CN117723750B - 基于链霉亲和素-生物素反应的动态光散射免疫检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫学检测技术领域，具体涉及一种基于链霉亲和素‑生物素反应的动态光散射免疫检测方法。该方法包括以识别元件标记的免疫磁珠为动态光散射捕获探针；以链霉亲和素标记的检测抗体或小分子竞争抗原为传感器检测探针；以生物素标记的纳米材料、聚合物以及蛋白质为交联剂；通过链霉亲和素‑生物素反应引发捕获了待测物的免疫磁珠复合物发生交联反应，进而使免疫磁珠平均水化动力学粒径发生变化，通过监控免疫磁珠水化动力学粒径变化实现待测物的检测。本发明的方法操作步骤简单，在短时间内可实现超灵敏检测，且制备的免疫磁珠可将目标物从复杂的样本基质汇总分离富集出来，有效消除了样本基质对后续检测的干扰。
Description
技术领域
本发明属于免疫学检测技术领域，具体涉及一种基于链霉亲和素-生物素反应的动态光散射免疫检测方法。
背景技术
免疫学快速筛查方法因其特异性强、操作简单、检测成本低等优势，近年来得到了大量的推广和应用。例如，传统酶联免疫吸附法（ELISA）因其高通量、良好的鲁棒性以及易于商品化的特点，已成为应用最为广泛的生物检测分析技术之一。然而，传统ELISA方法显色底物摩尔消光系数较低，造成检测灵敏度相对较低，当待测样本中目标物含量较低时易出现假阳性结果，从而无法满足实际应用的要求。
高灵敏检测信号（如等离子共振、荧光信号、光热信号、动态光散射信号、电化学信号等）常被用于提升免疫学方法的灵敏度。其中，动态光散射（Dynamic light scattering,DLS）信号因其高效快速、灵敏度高、能够实现均相检测等特点引起了广泛的关注。传统DLS免疫学检测方法通过将抗体标记在金纳米粒子表面，利用抗原抗体的免疫学反应引发金聚集实现检测。然而，由于抗原抗体反应亲和力弱（非共价键），探针的聚集反应效率偏低，该类型DLS检测灵敏度仅略高于ELISA方法2-10倍。此外，由于样本基质对免疫学的干扰，削弱了传统DLS免疫学传感器的检测性能，传统DLS免疫学传感器在实际应用中并不能实现超灵敏检测需求。因此，开发一种聚集反应效率高、抗基质干扰能力强的超灵敏DLS免疫学传感器具有重要意义。例如，现有专利公开号为CN113687063A中以苯硼酸-糖基顺式二醇反应构建交联反应高效聚集动态光散射探针可实现对于糖蛋白的超灵敏检测，灵敏度相较于传统ELISA方法可提升3个数量级，然而免疫学检测中存在大量非糖蛋白类目标物，包括早期疾病诊断中生物标志物，食品安全检测中的农兽药、非法添加物及真菌毒素等均不含有糖基顺式二醇结构。现有专利公开号为CN113687063A中的方法在实际应用中并不适用于所有免疫学检测对象。此外，现有专利公开号为CN113697063A中提到的苯硼酸交联剂在使用过程中，存在苯硼酸易氧化、化学制备工艺复杂等问题，在产业应用中存在一定缺陷。如何实现高亲和力反应与免疫学反应高效整合，开发实际应用价值大、普适性强的动态光散射免疫学检测方法具有突出的技术难度。
链霉亲和素-生物素反应体系是目前已知亲和力最高的非共价反应之一，其亲和常数高达10-15mol/L，是抗原-抗体相互作用的103-106倍。链霉亲和素-生物素反应具有高亲和力、高特异性、易于修饰的优点，其在免疫学检测中得到广泛的应用。然而单个链霉亲和素仅可与4个生物素分子结合，利用链霉亲和素作为交联剂无法有效地构建交联体系用于动态光散射免疫学检测中。如何将链霉亲和素-生物素反应构建交联体系，将其超高亲和力转化为对动态光散射免疫学检测灵敏度的提升，具有突出的技术难度。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种基于链霉亲和素-生物素反应的动态光散射免疫检测方法，具体采用以下的技术方案：
一种基于链霉亲和素-生物素反应的动态光散射免疫检测方法，所述动态光散射免疫检测方法包括：
以识别元件标记的免疫磁珠为动态光散射捕获探针；
以链霉亲和素标记的检测抗体或小分子竞争抗原为传感器检测探针；
以生物素标记的纳米材料、聚合物或及蛋白质为交联剂；
通过链霉亲和素-生物素反应引发捕获了待测物的免疫磁珠复合物发生交联反应，进而使免疫磁珠平均水化动力学粒径发生变化，通过监控免疫磁珠水化动力学粒径变化实现待测物的检测；
其中，以生物素标记的纳米材料为交联剂时，交联剂中生物素的标记量与纳米材料的摩尔比大于100：1小于1000：1；
以生物素标记的聚合物为交联剂时，交联剂中生物素的标记量与聚合物的摩尔比不少于1000：1；
以生物素标记的蛋白质为交联剂时，交联剂中生物素的标记量与蛋白质的摩尔比不少于40：1。
上述方法中，以生物素标记的纳米材料为交联剂时，交联剂中生物素的标记量与纳米材料的摩尔比大于100：1小于1000：1，过低的标记量会导致交联前后粒径变化不明显，过高的标记量会破坏纳米材料的胶体稳定性，引起材料沉降，不利于交联反应；
以生物素标记的聚合物为交联剂时，交联剂中生物素的标记量与聚合物的摩尔比不少于1000：1，生物素修饰聚合物因标记前后不会对聚合物性质产生变化，因此可采用高标记量的方式构建交联剂。
以生物素标记的蛋白质为交联剂，交联剂中生物素的标记量与蛋白质的摩尔比不少于40：1，避免过低的标记量会导致交联前后粒径变化不明显。
上述的动态光散射免疫检测方法，包括以下步骤：
S1：将特异性免疫识别元件标记在磁性载体表面，得到磁性探针；
S2：通过化学共价修饰的方法将小分子竞争抗原标记至链霉亲和素上获得检测抗原，或将链霉亲和素标记至抗体上获得检测抗体；
S3：采用化学共价修饰的方法将生物素标记在纳米材料、聚合物或蛋白质上，得到多价交联剂；
S4：将磁性探针和检测抗原或检测抗体加入到待测目标物溶液中，在37℃条件下，反应，磁吸，洗涤，然后加入多价交联剂，继续反应，反应结束后，得到反应待测样品，最后通过马尔文纳米粒度仪测定溶液的平均水化动力学粒径，利用水化动力学粒径变化测定反应待检样品中目标物的含量。
作为进一步优选的实施方式，上述特异性免疫识别元件为单克隆抗体或者适配体。
作为进一步优选的实施方式，上述磁性载体为表面为羧基或氨基的磁性纳米材料。该磁性载体的粒径为70 nm-500 nm。粒径过小磁回收性能弱，粒径过大易发生沉降不利于交联反应。
作为进一步优选的实施方式，上述化学共价修饰的方法为活泼酯法、戊二醛法、苯硼酸法中的任意一种。
作为进一步优选的实施方式，上述纳米材料、聚合物或蛋白质为胶体金、聚苯乙烯微球、聚乙二醇、二氧化硅微球、牛血清白蛋白中的任意一种。
作为进一步优选的实施方式，上述步骤S4的具体过程如下：
若待测目标物为小分子时：将目标待测溶液中加入磁性探针和检测探针，在温度为37℃的条件下反应5 min-20 min，反应结束后加入pH为7.5的磷酸缓冲液磁吸洗涤2-3次后，再加入多价交联剂，反应5 min-20 min，最后测定平均水化动力学粒径确定目标物的含量；
若待测目标物为大分子时：将目标待测溶液加入磁性探针，在温度为37℃的条件下反应5 min-20 min后，用pH为7.5的磷酸缓冲液磁吸洗涤2-3次后加入检测探针，继续反应，反应结束后，用pH为7.5的磷酸缓冲液磁吸洗涤，再加入多价交联剂反应5 min-20 min，最后测定平均水化动力学粒径确定目标物的含量。其中，上述磷酸缓冲液的浓度为0.01mol/L。
本发明提供的动态光散射免疫检测方法能够应用在对非糖蛋白类物质检测中的应用，该非糖蛋白类物质为p24抗原、金黄色葡萄球菌肠毒素A或赭曲霉毒素A。
本发明的有益效果为：本发明首次公开了一种基于链霉亲和素-生物素反应的动态光散射免疫传感检测新方法，该方法使用免疫识别元件标记的磁性载体作为免疫探针，以链霉亲和素标记的检测抗体或小分子竞争抗原为传感器检测探针，以商业化长链生物素修饰的纳米材料或聚合物为交联剂，有效地突破传统链霉亲和素-生物素信号放大效果有限（单个链霉亲和素仅能结合四个生物素），无法构建动态光散射交联体系的瓶颈。通过链霉亲和素-生物素交联体系超强的反应亲和力以及极高的反应效率实现对目标物的快速超灵敏检测。此外，本发明的方法与传统方法相比，操作步骤简单，在短时间内可实现超灵敏检测，且所制备的免疫磁珠可将目标物从复杂的样本基质汇总分离富集出来，有效消除了样本基质对后续检测的干扰。此外，本发明与现有专利CN113687063A相比可实现对于非糖蛋白类目标物（例如p24抗原、赭曲霉毒素A等）的检测，可覆盖近乎全部免疫学检测目标物；并且通过商业化长链生物素可实现大批量制备多价交联剂，避免复杂化学工艺修饰，批次差异小，具有突出的实际应用前景。
附图说明
图1所示为本发明的原理图；
图2所示为基于牛血清白蛋白多价交联剂中生物素标记量的优化实验图；
图3所示为基于二氧化硅微球多价交联剂中生物素标记量的优化实验图；
图4所示为基于氨基PEG5000多价交联剂中生物素标记量的优化实验图；
图5所示为赭曲霉毒素A基于磁珠的动态光散射均相免疫分析的标准曲线；
图6所示为p24抗原基于磁珠的动态光散射均相免疫分析的标准曲线。
具体实施方式
为了便于理解本申请，下面将参照相关附图对本申请进行更全面的描述。附图中给出了本申请的若干个实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“及／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在本文中，除非另有说明，用语“％”是指“质量％”；用语“μg/mL”是指：微克每毫升。在本文中，除非另有说明，本文用语“％”均是指基于本申请组合物的总重量而言的。
在本文中，限定的所有范围是指：包括给定范围内的每个特定范围以及给定范围之间的子范围的组合。例如，1～5的范围具体包括1、2、3、4和5，也包括如2～5、3～5、2～3、2～4、1～4等子范围。
实施例1
一种基于链霉亲和素-生物素反应的动态光散射免疫检测方法，其原理见图1所示，其动态光散射免疫检测方法包括：
以识别元件标记的免疫磁珠为动态光散射捕获探针；
以链霉亲和素标记的检测抗体或小分子竞争抗原为传感器检测探针；
以生物素修饰的纳米材料、聚合物以及蛋白质为交联剂；
通过链霉亲和素-生物素反应引发捕获了待测物的免疫磁珠复合物发生交联反应，进而使免疫磁珠平均水化动力学粒径发生变化，通过监控免疫磁珠水化动力学粒径变化实现待测物的检测；
其中，以生物素标记的纳米材料为交联剂时，交联剂中生物素的标记量与纳米材料的摩尔比大于100：1小于1000：1；
以生物素标记的聚合物为交联剂时，交联剂中生物素的标记量与聚合物的摩尔比不少于1000：1；
以生物素标记的蛋白质为交联剂，交联剂中生物素的标记量与蛋白质的摩尔比不少于40：1。
其动态光散射免疫检测方法具体包括以下步骤：
S1：将特异性免疫识别元件标记在磁性载体表面，得到磁性探针；
S2：通过化学共价修饰的方法将小分子竞争抗原标记至链霉亲和素上获得检测抗原，或将链霉亲和素标记至抗体上获得检测抗体；
S3：采用化学共价修饰的方法将生物素标记在纳米材料、聚合物或蛋白质上，得到多价交联剂；
S4：将磁性探针和检测探针加入到待测目标物溶液中，在37℃条件下，反应，磁吸，洗涤，然后加入多价交联剂，继续反应，反应结束后，得到反应待测样品，最后通过马尔文纳米粒度仪测定溶液的平均水化动力学粒径，利用水化动力学粒径变化测定反应待检样品中目标物的含量。
实施例2
基于链霉亲和素-生物素反应的动态光散射免疫传感检测方法交联剂中生物素标记量的优化实验
1 免疫磁珠的制备
取商业化羧基表面180 nm磁珠100 μg加入到500 μL的pH 6.0 磷酸缓冲液（PB缓冲液）中，随后加入5 μg 抗赭曲霉毒素A（OTA）单克隆抗体，于室温下搅拌反应30 min后，加入0.5 μg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）反应30 min，重复3次，随后加入质量体积分数为1%的牛血清白蛋白进行封闭，室温搅拌1 h后，磁吸5 min后弃上清，PB 7.5缓冲液冲洗三遍后，重悬于PB 7.5缓冲液中，于4℃保存。
2 赭曲霉毒素A检测探针的制备
称取1 mg OTA溶解于2 mL无水四氢呋喃中，按照摩尔比OTA：NHS：EDC = 1：2：4的比例分别加入N-羟基琥珀亚酰胺（NHS）和EDC，于室温下避光震荡反应4 h。活化后的产物12000 rpm/min离心10 min去除沉淀，挥发THF，残留物溶解于0.2 mL的二甲基甲酰胺中，得到OTA活化产物；
称取1 mg 链霉亲和素溶解于1 mL PB缓冲液（0.01 M，pH 8.6）中，随后分别按照生物素比链霉亲和素摩尔比5：1、10：1和20：1加入OTA活化产物，室温震荡反应4 h后，PBS7.5 缓冲液（0.01 M）透析三天，得到含有不同标记量的OTA检测探针。
3 多价交联剂的制备
3.1 基于蛋白质（牛血清白蛋白）的多价交联剂的制备
取1 mg牛血清白蛋白溶解于0.5 mL PB 缓冲液（0.01 M，pH 7.0）中，随后分别按照生物素比牛血清白蛋白摩尔比10：1、20：1、30：1、40：1、50：1加入商业化长链生物素活泼酯，室温避光剧烈振荡4 h，反应产物在pH 7.5 0.01 mol L-1的 磷酸盐缓冲液（PBS 缓冲液）中透析三天，得到基于牛血清白蛋白的多价交联剂，-20 ℃保存备用。
3.2 基于纳米材料（二氧化硅微球）的多价交联剂的制备
取商业化氨基表面150 nm二氧化硅微球100 ug加入到0.5 mL PB 缓冲液（0.01M，pH 7.0）中，随后分别按照生物素比二氧化硅微球摩尔比20:1、100:1、500:1、1000:1、1500:1加入商业化长链生物素活泼酯，室温避光剧烈振荡2 h，加入质量体积分数为1%的牛血清白蛋白进行封闭1 h后，15000 rpm离心20 min，用PB 7.5缓冲液洗涤三遍后，重悬于500 μL PB 7.5缓冲液中。
3.3 基于聚合物（氨基PEG5000）的多价交联剂的制备
取商业化氨基PEG5000 1 mg加入到0.5 mL PB 缓冲液（0.01 M，pH 7.0）中，随后分别按照生物素比氨基PEG5000摩尔比600:1、800:1、1000:1、1200:1加入商业化长链生物素活泼酯，室温避光剧烈振荡4 h，反应产物在PBS 缓冲液（0.01 M，pH 7.5）中透析三天，得到基于氨基PEG5000的多价交联剂，-20 ℃保存备用。
4 基于不同标记量多价交联剂的交联粒径比较
在OTA阴性样本溶液中加入5 μg免疫磁珠和0.2 μg OTA检测探针，37℃反应20min后，用PB 7.5磁吸洗涤2次后，加入5 μg不同多价分子交联剂后于马尔文纳米粒度仪上测定反应40 min内溶液的平均水化动力学粒径变化。
5 数据分析
图2所示为基于牛血清白蛋白多价交联剂中生物素标记量的优化实验图；由图2可知，在加入基于牛血清白蛋白的多价交联剂后，生物素标记比例40:1与50:1的多价交联剂反应15 min后粒径维持稳定，且粒径变化相近，而标记比例小于40:1的多价交联剂交联效率较低，粒径变化偏小，因此以生物素修饰的蛋白质为交联剂，生物素标记蛋白质摩尔比不少于40：1。
图3所示为基于二氧化硅微球多价交联剂中生物素标记量的优化实验图；由图3可知，在加入基于二氧化硅微球的多价交联剂后，生物素标记比例100:1、500:1与1000:1的多价交联剂反应15 min后粒径维持稳定，且粒径变化相近，而标记比例小于100:1以及大于1000:1的多价交联剂交联效率较低，粒径变化偏小，因此以生物素修饰的纳米材料为交联剂，生物素标记纳米材料摩尔比大于100：1小于1000：1。
图4所示为基于氨基PEG5000多价交联剂中生物素标记量的优化实验图；由图4可知，在加入基于氨基PEG5000的多价交联剂后，生物素标记比例1000:1与1200:1的多价交联剂反应15 min后粒径维持稳定，且粒径变化相近，而标记比例小于1000:1的多价交联剂交联效率较低，粒径变化偏小，因此以生物素修饰的聚合物为交联剂，生物素标记聚合物摩尔比不少于1000：1。
实施例3
基于链霉亲和素-生物素反应的动态光散射免疫传感检测方法用于玉米中OTA的含量的检测实验
1 免疫磁珠的制备
如实施例2所述。
2 赭曲霉毒素A检测探针的制备
如实施例2所述。
3 基于牛血清白蛋白的多价交联剂的制备
取1 mg牛血清白蛋白溶解于0.5 mL PB 缓冲液（0.01 M，pH 7.0）中，随后按摩尔比40：1加入商业化长链生物素活泼酯，室温避光剧烈振荡4 h，反应产物在PBS 缓冲液（0.01 M，pH 7.5）中透析三天，得到基于牛血清白蛋白的多价交联剂，-20 ℃保存备用。
4 玉米中OTA的含量的检测
4.1 样本前处理
取5.0 g玉米样本，在涡旋振荡下，用25 mL甲醇/水溶液（80%:20%， v/v）提取玉米样本基质20 min后，以10000 rpm转速离心5 min，去除沉淀，将上清液稀释20倍后于4℃下储存。
4.2 用本发明检测方法进行OTA含量的测定
在待测OTA加标玉米样本溶液中加入5 μg免疫磁珠和0.2 μg OTA检测探针，37℃反应20 min后，用PB 7.5磁吸洗涤2次后，加入5 μg多价分子交联剂反应15 min后于马尔文纳米粒度仪上测定溶液的平均水化动力学粒径，利用水化动力学粒径变化测定反应待检样品中小分子化合物的含量。
4.3 分析结果
取上述制备的13个不同浓度的标准品400 pg/mL、200 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、25 pg/mL、12.5 pg/mL、6.25 pg/mL、3.13 pg/mL、1.56 pg/mL、0.78 pg/mL、0.39 pg/mL、0.2 pg/mL和0，在马尔文纳米粒度仪上测定溶液对应的平均水化动力学粒径；
竞争抑制率的计算，标准品或样本的竞争抑制率等于第一个标准（0标准）的平均水化动力学粒径减去标准品或样本的平均水化动力学粒径，再除于第一个标准（0标准），即竞争抑制率（%）=（B0-B）/B0*100%，其中B0为第一个标准（0标准）的平均水化动力学粒径，B为标准品或样本的平均水化动力学粒径。
以竞争抑制率与OTA标准品浓度的对数值绘制竞争抑制曲线。求出直线方程。标准曲线为，y=11.83*ln(x)+38.80，见图5；该方法学的最低检测限被定义为竞争抑制率为10%时所需的抗原浓度。通过该标准曲线计算得最低检测限为0.09 pg/mL。当进行实际样本检测时，将样本的平均水化粒径值计算得到竞争抑制率，代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应的样本浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中OTA的实际浓度。例如，测量样本平均水化粒径变化值为52.7 nm，阴性样本平均水化粒径变化值为136.2 nm，计算得抑制率为61.3%，代入标准曲线中，计算得样本浓度为6.69 pg/mL，乘以初始稀释倍数10倍，得样本中OTA实际浓度为66.9 pg/mL。
实施例4
基于链霉亲和素-生物素反应的动态光散射免疫传感检测方法用于血清中p24抗原含量的检测
1 免疫磁珠的制备
取商业化羧基表面180 nm磁珠100 μg加入到500 μL的pH 6.0 PB缓冲液中，随后加入5 μg 抗p24单克隆抗体，于室温下搅拌反应30 min后，加入0.5 μg EDC反应30 min，重复3次，随后加入质量体积分数为1%的牛血清白蛋白进行封闭，室温搅拌1 h后，磁吸5 min后弃上清，PB 7.5缓冲液冲洗三遍后，重悬于PB 7.5缓冲液中，于4℃保存。
2 p24抗原检测探针的制备
取 0.5 mg 3-羧基苯硼酸（PBA）溶解于50 μL 四氢呋喃中，加入 1 mg NHS 和1.5mg EDC，室温避光反应 24 h，10000 rpm 离心 15 min，弃沉淀，氮气吹干上清，残留物溶于200 μL 二甲基亚砜中，得到活化产物。将上述活化产物缓慢滴加于1 mL 链霉亲和素溶液(1 mg mL-1，pH 8.6)中，室温避光剧烈振荡4 h，反应产物在PBS 缓冲液（0.01 M，pH 7.5）中透析三天，得到链霉亲和素-苯硼酸（SA-PBA），-20 ℃保存备用。
取 0.2 mg 抗体加入 100 μL PB 缓冲液（0.01 M，pH 7.0）中，向其中搅拌滴加0.5 mg SA-PBA。室温搅拌反应 1 h，反应产物在PBS 缓冲液（0.01 M，pH 7.5）中透析三天，得到p24检测探针，-20 ℃保存备用。
3 基于二氧化硅微球的多价交联剂的制备
取商业化氨基表面150 nm二氧化硅微球100 ug加入到0.5 mL PB 缓冲液（0.01M，pH 7.0）中，随后按摩尔比200:1加入商业化长链生物素活泼酯，室温避光剧烈振荡2 h，加入质量体积分数为1%的牛血清白蛋白进行封闭1 h后，15000 rpm离心20 min，用PB 7.5缓冲液洗涤三遍后，重悬于500 μL PB 7.5缓冲液中。
4 血清中p24抗原含量的检测
4.1 样本前处理
将在医院通过化学发光定量好的p24抗原阳性样本用PBS 7.5缓冲液（0.01 M）稀释，浓度按照所需的实际检测限确定，稀释后的p24抗原于4℃下储存。
4.2 用本发明检测方法进行p24抗原含量的测定
在0.1 mL待测p24抗原样本中加入5 μg免疫磁珠，37℃反应20 min，用PB 7.5磁吸洗涤2次后，加入0.1 μg p24抗原检测探针，37℃反应15 min，用PB 7.5磁吸洗涤2次后，加入3 μg多价交联剂反应15 min后于马尔文纳米粒度仪上测定溶液的平均水化动力学粒径，利用水化动力学粒径变化测定血清样本中p24抗原的含量。
4.3 分析结果
取上述制备的13个不同浓度的标准品500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5pg/mL、31.3 pg/mL、15.6 pg/mL、7.8 pg/mL、3.9 pg/mL、1.95 pg/mL、0.98 pg/mL、0.49pg/mL、0.24 pg/mL和0，在马尔文纳米粒度仪上测定溶液对应的平均水化动力学粒径；
以平均水化动力学粒径与p24抗原标准品浓度的对数值绘制竞争抑制曲线。求出直线方程。标准曲线为，y=31.26ln(x)+223.38，见图6。该方法学的最低检测限被定义20个第一个标准（0标准时溶液的平均水化粒径）时平均水化粒径加3倍标准偏差（3倍的第一个标准样品三个平行样品的标准偏差），所需的抗原浓度，通过该标准曲线计算得最低检测限为0.37 pg/mL。当进行实际样本检测时，将样本的平均水化粒径值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应的样本浓度。例如，上述HIV病患血清中p24抗原含量的检测中，测量样本平均水化粒径为272.1 nm，代入标准曲线中，计算得样本浓度为4.75 pg/mL，乘以初始稀释倍数20倍，得样本中p24抗原实际浓度为95.04 pg/mL。
尽管本发明的描述已经相当详尽且特别对几个所述实施例进行了描述，但其并非旨在局限于任何这些细节或实施例或任何特殊实施例，而是应当将其视作是通过参考所附权利要求考虑到现有技术为这些权利要求提供广义的可能性解释，从而有效地涵盖本发明的预定范围。此外，上文以发明人可预见的实施例对本发明进行描述，其目的是为了提供有用的描述，而那些目前尚未预见的对本发明的非实质性改动仍可代表本发明的等效改动。
Claims (9)
1.一种基于链霉亲和素-生物素反应的动态光散射免疫检测方法，其特征在于，所述动态光散射免疫检测方法包括：
以识别元件标记的免疫磁珠为动态光散射捕获探针；
以链霉亲和素标记的检测抗体或小分子竞争抗原为传感器检测探针；
以生物素标记的纳米材料为交联剂；
通过链霉亲和素-生物素反应引发捕获了待测物的免疫磁珠复合物发生交联反应，进而使免疫磁珠平均水化动力学粒径发生变化，通过监控免疫磁珠水化动力学粒径变化实现待测物的检测；
其中，交联剂中生物素的标记量与纳米材料的摩尔比大于100：1小于1000：1；纳米材料为150nm二氧化硅微球。
2.根据权利要求1所述的动态光散射免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将特异性免疫识别元件标记在磁性载体表面，得到磁性探针；
S2：通过化学共价修饰的方法将小分子竞争抗原标记至链霉亲和素上获得检测抗原，或将链霉亲和素标记至抗体上获得检测抗体；
S3：采用化学共价修饰的方法将生物素标记在纳米材料上，得到多价交联剂；
S4：将磁性探针和检测抗原或检测抗体加入到待测目标物溶液中，在37℃条件下，反应，磁吸，洗涤，然后加入多价交联剂，继续反应，反应结束后，得到反应待测样品，最后通过马尔文纳米粒度仪测定溶液的平均水化动力学粒径，利用水化动力学粒径变化测定反应待检样品中目标物的含量。
3.根据权利要求2所述的动态光散射免疫检测方法，其特征在于，所述特异性免疫识别元件为单克隆抗体或适配体。
4.根据权利要求2所述的动态光散射免疫检测方法，其特征在于，所述磁性载体为表面为羧基或氨基的磁性纳米材料。
5.根据权利要求2所述的动态光散射免疫检测方法，其特征在于，所述磁性载体的粒径为70 nm-500 nm。
6.根据权利要求2所述的动态光散射免疫检测方法，其特征在于，所述化学共价修饰的方法为活泼酯法、戊二醛法、苯硼酸法中的任意一种。
7.根据权利要求2所述的动态光散射免疫检测方法，其特征在于，步骤S4的具体过程如下：
若待测目标物为小分子时：将目标待测溶液中加入磁性探针和检测探针，在温度为37℃的条件下反应5 min-20 min，反应结束后加入pH为7.5的磷酸缓冲液磁吸洗涤2-3次后，再加入多价交联剂，反应5 min-20 min，最后测定平均水化动力学粒径确定目标物的含量；
若待测目标物为大分子时：将目标待测溶液加入磁性探针，在温度为37℃的条件下反应5 min-20 min后，用pH为7.5的磷酸缓冲液磁吸洗涤2-3次后加入检测探针，继续反应，反应结束后，用pH为7.5的磷酸缓冲液磁吸洗涤，再加入多价交联剂反应5 min-20 min，最后测定平均水化动力学粒径确定目标物的含量。
8.根据权利要求7所述的动态光散射免疫检测方法，其特征在于，磷酸缓冲液的浓度为0.01 mol/L。
9.权利要求1-8任一项所述的动态光散射免疫检测方法在对非糖蛋白类物质检测中的应用，其特征在于，所述非糖蛋白类物质为p24抗原、金黄色葡萄球菌肠毒素A或赭曲霉毒素A。
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