【００１７】例3 2 つの異なる濃度の標的核酸を使用した核酸ハイブリダ
イゼーション反応に対する微粒子の量の効果 直径20μm の微粒子を、ストレプトアビジンにより被覆
し、そしてハイブリダイゼーション検定において使用し
た。ここでは、この標的は、ビオチン標的した合成オリ
ゴヌクレオチドであり、そしてそのプローブは、蛍光Eu
キレートにより標識された合成オリゴヌクレオチドであ
った。このじっけんを、2 つの異なる量の標的オリゴヌ
クレオチド(10 9 及び1010分子) を使用して行った。こ
の全検定容量は、20μl であり、そして上記の蛍光Euキ
レートにより標識された2.0ng のプローブを、それぞれ
の検定において使用した。実験毎に使用した微粒子の量
は、それぞれの標的オリゴヌクレオチド濃度について10
から10,000まで変動した。このハイブリダイゼーション
反応後、このEu濃度を、時間- 分解マイクロ蛍光計によ
りこの微粒子の表面から測定した。
イゼーション反応に対する微粒子の量の効果 直径20μm の微粒子を、ストレプトアビジンにより被覆
し、そしてハイブリダイゼーション検定において使用し
た。ここでは、この標的は、ビオチン標的した合成オリ
ゴヌクレオチドであり、そしてそのプローブは、蛍光Eu
キレートにより標識された合成オリゴヌクレオチドであ
った。このじっけんを、2 つの異なる量の標的オリゴヌ
クレオチド(10 9 及び1010分子) を使用して行った。こ
の全検定容量は、20μl であり、そして上記の蛍光Euキ
レートにより標識された2.0ng のプローブを、それぞれ
の検定において使用した。実験毎に使用した微粒子の量
は、それぞれの標的オリゴヌクレオチド濃度について10
から10,000まで変動した。このハイブリダイゼーション
反応後、このEu濃度を、時間- 分解マイクロ蛍光計によ
りこの微粒子の表面から測定した。
【００１８】結果: 表3 及び図3 は、個々の微粒子から
測定されたシグナル強度に対する微粒子の量の効果を示
しており; より少量の微粒子により、そのサンプル中の
標的オリゴヌクレオチドの量は、個々の微粒子の表面上
により高い濃度において結合するであろう; 再び、この
検定の感度及びその測定レンジは、必要な場合には、個
々の微粒子からの測定を可能にするように、その微粒子
の量及びそのサンプル容量により調整されることができ
る。本分野における熟練者は、本発明の様々な応用が本
請求の範囲の範囲内で変動することができることを理解
するであろう。本発明の方法を、様々な態様の形態に取
り込むことができ、その中のほんの少しを本明細書中に
開示したということが理解されるであろう。他の態様が
存在し、そして本発明の核心から外れないということは
当業者には明らかであろう。従って、ここに記載した態
様な説明的であり、且つ限定的なものとして解釈される
べきではない。
測定されたシグナル強度に対する微粒子の量の効果を示
しており; より少量の微粒子により、そのサンプル中の
標的オリゴヌクレオチドの量は、個々の微粒子の表面上
により高い濃度において結合するであろう; 再び、この
検定の感度及びその測定レンジは、必要な場合には、個
々の微粒子からの測定を可能にするように、その微粒子
の量及びそのサンプル容量により調整されることができ
る。本分野における熟練者は、本発明の様々な応用が本
請求の範囲の範囲内で変動することができることを理解
するであろう。本発明の方法を、様々な態様の形態に取
り込むことができ、その中のほんの少しを本明細書中に
開示したということが理解されるであろう。他の態様が
存在し、そして本発明の核心から外れないということは
当業者には明らかであろう。従って、ここに記載した態
様な説明的であり、且つ限定的なものとして解釈される
べきではない。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
【表３】
【図１】時間分解マイクロ蛍光計測計により、個々の微
粒子を測定することにより作られた、hCG についての換
算曲線を示す。
粒子を測定することにより作られた、hCG についての換
算曲線を示す。
【図２】異なる量の微粒子についての、シグナル強度(
個々の微粒子から測定されたもの) と、分析物濃度との
関係を示す。
個々の微粒子から測定されたもの) と、分析物濃度との
関係を示す。
【図３】反応中に存在する2 つの異なる量の分析物DNA
についての、シグナル強度( 個々の微粒子から測定され
たもの) と検定当当りの微粒子の量との関係を示す。黒
四角により示された曲線は、反応当たり109 分子を表
し、そして白四角により示された曲線は、反応当たり10
10分子を表している。
についての、シグナル強度( 個々の微粒子から測定され
たもの) と検定当当りの微粒子の量との関係を示す。黒
四角により示された曲線は、反応当たり109 分子を表
し、そして白四角により示された曲線は、反応当たり10
10分子を表している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キム スベルカー イマニュエル ペッタ ーソン フィンランド国，エフイーエン−20810 ツルク，ティイレンテキイェンカツ 14 イー 20
Claims (12)
- 【請求項１】 生体特異的検定法であって、 - 検定されるべき分析物を結合している生体アフィニテ
ィー反応体A で被覆されている微粒子; 分析されるべき
サンプル、及び標識された生体アフィニティー反応体B
を、混合し、これにより、この生体アフィニティー反応
体A 、この生体アフィニティー反応体B 及びこの分析物
の間の結合反応を開始させ、 - 上記微粒子に結合した標識された生体アフィニティー
反応体B からのシグナル強度を、上記サンプル中の分析
物の濃度の測定のために定量する、ことを含んで成り、 - そのサンプルの分析物がある量の微粒子に結合した
後、それぞれの個々の微粒子が、典型的な分析物濃度の
全範囲にわたり、そのサンプルのその分析物濃度の測定
を可能にするようなシグナル強度を放射する、ような量
のサンプル及び微粒子の検定における使用、及び、 - それぞれの微粒子からのシグナル強度の分割測定、を
特徴とする検定法。 - 【請求項２】 前記の使用された高感度標識技術によ
り、個々の微粒子からのサンプル中の最も低い分析物濃
度の測定を可能にするように、微粒子の量を調整するこ
とを特徴とする、請求項１に記載の検定法。 - 【請求項３】 前記の使用された高感度標識技術によ
り、個々の微粒子からのサンプル中の最も高い分析物濃
度の測定を可能にするように、微粒子の量を調整するこ
とを特徴とする、請求項１に記載の検定法。 - 【請求項４】 非競合的検定及び競合的検定において、
増加するサンプル容量を使用することを特徴とする、請
求項２に記載の検定法。 - 【請求項５】 非競合的検定及び競合的検定において、
減少するサンプル容量を使用することを特徴とする、請
求項３に記載の検定法。 - 【請求項６】 前記の標識された生体アフィニティー反
応体B が前記分析物の抗原に対して向けられた抗体であ
る非競合的免疫検定であることを特徴とする、請求項１
に記載の検定法。 - 【請求項７】 前記の標識された生体アフィニティー反
応体B が核酸プローブである核酸ハイブリダイゼーショ
ン検定であることを特徴とする、請求項１に記載の検定
法。 - 【請求項８】 前記の標識された生体アフィニティー反
応体B が抗原であり、そして前記の生体アフィニティー
反応体A が抗体であり、その結合部位について、その標
識抗原と前記分析物の抗原とが競合する、競合的免疫検
定であることを特徴とする、請求項１に記載の検定法。 - 【請求項９】 前記の使用された標識技術により個々の
微粒子を測定するとき、最も低い分析物濃度が最も強い
シグナルをもたらすように、前記抗体A で被覆された微
粒子の量を制御することを特徴とする、請求項８に記載
の検定法。 - 【請求項１０】 蛍光、時間分解蛍光、化学発光又は生
物発光を放射する標識を使用することを特徴とする、請
求項１に記載の検定法。 - 【請求項１１】 前記の使用された微粒子が、異なる分
析物を認識する微粒子の混合物であり、これにより、同
一サンプル中のいくつかの分析物の同時検定を可能にす
ることを特徴とする、請求項１に記載の検定法。 - 【請求項１２】 蛍光、時間分解蛍光、化学発光若しく
は生物発光又はそれらの組み合わせの使用により、異な
る分析物を認識する微粒子を同定することを特徴とす
る、請求項１１に記載の検定法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI931151A FI96143C (fi) | 1993-03-16 | 1993-03-16 | Biospesifinen määritysmenetelmä |
| FI931151 | 1993-03-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06317592A true JPH06317592A (ja) | 1994-11-15 |
Family
ID=8537555
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6042782A Pending JPH06317592A (ja) | 1993-03-16 | 1994-03-14 | 生体特異的検定法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7192786B1 (ja) |
| EP (1) | EP0617287A3 (ja) |
| JP (1) | JPH06317592A (ja) |
| FI (1) | FI96143C (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019522223A (ja) * | 2016-07-14 | 2019-08-08 | カイヴォゲン オサケ ユキチュア | レクチンベースの癌の診断 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE0003662D0 (sv) * | 2000-10-11 | 2000-10-11 | Pharmacia Diagnostics Ab | Assay method and kit therefor |
| US6777198B2 (en) | 2000-10-11 | 2004-08-17 | Pharmacia Diagnostics Ab | Assay method and kit therefor |
| CA2934220C (en) * | 2007-10-02 | 2019-11-05 | Theranos, Inc. | Modular point-of-care devices and uses thereof |
| FR2943418A1 (fr) * | 2009-03-17 | 2010-09-24 | Centre Nat Rech Scient | Procedes de mesure de la quantite intracellulaire de molecules d'interet intrinsequement fluorescentes par cytometrie en flux et leurs applications |
| US10422806B1 (en) | 2013-07-25 | 2019-09-24 | Theranos Ip Company, Llc | Methods for improving assays of biological samples |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4408877A (en) * | 1979-04-10 | 1983-10-11 | Ernst Leitz Wetzlar Gmbh | Device for hydrodynamic focussing of a particle-suspension in a liquid flow cytophotometer |
| SE454781B (sv) * | 1986-10-17 | 1988-05-30 | Wallac Oy | Hybridiseringsforfarande for detektion av polynukleotidsekvens |
| SE458968B (sv) | 1987-06-16 | 1989-05-22 | Wallac Oy | Biospecifikt analysfoerfarande foer flera analyter i vilket ingaar partikelraekning och maerkning med fluorescerande maerksubstanser |
| US5028535A (en) * | 1989-01-10 | 1991-07-02 | Biosite Diagnostics, Inc. | Threshold ligand-receptor assay |
| AU9146491A (en) * | 1990-12-28 | 1992-08-17 | Abbott Laboratories | Simultaneous determination of multiple analytes using a time-resolved heterogeneous chemiluminescence assay |
| EP0608370B1 (en) * | 1991-10-15 | 1998-01-07 | Multilyte Limited | Binding assay employing labelled reagent |
-
1993
- 1993-03-16 FI FI931151A patent/FI96143C/fi active
-
1994
- 1994-02-16 EP EP94850025A patent/EP0617287A3/en not_active Ceased
- 1994-03-14 JP JP6042782A patent/JPH06317592A/ja active Pending
-
1995
- 1995-06-07 US US08/487,623 patent/US7192786B1/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019522223A (ja) * | 2016-07-14 | 2019-08-08 | カイヴォゲン オサケ ユキチュア | レクチンベースの癌の診断 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7192786B1 (en) | 2007-03-20 |
| FI96143B (fi) | 1996-01-31 |
| EP0617287A2 (en) | 1994-09-28 |
| FI96143C (fi) | 1996-05-10 |
| EP0617287A3 (en) | 1995-07-26 |
| FI931151A0 (fi) | 1993-03-16 |
| FI931151A (fi) | 1994-09-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0736178B1 (en) | Method of assay | |
| JP2742953B2 (ja) | 分析方法 | |
| US9383354B2 (en) | Anti-antibody reagent | |
| AU670489B2 (en) | Light scatter-based immunoassay without particle self aggregation | |
| JP3384805B2 (ja) | 粒子の２つの判別可能な型を用いた検定方法 | |
| US6551788B1 (en) | Particle-based ligand assay with extended dynamic range | |
| EP0928420A1 (en) | Homogeneous binding assay | |
| WO1998033070A9 (en) | Homogeneous binding assay | |
| JPH03503081A (ja) | 数種の被検物質の環境内濃度の定量 | |
| EP2639584A1 (en) | Real time diagnostic assays using an evanescence biosensor | |
| CN114324901B (zh) | 一种扩展定量检测范围的试剂盒及检测方法 | |
| JP2005510706A5 (ja) | ||
| JPH06317592A (ja) | 生体特異的検定法 | |
| Parpia et al. | Empirically optimized flow cytometric immunoassay validates ambient analyte theory | |
| US20220308050A1 (en) | Systems for improving the dynamic range of biological assays | |
| Lim et al. | Immunological Detection Methods for Biomarkers | |
| CA2179826C (en) | Method of assay | |
| Tonkinson et al. | Transitioning of ELISA assay to a quantitative microspot format |