CN112189140A - 检测检验物质与血液或血液成分之间的相互作用，评估免疫状态评估及检测疾病 - Google Patents

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Abstract

此处公开了对受试者免疫系统的功能、状态和/或活性提供简单快速评估的独特的检验方法和装置。特别示范了一种方法，其涉及将检验物质与受试者的血液或血液成分混合，形成包括至少一个单位检验物质和所述血液或血液成分至少一分子成分的检验产物；在规定条件下分析检验产物，测定检验产物的性能(检验产物的性能包括物理性能、化学性能、光学性能、电性能、磁性能和/或机械性能)；将所述检验产物的性能与未暴露检验物质的相关性能进行比较，得到比较数据值，其中所述比较数据值指示所述受试者免疫系统的功能、状态和/或活性。

Description

检测检验物质与血液或血液成分之间的相互作用，评估免疫 状态评估及检测疾病
背景技术
健康的免疫系统对于防止人类和动物遭受病原体的有害攻击及防止感染传染性疾病非常重要。新生儿或新出生的动物免疫能力有限。出生后，新生儿和新出生动物的先天免疫力和适应性免疫力预期在几周至几月内发育，最终达到成熟，对身体提供全面保护。免疫系统差或免疫系统发育不良将使幼小的动物和儿童更容易感染各种疾病。实际上，众所周知，与成人相比，差不多所有感染性疾病，包括流感病毒，儿童和幼小动物的发生率更高，死亡率也更高。
虽然功能性免疫对人类和动物健康起着极端重要的作用，但是，目前并没有简单快速的临床检验能够让医生对儿童和幼小动物的免疫系统是否正常发育进行评估。开发出这样的检验将使医疗人员和兽医能够辨别免疫力较差或相对较差、身体较为虚弱的儿童和幼小动物，从而可以采取预防措施，防止他们接触有害的病原体和预防疾病。这样的检验还将方便制药公司、膳食补充剂生产商及农业动物饲料生产商开发出有助于改善幼小动物、幼儿及免疫功能变弱的老年人免疫力的产品，使他们更健康。到目前为止，制药工业和一般消费品工业已经生产了众多据称能够改善免疫系统功能的产品及处理、治疗或膳食补充剂。但是，并没有一种方便快速的血液检验方法能够对患者和消费者服用产品前后的免疫健康状态进行评估，从而在个人层面上确认产品和治疗的有效性。对畜牧业来说，能够辨别出具有强大免疫系统的动物，在筛选最佳种畜，获得更健康的动物，从而亦可以减少该行业抗生素的用量方面非常重要。
当人类或动物感染病原体，如细菌、病毒、真菌、寄生虫或其它微生物时，通常会引发主动免疫反应。任何主动免疫反应都会以进行的、原发疾病或病症为指示。可以检测到一般免疫反应，而并非检测到免疫系统单个分子或细胞成分的特殊变化的检验可以指示人类或动物可能的疾病或病症。一般免疫反应水平还可以指示人类/动物抵抗病原体入侵的能力，或与疫苗反应的情况，或治疗(包括免疫治疗)的效果。几乎所有常规免疫系统活性的免疫化学测定都局限于用于检测或定量与具体的单种疾病或病症诊断有关的特异性抗原或抗体的浓度。人们还广泛采用其它特异性不强的一般免疫筛选检验来评估人类和动物的健康状况。这些检验的实例有红细胞沉降速率(ESR)检验和C反应蛋白(CRP)检验。ESR作为各种自身免疫性疾病、骨感染、某些形式的关节炎及其它疾病是否存在的指标。类似地，C反应蛋白作为炎症、细胞感染、免疫疾病(如类风湿关节炎)、结直肠癌、心血管病及一系列其它病症的标志物。由于这些筛选检验是非特异性的，因此，非常有价值；单次检验结果呈阳性可能表明多种病症，或者可以用于评估动物或人类的一般健康状况。
附图说明
图1示出了基于金纳米颗粒(AuNP)和血液中血清蛋白(包括IgM、IgG和补体蛋白)之间协同作用的单步血液检验，该检验适用于体液免疫反应检测和分析。为了开展检验，将少量血清样品与AuNP溶液混合。在培养期间，血清中的蛋白质和其它生物分子将吸附到AuNP上，形成生物分子冠。作为血清蛋白一部分的IgM、IgG及补体蛋白可以与AuNP进一步交联，通过它们的协同作用形成簇和聚集体。D2Dx-R是一种动态光散射粒径分析仪，用于测定血清加入前后AuNP溶液的平均直径。可以采用以D2/D1表示的测试分数，评估血液样品的体液免疫状态。
图2A：不同年龄组C57BL/6小鼠的纳米颗粒测试分数。
图2B：不同年龄组BALB/c小鼠的纳米颗粒测试分数。
图2C：C57BL/6小鼠的相应ELISA IgM分析。
图2D：BALB/c小鼠的相应ELISA IgM分析。
图2E：C57BL/6小鼠的相应ELISA IgG分析。
图2F：BALB/c小鼠的相应ELISA IgG分析。
为了开展图2A-F的C57BL/6小鼠研究，2-3周、9周、20周和32-40周各年龄组分析的小鼠数量分别是7、3、3和5只，而在BALB/C小鼠研究中，2周、4-8周、10周和20-30周年龄组分析的小鼠数量分别是4、14、5和5只。对于ELISA分析，由于每个ELISA试剂盒可以平行分析40个样品，因此，该研究中每组小鼠选取最多5个样品。由于2-3周年龄组C57B/6小鼠采集了7个样品，4-8周年龄组BALB/c小鼠采集了14个样品，因此，在ELISA分析中，从这两组的每组中选取了5个代表性样品。这些样品的纳米颗粒测试分数刚好位于其对应年龄组的平均值附近。
图3：堪萨斯(KS)小牛和母牛的纳米颗粒测试分数。
图3B：佛罗里达(FL)小牛、母牛和公牛的纳米颗粒测试分数。
图3C：从四个不同分组(KS-小牛、FL-小牛、KS-母牛、FL-公牛)随机选取的10个代表性样品的IgM分析。
图3D：从四个不同组(KS-小牛、FL-小牛、KS-母牛、FL-公牛)随机选取的10个代表性样品的IgG分析。这些样品的纳米颗粒测试分数与其对应组的平均值最为接近。
图4：AuNP与不同浓度纯化牛IgM和IgG相互作用的纳米颗粒测试结果。该研究中共对四种IgM和IgG浓度进行了分析。每种溶液的培养时间是20分钟。
图5：其它纯化IgM和IgG牛血清样品的纳米颗粒测试结果。在每个分组中，选取4个代表性牛血清样品进行研究。
图6：同年龄2只WT(野生型)小鼠和2只JHD小鼠的纳米颗粒测试分数。每只小鼠都开展平行分析。
图7：加入C3蛋白后，纯AuNP、KS-小牛、FL-母牛和FL-公牛组的净粒径增加。为了考察AuNP与C3蛋白的直接相互作用，将纯AuNP溶液与1.15mg/mL纯C3蛋白溶液混合。为了开展牛分组研究，首先将AuNP和牛血清混合，然后，加入固定含量的C3蛋白溶液。将加入C3蛋白溶液后的净粒径增加绘图。
图8：热处理对三个牛血清样品的纳米颗粒测试分数的影响。这些样品在56℃培养10分钟。
图9A：采用A/PR8病毒攻击后，WT小鼠和JHD小鼠的纳米颗粒测试分数。WT小鼠和JHD小鼠在病毒感染前都注射等量的T记忆细胞。
图9B：采用ELISA开展的WT小鼠和JHD小鼠分别在感染14天后和21天后血清内A/PR8-特异性IgG的终点滴定分析。
图9C：WT小鼠和JHD小鼠感染4天后血清中存在的A/Philippines-特异性IgG的终点滴定(Log10)分析。
图9D：WT小鼠和JHD小鼠初次采用A/PR8病毒攻击后不同天数时的体重减轻情况。
图9E：WT小鼠和JHD小鼠再次采用A/Philippines病毒攻击后不同天数时的体重减轻情况。
图10：感染牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)的小牛和阴性对照组的纳米颗粒测试分数。阴性对照组：n＝16；感染组：n＝15。感染组血液样品在病毒感染第7天采集。
图11：与金纳米颗粒相互作用的血液/血浆/血清样品的上图和下图。颜色和/或光散射强度的变化以阳性结果(P)、弱阳性(WP)和阴性(N)评分。
图12：图中说明了病原体裂解液包被金纳米颗粒的方案。
图13：图中示出了采用图12方案开展测试的测试分数。
图14A：该图是采用此处所述纳米颗粒和方法开展检验的仪器实施例图。
图14B：该图是采用此处所述纳米颗粒和方法开展检验的仪器实施例图。
图14C：该图是采用此处所述纳米颗粒和方法开展检验的仪器实施例图。
图15：图中示出了人败血病样品、病毒感染样品及正常样品与金纳米颗粒相互作用的检验产物的平均粒径。
图16：图中示出了D2Dx测试分数和6-8月小牛体重之间的负相关关系。
图17：饲养小鼠和阴性对照小鼠的纳米颗粒测试结果。此处采用图2A研究相同的方案开展小鼠血清采集和纳米颗粒测试。图17A-D是四对饲养小鼠的测试结果，图17E-F是阴性对照雌性小鼠的测试结果。
图18：纯金黄色葡萄球菌(图18A)及其与对金黄色葡萄球菌具有正免疫反应的血清的混合物(图18B和图18C)的暗视野显微镜图像。血清来自感染金黄色葡萄球菌的兔子。细菌和血清之间的正相互作用也可以通过与纯细菌样品相比显微镜下细菌粒子消失或减少得到证明。
具体实施方式
本申请公开了一种检测检验物质与血液或血液成分之间的相互作用，并利用得到的信息评估和评价免疫系统一般功能、状态和活性，以及检测和诊断涉及免疫反应的疾病的方法。
在一个实施例中，将检验物质与血液或血液成分(血浆或血清)混合，形成包括一个单位所述检验物质和所述血液或血液成分至少一分子成分(at least one molecularcomponent)的检验产物。对所述检验产物开展物理性能、化学性能、光学性能、电性能、磁性能或机械性能的分析。在具体实例中，所述分析性能是尺寸，或当有多个检验产物时，所述分析性能是平均尺寸(通常以平均直径进行评估)。在另一个实例中，分析的性能是产物的颜色变化和/或光散射变化。检验产物与未暴露检验物质的这些性能的对比用于评估受试者免疫系统的功能、状态和/或活性。在一个替代实施例中，从上述过程中获得的免疫系统的功能、状态和活性用于评估血液提供者的健康状况，包括检测和诊断涉及免疫反应的疾病。
在一个具体实施例中，所述检验物质是纳米颗粒(例如，银或金纳米颗粒)。来自样品溶液的蛋白质和/或其它生物分子被非特异性地吸附到纳米颗粒上，形成检验产物。检验产物的平均尺寸，可以采用动态光散射或其它合适的粒径分析方法测定。通过比较检验产物与未暴露纳米颗粒的粒径，粒径的变化情况提供了有关受试者免疫功能状态或疾病状况的有用信息。在一个替代实例中，检验产物的颜色和/或光散射性能可以通过肉眼观察或采用分光光度计、光密度计或浊度测定来确定。这些性能变化提供了有关受试者免疫状态的信息。
在另一个实施例中，提供了一种评估受试者免疫系统功能、状态和/或活性的方法。所述方法涉及将检验物质与受试者的血液或血液成分混合，形成包括至少一个单位所述物质和血液或血液成分至少一分子成分的检验产物，在预先选择的条件下对检验产物开展分析，测定检验产物的性能。检验产物的性能可能包括一种或多种物理性能、化学性能、光学性能、电性能、磁性能和/或机械性能。将检验产物的性能与未暴露检验物质的相关性能进行比较，得到比较数据值，其中所述比较数据值指示受试者免疫系统的功能、状态和/或活性。在一个具体实例中，所述检验物质是金属颗粒。在另一个具体实例中，所述检验物质是聚合物颗粒，如乳胶颗粒。更具体地说，所述金属颗粒可以是金或银纳米颗粒。分析步骤可以涉及测定检验产物的尺寸，例如，采用动态光散射法检测检验产物。在另一个具体形式中，分析步骤涉及肉眼观察或采用分光光度计或测定材料光散射性能变化的仪器测定检验产物的颜色和/或光散射性能。其中混合步骤得到多个检验产物时，测定尺寸可能涉及平均粒径(例如，平均直径)。此外，其中测定检验产物的平均粒径时，则相关性能亦将是平均粒径。在甚至更具体的形式中，比较数据值将是检验产物与未暴露检验物质的尺寸比或检验产物相对未暴露检验物质的尺寸百分数。所述至少一分子成分可以包括抗体，例如，免疫球蛋白G或M(分别是IgG或IgM)抗体，一分子补体系统成分，或它们的组合。所述方法可以进一步涉及从一组具有已知免疫系统功能、状态和/或活性的受试者获得平均对照数据值或一系列对照数据值；其中比较数据值与平均对照数据值或系列对照数据值之间的差值将指示受试者的免疫功能、状态和/或活性升高或降低。例如，比较数据值低于平均对照数据值或系列对照数据值将指示免疫功能下降。或者，当已知免疫系统功能、状态和/或活性包括拥有健康免疫功能、状态和/或活性的人群时，比较数据值高于平均对照数据值或系列对照数据值将指示免疫反应提高(当受试者发生病原体感染时通常会观察到这种情况)。
在另一个实施例中，公开了一种测定受试者免疫系统发育情况的方法。所述方法涉及将至少一种检验物质与受试者的血液或血液成分混合，形成包括至少一个单位所述检验物质和至少一分子血液成分的检验产物。在选择的条件下对检验产物开展分析，测定检验产物的性能。将所述检验产物的性能与免疫系统正常发育的人群的平均对照数据值或系列对照数据值进行比较。当检验产物的性能数据值低于或高于对照数据值或系列数据值时，表明受试者免疫功能异常。
在速度和简单性方面优于ESR和CRP的本发明的另一个实施例中，提供了一种评估免疫系统一般反应的方法，用于确定受试者免疫系统的发育情况，或受试者免疫系统的功能，或受试者对免疫系统靶向治疗的反应，或者，提供受试者是否感染病原体的一般信息，无需鉴定具体的病原体。
在另一个实施例中，公开了一种开展此处检验方法的试剂盒。所述试剂盒包括一种仪器，所述仪器包括至少一个容器，用于容纳检验物质和测试样品。所述仪器可以包括一种将测试样品转移到所述容器的装置。在一个具体实施例中，所述至少一个容器具有顶端、底端和位于顶端和底端之间的本体部分，其中所述容器定义了放置所述检验物质的内室；其中所述一个装置是量油计，或其中所述一种装置是移液管。
公开了另一个试剂盒实施例，其包括一种仪器，所述仪器包括一个底座和固定在底座上或可拆卸地放置在底座定义孔内的多个容器。所述底座和多个容器定义了一个内室，所述内室具有与底座部分上表面近似对齐的底部。正如各实例中进一步解释的那样，此实施例的配置方便提供检验物质，改善分析。在一个具体实施例中，所述容器中的每个容器包括用于密封内室的密封或盖。
定义：
涉及检验物质和检验产物的词语“性能”指的是任何化学性能、电性能、磁性能、机械性能或物理检测性能。所述性能的实例包括：采用核磁共振测定检验物质和检验产物的核松驰时间T2或T1；通过肉眼观察或分光光度计测定检验物质和检验产物的颜色或光吸收；采用静电计测定检验物质和检验产物的电导率变化；测定检验物质和检验产物的表面等离子体共振变化；测定检验物质和检验产物的表面声波变化；测定检验物质和检验产物的折射率变化；通过肉眼观察或浊度法测定浊度变化；采用暗视野光学显微镜或光散射装置、动态或静态光散射、拉曼散射法测定检验物质和检验产物的散射光强度；采用拉曼光谱或FT-IR光谱测定检验物质和检验产物的化学性能变化；采用荧光显微法或分光光度计测定检验物质和检验产物的荧光性能变化；采用粘度计测定检验物质和检验产物的流变学变化；例如，所述性能涉及测定检验产物的尺寸。检验物质的尺寸可以采用动态光散射法测定。《动态光散射技术》的说明参见ACS Appl.Mater.Interfaces,2016,8(33),pp 21585–21594。
词语“相关性能”涉及与检验产物测定性能相同的性能，只是测定的对象是未暴露的检验物质。
此处所述词语“相互作用”指的是检验物质与血液或血液成分中至少一种分子成分之间的化学或物理相互作用。所述“相互作用”的一个实例是非-共价相互作用，包括氢键结合、静电相互作用、范德华力相互作用。所述相互作用可以是特异性的，例如，特异性抗体-抗原结合、链霉亲和素-生物素结合、DNA杂交、特异性受体-配体结合，或可以是非-特异性相互作用。
词语“非-特异性相互作用”指的是检验物质与样品之间的相互作用，其中检验物质并不设计用于特异性靶向样品中的任何具体分子或成分。当物质和分子单元之间涉及非-特异性相互作用时，亦可以称为物理吸附过程。例如，蛋白质对塑料容器器壁的随机吸附是一种非-特异性相互作用过程，亦称为物理吸附。蛋白质层从血液到柠檬酸盐配体戴帽金纳米颗粒表面的吸附过程通常称为非特异性相互作用，或非-特异性吸附。在另一个实例中，当检验物质包被病原体细胞裂解液时，这种包被的检验物质可能同时与样品中的一种或多种分子反应，而通过所述检验过程，可能或不可能鉴定出所述分子的身份。
词语“特异性相互作用”指的是检验物质和特定分子之间的特异性相互作用，其中所述检验物质与特定分子结合的亲和力相比与其它分子结合的亲和力更高。
此处所述词语“检验物质”指的是具有任何形状和几何结构的颗粒(例如，纳米颗粒或微粒、金纳米颗粒、银纳米颗粒、其它类型金属和半导体纳米颗粒或微粒、磁性颗粒、量子点、聚合物、聚合物颗粒、胶束、脂质体、外来体、碳纳米点、碳-基纳米材料等)或化学物质。所述词语“检验物质”还可以指表面能够与血液或血制品中的一种或多种分子结合的任何材料。所述材料的实例包括载玻片、塑料表面、镀金膜基材、金属电极、半导体材料、石墨烯、两-维材料。材料实例及所述材料的性能在Int J Nanomedicine.2017；12:3137–3151；and PNAS September 23,2008.105(38)14265-14270中给出。检验物质还可以是病原体或处理过的病原体，或病原体替代物，如活的、失活的、或衰减的病毒粒子，活的或死的细菌。检验物质还可以是包被部分或全部病原体组分，如病原体裂解液的颗粒或任何其它材料。在一个具体实例中，所述检验物质包括金属颗粒。更具体地说，检验物质是金属纳米颗粒或微粒。在一个具体实施例中，检验物质并不具有与所述物质连接的特异性抗体或DNA探针。在一个具体实施例中，检验物质包被部分或全部病原体组分，如病原体裂解液。许多蛋白质将与检验物质非特异性结合，例如，金纳米颗粒与补体系统中涉及的蛋白质、细胞因子、趋化因子、糖脂、类脂、血清蛋白和激素非特异性结合。在另一个实例中，包被部分或全部病原体组分，如病原体裂解液的检验物质可以与感染这种病原体的受试者的多种免疫相关-分子，如IgG、IgM、补体蛋白同时和非特异性反应。
词语“未暴露检验物质”指的是未暴露于待分析血液或血液成分的检验物质。
此处所述词语“受试者”指的是动物。动物的典型实例包括但不限于哺乳动物。在具体的实施例中，受试者是人类、狗、猫、牛、马、猪、山羊、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或非人类灵长类动物。
词语“涉及免疫反应的疾病”可能代表其中诱导免疫反应，或导致免疫功能下降(例如，HIV感染)的病原体感染。病原体包括但不限于细菌、分枝杆菌、真菌、病毒、朊病毒和寄生虫。此外，所述疾病可以涉及其中在未感染时免疫反应提高的自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的实例包括但不限于类风湿性关节炎、毒性弥漫性甲状腺肿、牛皮癣、血管炎、系统狼疮、重症肌无力和干燥综合征。病原体还可以指体内的肿瘤细胞和肿瘤抗原。
此处所述词语“免疫系统发育不良”指的是其中受试者体液或细胞免疫系统有效性低于同龄正常健康受试者的一种状态。
此处所述词语“免疫治疗”指的是提高(增强免疫力)或降低(抑制免疫力)受试者体液或细胞免疫反应能力的治疗。在一个实例中，免疫治疗包括但不限于免疫球蛋白替代、骨髓移植和施用干扰素、癌症免疫治疗。
此处所述词语“抗感染治疗”指的是治疗病原体感染的治疗。抗感染治疗的实例包括但不限于抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂和抗-寄生虫剂。
此处所述词语“主动免疫反应”指的是响应病原体接触或疾病或治疗，人类或动物免疫系统的任何分子或细胞组分从正常水平发生的变化。
除非另外规定，此处所述的所有技术名词和科学术语的含义均与申请时本发明涉及领域通常理解的相同。虽然本发明实践或检验中也可以使用与此处所述类似或相当的任何方法和材料，但是，下文对合适的方法和材料进行了描述。但是，熟悉本领域的技术人员应该了解的是，此处采用和描述的方法和材料是实例，并非是唯一适合本发明使用的方法和材料。此外，还应该了解的是，由于测定固有的+可变性，因此，除非明确指出，此处给出的任何温度、重量、体积、时间间隔、pH、盐度、摩尔浓度或重量摩尔浓度、范围、浓度或任何其它测定、数量或数值表达都指的是近似值，并非准确的或临界数据。因此，适合本发明及熟悉本领域的技术人员所了解的那样，采用专利申请中常用的近似或相对词语和程度词语描述本发明的各个方面是合适的，例如：这样的尺寸、大约、近似、大体上、基本上、基本上由……组成、包括及有效数量。除非另外规定，此处所述的所有技术名词和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的相同。
实例
材料和方法
小鼠模型、病毒感染和血液采集。将识别A/PR8血凝素(称为“HNT”)氨基酸序列126-138的BALB/c和C57BL/6小鼠，和T细胞转基因BALB/c小鼠在位于Lake Nona Vivarium的中佛罗里达大学饲养。BALB/c背景的B细胞-缺陷JHD小鼠购自Taconic Biosciences(纽约Rensselaer)。所有动物均在位于Lake Nona Vivarium的中佛罗里达大学在特殊的无病原体条件下圈养。所有实验动物程序均按照中佛罗里达动物保护和使用委员会指南的要求批准和使用。
A/PR8病毒采用源自圣裘德儿童医院(St.Jude Children’s Hospital)(田纳西州孟菲斯市)的原液在鸡胚蛋中制备，A/Philippines采用源自NIH(马里兰州贝塞斯达市)的原液在鸡胚蛋中制备。这两种病毒原液均由特鲁多研究所(Trudeau Institute)(纽约萨拉纳克湖)提纯和表征。
通过对麻醉小鼠颌下采血或心脏穿刺采血，采集小鼠外周血。将血样采集到2.0mL微量离心管内。血样采集后，立即将离心管直立放置1小时，让血液完全凝结。采用Eppend或Minispin，将离心管在13,400rpm离心5分钟。将血清转移到干净的微量冷冻管内，并立即用于测试。
记忆CD4 T细胞过继性转移和病毒感染。采用如上文所述从HNT小鼠得到的初始CD4T细胞，制备Th1-极化记忆细胞。简单地说，采用阳性磁珠筛选(德国MilteniBiotec,BergischGladbach)提纯，并采用辐射抗原递呈细胞和HNT肽在Th1-极化条件下培养。4天后，将得到的效应细胞充分清洗，并在介质中重新培养3天，进行休眠。在休眠结束后，通过淋巴细胞分离(加拿大伯灵顿Cederlane实验室)，分离活细胞，并计数，并通过眶后注射将200μL PBS中的5x106个细胞转移到麻醉条件下(异氟烷)未激活Balb/c或JHD小鼠体内。
在麻醉条件下，通过鼻腔内滴注溶于50μL PBS内的A/PR8病毒，使接受HNT记忆细胞的小鼠感染病毒。感染在CD4 T细胞转移的同一天开展。A/PR8-激活小鼠采用类似的方式接受溶于50μL PBS内的A/Philippines病毒的攻击。感染后，每天对小鼠进行监测，直到实验结束。
牛血液采集和处理。堪萨斯成年牛分组的牛血液样品从堪萨斯州曼哈顿的堪萨斯州立大学奶牛场圈养的2-3岁健康雌性成年荷斯坦奶牛身上采集。KS-小牛组的血液样品从堪萨斯州立大学大型动物研究中心的气候-调控设施内圈养的2-3周健康、混合性别荷斯坦牛身上采集。外周血通过颈静脉采集到大理石面真空采血管内。让血液凝结4-5小时，然后，在2000xg条件下离心分离10分钟。将血清分成几份，并在使用前置于-80℃保存。所有动物研究均严格按照联邦和机构指南开展，并经堪萨斯州立大学动物保护和使用管理委员会批准。
佛罗里达牛血液样品在威尔士湖G7牧场采集。佛罗里达-母牛由安格斯母牛、布拉德福德母牛、夏洛来母牛、婆罗门母牛和西门安格斯母牛混合组成。外周血采用消毒的3ml一次性塑料注射器、18号针头(小牛采用20号针头)通过颈静脉穿刺采集。将大约1mL血液样品分配到2.0mL离心管内。在凝结4-6小时后，将离心管在13,400rpm离心5分钟。将血清移到干净的微量冷冻管内用于测试。
采用牛呼吸道合胞体病毒感染小牛及采集血样。将32头初乳充足的混合性别荷斯坦小牛在3-4周年龄时登记入选，并随机分配到两个治疗小组：未感染对照(n＝16只动物/组)或感染BRSV(n＝16只动物/组)。研究持续期间，小牛圈养在堪萨斯州立大学大型动物研究中心的气候-调控设施内。让这些动物适应5天。在第0天时，如前文所述，通过采用含～104TCID50/mL BRSV菌株375的气溶胶接种，使BRSV组的小牛被这种病毒感染。在感染第7天，通过颈静脉采集外周血到大理石面真空采血管内。让血液凝结4-5小时，然后，在2000xg离心分离10分钟。将血清分成几份，并在使用前置于-80℃保存。
金纳米颗粒检验。本研究中采用的柠檬酸盐戴帽金纳米颗粒(AuNP)的平均粒径是75nm，是Nano Discovery Inc.(佛罗里达州奥兰多市)馈赠的。这种AuNP-血清吸附检验采用Nano Discovery Inc.(佛罗里达州奥兰多市)的D2Dx-R阅读器开展。所有尺寸测定都在室温25℃进行。
为了开展AuNP-血清吸附检验，将3μL动物血清与60μL AuNP混合。将所述混合物涡旋大约10秒，然后，在室温静置。室温培养20分钟后，采用D2Dx-R阅读器测定所述检验溶液的平均粒径(D2)。采用D2Dx-R测定的原始纯AuNP的平均粒径以D1表示。计算D2/D1之比作为测试分数。所有样品均开展平行测定，平行测定的平均值作为本研究的数据分析并报告。
小鼠/牛ELISA IgG/IgM分析。所有小鼠和牛IgG/IgM ELISA分析均采用商业ELISA试剂盒开展。牛IgM ELISA试剂盒(E11-101)、牛IgG ELISA试剂盒(E11-118)、小鼠IgMELISA试剂盒(E99-101)和小鼠IgG ELISA试剂盒(E99-131)均购自Bethyl Laboratories公司(德克萨斯州蒙哥马利)。所有这4种ELISA试剂盒均基于夹心-型检验。平板涂布抗-牛IgM、抗牛IgG、抗小鼠IgM或抗-小鼠IgG抗体。试剂盒内的生物素化检测抗体首先与链霉亲和素-结合辣根过氧化物酶(SA-HRP)结合，然后与底物3,3’,5,5’-四甲联苯胺(TMB)反应，产生信号。为了开展检验，首先将稀释的血清样品(根据用户说明书，小鼠IgM和牛IgM分析的稀释因子采用1:10000，小鼠IgG分析稀释因子采用1:50000，牛IgG分析稀释因子采用1:250000)加入到预先涂布的微量滴定板内，促进靶蛋白(IgG或IgM)和捕捉抗体之间的结合。在培养一个小时后，将滴定板清洗几次，清除任何未结合的靶抗原。在第二步中，加入生物素化检测抗体，与所述靶蛋白结合。培养1小时并洗涤后，加入SA-HRP溶液，与生物素化检测抗体结合30分钟。洗涤后，加入TMB底物溶液，启动与HRP的颜色变化反应，并在450nm测定吸光度。每个血清样品都开展平行分析，每个样品报告平行检验的平均吸光度。
由于KS-母牛和FL-母牛的平均纳米颗粒测试分数非常接近，而且每个ELISA板可以同时平行分析最多40个样品，因此，我们选择在ELISA研究中仅纳入KS-母牛组。从每个牛分组中筛选出的10个样品是所述分组中最具代表性的样品，纳米颗粒测试分数最接近整个分组的平均测试分数。例如，KS-小牛和FL-小牛组的平均纳米颗粒测试分数分别是1.54和1.88。从KS-小牛组和FL-小牛组筛选出来的10个样品的测试分数范围分别是1.47-1.51和1.94-2.12。
病毒攻击后小鼠的ELISA滴定度分析。按照前文所述，采用A/PR8或A/Philippines病毒涂布96-孔板，开展ELISA分析，从而检测流感病毒-特异性抗体。简单地说，将血清样品在4℃培养1个晚上，然后，充分洗涤，加入抗总小鼠IgG(美国阿拉巴马州伯明翰市SouthernBiotech公司)的HRP-结合抗体。培养1个晚上后，加入HRP底物，并在492nm处测定酸终止颜色反应的光密度。灵敏度临界值通过以平均阴性对照值加2倍标准偏差确定。
统计分析。图中表示的P值通过采用GraphPad Prism软件，通过未配对双尾学生t检验或单因素方差分析(one way ANOVA)模型确定。特别是，由于不止两组需要在统计学上进行比较，因此，采用ANOVA模型计算图3B-D的P值。P值<0.05被视为具有显著性差异。星号数量指示P值的显著性水平，例如，*、**、***和****分别代表P值≤0.05、≤0.01、≤0.001和≤0.0001。如果各组之间不存在显著性差异(P>0.05)，则结果以“ns”表示，即不显著。
实例1用于评估从出生到成年免疫力发育情况的快速血液检验
设计了一种极其简单的金纳米颗粒-激活血液检验，可以监测动物从出生到成年一般免疫系统发育和免疫健康的情况。该检验仅需采集几滴血开展，涉及单步程序，15-20分钟内得出结果。虽然此处报告的研究是在实验室动物模型和农场动物上开展的，但是，该检验也适用于人类应用。由于简单，该检验可以在范围广泛的地点开展，包括医务室、诊所和医院，或畜牧场(动物时)，适用于临床诊断和一般健康管理目的。
该检验的原则与图1所示的这些研究有关。该检验主要检测血液中免疫球蛋白M(IgM)抗体的增加量，还检测免疫球蛋白(IgG)抗体的增加量。研究还发现，补体蛋白，如C3参与金纳米颗粒和血清之间的相互作用。分析仅需非常少量的血清样品(3μL)。将样品与60μL金纳米颗粒(AuNP)溶液混合。培养后，血清中的免疫球蛋白(如IgM和IgG)，以及其它蛋白和生物分子(如补体蛋白)可以吸附到AuNP上，在纳米颗粒表面上形成所谓“蛋白冠”。由于其多价五聚体结构，IgM可以进一步与AuNP交联，形成小簇或小团。通过其两个对称的Fab片段，IgG也可以与AuNP交联，形成簇或团。众所周知，补体蛋白通过IgG和IgM的Fc区与免疫复合物结合。因此，补体蛋白亦可以与AuNP交联，形成簇和团。采用称为动态光散射的颗粒尺寸测定技术，通过测定AuNP-血清检验溶液的平均粒径，检测AuNP簇和团的形成。采用检验溶液平均粒径(D2)和原AuNP平均粒径(D1)之比定义的测试分数，对结果进行评估。血液样品中IgM和IgG越多，AuNP-血清混合物溶液中形成的AuNP簇和团越多，因此，纳米颗粒测试分数将越高。
IgM是免疫系统的关键组分，参与先天免疫和适应性免疫的功能。出生后，由于成熟免疫系统的发育及接触病原体和环境抗原，血液中IgM的含量在数周至数月内增加。Haider对200名新生儿的研究表明，在出生后第1个4周期间，血清中IgM水平稳定增加，之后继续增加。另一方面，由于母亲的IgG直接从母乳中输送，因此，新生儿血液中存在IgG。同样，新生小牛可以从初乳中获得母牛的IgG抗体。在母亲IgG水平初步下降后，由于幼儿自身免疫系统成熟，血液中IgG的滴度将再次增加。我们假设，将血清样品与AuNP简单混合，IgM和IgG含量增加将导致在AuNP-血清混合物溶液中形成更多的AuNP簇和团。检验溶液中形成的AuNP族和团的数量，从而检验溶液的平均粒径，因此将表明血液中IgM和IgG的相对含量，指示发育阶段新生儿、幼儿和动物的免疫状态。
该检验首先在实验室中应用，用于研究从无特定抗原设施中饲养小鼠采集的血清样品。在此研究中，采用两个常用的、基因上不同的小鼠品系：C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠。血清样品从不同年龄组(从两周至40周)的这些小鼠身上采集。纳米颗粒测试表明呈现出非常明显的年龄-依赖性分数增加，两个小鼠品系的表现类似(图2A和B)。分析表明，不同年龄组之间的差异具有统计学显著性。为了了解纳米颗粒测试和小鼠血清内抗体水平之间的关系，我们还采用ELISA对这些样品开展了总IgM和IgG分析。如图2C和D所示，这两个小鼠品系血清中的IgM水平均随年龄增长而稳定增加。另一方面，我们发现，C57BL/6小鼠的IgG水平随年龄轻微增加，但BALB/c小鼠未见增加(图2E和F)。正如我们所假设的那样，与血清相互作用后，IgM对AuNP簇形成的贡献更大。由于实验室小鼠放置在干净、无特定病原体的环境中，因此，预期研究期间小鼠的IgG水平不会发生显著变化。值得注意的是，我们观察到，在雄性和雌性小鼠中随着年龄增加纳米颗粒测试分数和血清抗体水平之间的关系相同。
在第二项研究中，从不同年龄的牛身上采集大量血清样品进行了测试。该项研究中采用的牛血清样品主要有两个来源：来自堪萨斯的小牛和成年母牛样品(KS-小牛和KS-母牛组)，来自佛罗里达的小牛、成年母牛和成年公牛样品(FL-小牛、FL-母牛和FL-公牛组)。该项研究中采用的小牛、母牛和公牛的近似年龄、数量，以及它们的来源地，均在表1中列出。共采集和分析了530多个样品。堪萨斯分组和佛罗里达分组的检验结果在图3A中给出。从仅2-3周大的小牛至成年母牛(堪萨斯分组)，纳米颗粒测试分数存在明显的年龄-依赖性增加，与图2中总结的小鼠研究观察到的情况相符。从佛罗里达牛分组3-4月大的小牛至成年母牛和公牛，也明显观察到类似的纳米颗粒测试分数增加。并未出现明显的性别差异，再一次，结果与小鼠研究相符。
表1。
Figure BDA0002782487510000101
Figure BDA0002782487510000111
还对从KS-小牛、FL-小牛、KS-母牛、FL-公牛组随机筛选样品的IgM和IgG开展了ELISA分析。该分析表明，从新生小牛至成年牛，血清中IgM都存在非常类似的年龄-依赖性增加(图3B)，而IgG的年龄-依赖性增加明显弱很多(图3C)。这些结果与我们的小鼠研究结果一致，支持了随着年龄增加，导致形成的AuNP簇增加的主要是血清中的IgM抗体分子。
虽然人们认为，AuNP-血清检验溶液平均粒径增加主要是由IgM引起的，但是，其它分子亦对所述检验溶液平均纳米颗粒尺寸的增加做出贡献。因此，向纯AuNP溶液中加入不同浓度的纯化牛IgM和IgG，开展了同样的纳米颗粒检验。对这两种免疫球蛋白来说，我们观察到，平均纳米颗粒尺寸稳定增加，但是，显然，IgM引起的粒径增加远大于IgG，最可能的原因是由于其多价五聚体结构(图4)。IgG，由于其对称结构(两个Fab区)，也可以与柠檬酸盐-AuNP交联形成簇，但其程度远低于IgM。
为了证明IgM和IgG对AuNP粒径增加的直接和不同贡献，采用血清样品和纯化IgM和IgG，开展下述加样实验。从表1中列出的五个牛分组的每个分组中随机选择4个代表性血清样品。每个血清样品取3μL首先与60μL AuNP悬浮液混合。然后，向AuNP-血清混合物中加入3μL浓度1mg/mL的IgM或3μL浓度0.2mg/mL的IgG。采用这两个浓度开展研究，是因为它们是血液样品的典型IgM和IgG浓度(～mg/mL范围)，这两个IgM和IgG浓度换算为摩尔浓度是相当的(～1.3μM，IgM的分子量大约是IgG的5倍)。室温培养20分钟后，测定另外加入IgM或IgG的检验溶液的平均粒径。图5示出了每个分组未加和另外加入IgG或IgM的检验溶液的平均粒径。显然，血清中另外加入牛IgM或IgG后，所有5个分组样品的平均粒径都增加，虽然增加程度有所不同。仔细观察表明，佛罗里达组的增加程度总体似乎远大于堪萨斯组。FL-公牛组检验溶液中仅另外加入1mg/mL IgM或0.2mg/mL IgG后，粒径增加显著高于4-倍。
我们首先研究了纯化C3蛋白与AuNP的相互作用。在其浓度与其血液中浓度类似，即1.15mg/mL时，AuNP溶液的平均粒径增加大约50nm(图7)，与IgG类似，但远低于IgM。这种尺寸增加证明，C3蛋白很容易吸附到AuNP上，成为蛋白冠的一部分，正如前面研究支持的那样。但是，显然，从成熟动物观察到的结果来看，C3对较高的纳米颗粒测试分数的单独贡献并不显著。
在第二个实验中，我们在吸附牛血清的AuNP检验溶液中另外加入C3蛋白。与开展的IgM和IgG加样实验类似，从KS-小牛、FL-母牛和FL-公牛组中选择具有代表性初始纳米颗粒测试分数的2个样品开展此项研究。当向检验溶液中加入固定数量(3μL，浓度1.15mg/mL)的C3时，KS-小牛样品显示出非常小的纳米颗粒尺寸增加，而FL-母牛和FL-公牛组的平均粒径显著增加(图7)。由于C3单独作用并不会引起大量AuNP聚集，因此，我们假设C3肯定是与成熟牛样品中的IgM、IgG及非常可能与其它蛋白质相互作用，导致协同作用，急剧增强AuNP聚集体形成。再一次，年幼的KS-小牛可能缺少足够含量的抗体，并且仍然有待于发育全功能补体系统，因此，单独加入C3蛋白将不会引起AuNP聚集。
此外，通过热处理实验，还证明了补体蛋白在血清对金纳米颗粒的免疫反应中的基本作用。补体蛋白非常独特的一个特征是它们不耐热。作为细胞培养和其它应用生化物质的商业血清和血浆需要在56℃热处理30分钟，这是一个使补体系统失活的过程，从而其不会引发对所研究生物细胞的免疫反应。另一方面，IgM和IgG稳定性高很多，在所述处理条件下并不会受到破坏。在测试的牛样品中，随机选择3个测试分数高的样品，在56℃培养10分钟，再次进行测试。热处理后，所有3个样品的测试分数都急剧下降(图8)。观察到的这种现象准确反映了补体蛋白的特色表现。
根据目前得到的实验证据，我们认为，正如图1所示，当AuNP与血清样品混合时，柠檬酸盐-AuNP与IgM、IgG和补体蛋白C3之间发生了协同作用。血液中丰富的蛋白质，包括IgM、IgG和C3蛋白，被吸附到AuNP上，成为蛋白冠的一部分。这些蛋白的方向和特定位置可以是随机的，或者它们也可以是特定的。有些研究已经表明，纳米颗粒蛋白冠实际上由两层蛋白组成：一层称为硬层，具有相对固定的蛋白组成，及一层软外层，与血浆中的其它蛋白发生动态、可逆的交换。在我们自己关于小鼠流感感染的最新研究中，我们观察到存在所述双层冠状结构，并且进一步发现，IgG抗体利用其面向AuNP的Fab区，及其向外暴露在AuNP表面上的Fc区，与AuNP表面结合，正如图1所示。由于所述方向，C3蛋白，不管是与AuNP结合，或处于游离的检验溶液中，可以将所述IgG作为抗原-结合免疫复合物识别，与IgG和病原体表面结合时类似。AuNP-吸附和补体蛋白、IgM、IgG之间的所述“补充”结合将导致形成大量的AuNP-蛋白网，如图1所示，导致混合物检验溶液的尺寸显著增加。在此模型中，AuNP基本上作为“普遍病原体替代物”，并且AuNP聚集过程反映了对入侵病原体的典型体液免疫反应。
我们还采用免疫-缺陷小鼠模型，不采用“加样”样品，进一步证明了纳米颗粒测试分数和血清抗体水平之间的关系。我们对来自缺乏免疫球蛋白重链位点(JHD)J段表达的野生型BALB/c小鼠或BALB/c小鼠进行了测试。由于这种删除，JHD小鼠无法产生成熟B细胞，因此不会产生可以检测到的IgM或IgG。正如图6可以看出的那样，与野生型BALB/c对照小鼠(n＝2)相比，年龄(8周)相同时，JHD小鼠(n＝2)的测试分数低很多(1.1vs2.1)。通过3-周的研究，我们在不同的三天(第0天、第14天和第21天)从这4只小鼠身上采集了三批血清样品，整个研究中，WT小鼠和JhD小鼠的差异都非常一致(表2)。
表2. 3-周研究中不同的三天采集的WT小鼠(n＝2)vs JhD(n＝2)小鼠的平均纳米颗粒测试分数。
第0天 第14天 第21天
WT小鼠 2.10±0.19 2.14±0.10 1.88±0.08
JhD小鼠 1.09±0.05 1.15±0.01 1.17±0.02
由于纳米颗粒测试分数反映了免疫系统的功能和状态，因此，测试应该还能够检测主动微生物感染期间的持续免疫反应。为了证明这种可能性，我们首先采用流感病毒开展了WT小鼠和JHD小鼠的感染研究。WT小鼠和JHD小鼠采用低剂量小鼠适应性A/PR8(H1N1)甲型流感病毒(首次攻击)感染，然后采用致死剂量A/Philippines(H3N2)病毒开展异型攻击。由于JHD小鼠缺乏对流感病毒具有特异性的抗体产生B-细胞，即使在低剂量流感病毒感染时都会死亡，因此，将识别A/PR8病毒(H1N1)的T细胞受体转基因记忆CD4T细胞注射到JHD小鼠和WT BALB/c小鼠体内。我们已经证明，所述病毒-特异性记忆CD4 T细胞的过继转移可以保护JHD小鼠抵抗甚至高剂量的A/PR8病毒。未感染对照JHD小鼠中检测的AuNP-血清吸附测试分数保持在基线水平，而感染第14天时，WT小鼠的纳米颗粒测试分数急剧增加(图9A)。我们采用ELISA对感染第14天和第21天采集的血清样品中的病毒-特异性IgG抗体滴度进行了测定。正如预期的那样，该分析证明WT小鼠表现出强烈的体液免疫反应，而JHD小鼠未产生病毒-特异性抗体(图9B)。此研究还进一步证明，主动病毒感染期间，体液抗体反应是纳米颗粒测试分数升高、呈阳性绝对必需的。
在采用致死剂量的A/Philippines病毒攻击A/PR8-激活小鼠后，传输的A/PR8-特异性记忆CD4 T细胞并未提供抵抗这些病毒的保护，因为所述病毒未表达他们的转基因T细胞受体识别的表位，WT小鼠的抗体滴定进一步增加，而正如预期的那样，JHD小鼠组未出现可以看得到的反应(图9C)。在初次感染期间，由于注射的CD4 T细胞的保护作用，这两组小鼠的体重都并未大幅减轻(图9D)，但是，JHD小鼠受致死剂量A/Philippines病毒感染的影响非常大，体重明显减轻(图9E)。这一点证明了前面的发现：在异源亚型感染期间，小鼠体内初次流感感染期间产生的抗体具有保护作用。此外，采用简化模型开展的此项研究提供了强有力的概念验证证据：AuNP-血清吸附检验测试分数与存在的循环病原体-特异性抗体的数量直接有关，因此，与动物的免疫活性和状态有关。Verhoeven等最新研究表明，与成年鼠相比，BALB/c“幼”鼠(21天大)更容易遭受流感病毒感染的攻击，进一步支持了上面的发现。这些幼鼠抗体产生少，死亡率高，截止到感染10-天时未将病毒清除，与幼儿(<2岁)流感病毒感染观察到的死亡率更高类似。此项研究中年龄越小的小鼠越易感染病毒，与我们发现的3-周大的小鼠和成年鼠相比纳米颗粒测试分数低很多相关联(图2)。这一点反过来支持了这个想法：我们此处描述的纳米颗粒测试可用于快速评估发育期间的一般体液免疫状态-这是许多感染结果的重要预测因子。
总之，此处的发现证明了一种操作非常简单的快速血液检验，可用于评估新生动物至成年动物体液免疫性和免疫性发育情况。小鼠模型和牛模型都建立了纳米颗粒测试分数和血液中抗体水平之间的直接关系。纳米颗粒测试分数低与动物体液免疫性差或发育不良对应。虽然目前的研究重点是实验室动物和农场动物，但是，并不存在为什么不能用于人类受试者的理由。由于操作简单，检测迅速，因此，所述公开的纳米颗粒检验可在即时设施和农业畜牧场内使用，用于鉴定出免疫功能发育不良或受损的人类和动物。在北美，小牛尤其容易感染牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)，由于这种感染性疾病导致的小牛死亡数量非常大。让农场主能够鉴定出免疫性较差或发育不良的小牛或其它幼小动物的简单快速的检验方法将给畜牧业带来巨大利益。农场主可以针对这些幼小动物采取更多的预防措施来防止疾病。还可以开发出新的抗生素饲养程序，从而仅对那些更易感染的动物而不是全部动物使用抗生素。这将显著减少该行业抗生素的使用量，减少目前的问题和耐多药细菌感染的负担。
与实例有关的其它信息在(Zheng,T.；Crews,J.C.；McGill,J.L.；Khunal,D.；Finn,C.；Strutt,T.M.；McKinstry,K.K.；Huo,Q.A single-step gold nanoparticle-blood serum interaction assay reveals humoral immunity development and immunestatus of animals from neonates to adults.ACS Infectious Diseases,2019,5,228-238)中给出，通过引用，该文献纳入本申请中。
实例2血清-AuNP吸附检验，用于检测细菌、病毒和其它病原体感染
可以采用实例1、图1所示相同的检验检测细菌或病毒感染。当动物或人类感染病原体，如细菌、病毒、真菌、寄生虫等时，体内将产生免疫反应，包括血液中IgM/IgG抗体含量增加。血液中的细菌可以与金纳米颗粒非特异性反应，导致形成较大的聚集体。因此，当血液样品与AuNP混合时，平均纳米颗粒粒径将增加，超过正常水平。我们对39名健康人类的39个血液样品、6个感染各种细菌的败血病患者的血液样品，及4名感染各种病毒的患者的血液样品进行了检验。如图15所示，事实上，败血病和病毒感染组的平均粒径大幅高于正常健康组。该检验可用于诊断细菌、病毒和其它病原体感染。
从感染牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)的小牛(3-4周大)身上观察到类似的纳米颗粒测试分数增加。如图10所示，健康对照组(n＝16只小牛)和感染组(n＝15只小牛)之间存在统计学上显著性差异(p<0.001)。即使3-4周大小牛的免疫功能发育相当不良，但从感染病毒的小牛身上仍然观察到了有意义的免疫反应，所述免疫反应通过单步AuNP-血清吸附检验检测。
实例3观察检验物质和血液/血液成分之间相互作用引起的颜色和/或光散射强度变化
通过检验溶液颜色变化和/或光散射强度变化观察检验物质与血液/血浆/血清之间相互作用的实例见图11。图11分析了18个牛血清样品。P指的是阳性，WP指的是弱阳性，N指的是阴性。阳性指的是高免疫活性，阴性指的是低免疫活性。
实例4含病原体全裂解液的包被材料及采用所述材料作为检验物质检测感染引起的免 疫反应开展疾病诊断
在此实例中，所述检验物质涉及一种包被病原体全裂解液的材料。病原体分子，包括但不限于包膜蛋白、膜蛋白、糖蛋白、类脂，将与所述材料结合，形成结构与病原体表面类似的生物分子冠。这种检验物质可视为和作为伪病原体、假病原体或病原体替代。然后，可以将这种检验物质与血液或其它生物流体混合，从而检测这种病原体引发的感染。检测是通过伪病原体与血液或其它生物流体中的任何分子或分子组合之间广泛的相互作用进行的。例如，相互作用可能涉及伪病原体与不止一个免疫相关分子，如IgG、和/或IgM、和/或补体蛋白结合。实例在图12和图13中给出。该实例说明了如何采用这种方法用于寨卡病毒感染检测和诊断，但是也可以用于其它病原体。首先将柠檬酸盐-包被的金纳米颗粒包被寨卡病毒全裂解液。寨卡病毒包膜蛋白、类脂和其它包膜成分将共同吸附到颗粒表面上，形成结构与实际寨卡病毒类似的纳米颗粒。当这种金纳米颗粒探针(检验物质)与寨卡病毒感染患者的血液样品混合时，免疫相关分子，如IgM、IgG和补体蛋白将与纳米颗粒探针(检验物质)反应，形成较大的聚集体。所述聚集体可以通过测定平均粒径(以测试分数表示)检测，或通过观察检验产物的颜色变化或光散射强度变化检测。如图13所示，感染寨卡病毒的人类患者样品的测试分数远高于健康正常对照组，和感染登革热(DENV)或基孔肯雅病毒(CHIKV)的患者组。该检验并不规定与检验物质，假病原体相互作用的分子。
实例5：实施检验的装置
图14公开了可用于执行本发明公开检验的装置的四种变化形式。所述装置设计用于保持一种或多种检验物质用于单次或多次检验。所述容器可用于储存检验物质、开展检验或执行两者。所述装置设计用于最大限度地减少检验所需检验物质用量，同时，暴露检验物质和检验溶液，使肉眼观察简单，或易于接近装置，开展性能测定。
图14A(装置实施例1)示出了装置10的第一个实施例，其配备容器13，用于容纳此处所述检验物质14。所述装置还可以包括盖12部件。
图14B示出了一种定制装置20，其包括容器21，用于容纳此处所述检验物质22。装置20还包括盖/施用器，帮助将样品输送到装置内。所述盖/施用器的一种形式包括量油计25，用于浸入到液体样品中，涂布的量油计放在容器21内。盖/施用器23还包括与量油计25连接的盖部分27。所述盖/施用器的第二种形式包括与盖29连接的移液管26。在盖29的顶部，是一个可挤压的球，建立真空，用于抽取液体样品。液体样品装到移液管26内之后，将所述盖/施用器放在容器21内。球28可以在盖29固定到容器21上之前或之后挤压。图14A和14B所示装置可作为独立的检验容器使用，可以独立使用，或者，多个装置10或20可以放在或集成在多孔支承板内，用于开展多个检验分析。
图14C涉及装置30，该装置30是一种成型单件装置，配备在底部支承上直接成型的多个容器32。与典型的微孔板不同的是，所述溶液容器在底部支承34顶部上敞开，从而所述检验物质和检验溶液可以通过肉眼轻松观察，或者，可以接近，开展性能测定。这种设计还将最大限度地减少检验所需检验物质的用量。容器32可以包括盖33。图14A-D的盖包括挠性和/或可穿透的膜或塞。
图14D示出了一种定制容器40，其包括上室41，检验物质42放在上室41内。装置40还包括位于室41下面的底部本体43。底部本体43配置为其可以放在多孔板(未画出)内。在室41和底部本体43之间是底部隔离表面42，阻止样品穿到底部本体43。底部本体43可以是实体或空心(未画出)。虽然此处给出了4种装置设计，但是，可以使用其它任何容器和板开展检验。此外，可以加入光源，照亮检验物质或检验产物，以进行肉眼观察或测定来自检验物质或检验产物的光学信号。例如，可以在与容纳检验物质的容器成某一角度的位置放置激光器或白光光源，从而可以观察或测定检验物质吸收的光或散射的光。
实例6采用实例1至5测定的受试者的免疫状态信息开展动物选择性育种或受试者选择 性治疗
动物的免疫性是可以遗传的。可以筛选经鉴定具有强大的免疫系统和功能的动物用于养育更多健康抗病后代。由于实例1、2或3中所述的方法可以测定动物的免疫性和免疫功能，因此，可以利用这些方法的检验结果来育种，或用于选择性治疗受试者。采用实例1和图3所述的方法，我们发现，测试分数异常的小牛的体重倾向于更轻。图16和表3的数据表明，小牛体重与其免疫性测试分数之间存在负相关关系。免疫性分数异常高的小牛可能存在临床或亚临床感染。免疫性测试分数最低和体重最高的第4组小牛可选择用于育种，而测试分数最不正常、体重最轻的第1组小牛可以独立治疗，帮助改善它们的健康和体重。
表3. 6-8月小牛测试分数和体重之间的关系。整个组的平均测试分数是1.5。
Figure BDA0002782487510000161
Figure BDA0002782487510000171
实例7利用免疫性和免疫状态信息鉴定对某些病原体具有广泛或特异性免疫性的受试 者，作为获得用于诊断剂和治疗剂的血液或血液成分的来源
如果采用此处所述方法，受试者被鉴定为对特定或广泛范围的病原体具有较高免疫性或阳性免疫反应，则此受试者的血液、血制品或血液成分可以作为诊断剂或治疗剂。例如，采用实例4、图12和图13中的方法，检验能够鉴定出来自最近爆发寨卡病毒感染的国家和地区的患者。采用实例4所述的检验，我们发现，60％来自这个国家的人群呈寨卡病毒抗体阳性。这些人群可以作为献血者，用于抗寨卡病毒抗体分离和生产。所述抗体产品可以用于未来诊断寨卡病毒新爆发时感染的患者。某些受试者对特定的或广泛的病原体具有天然免疫力。这些受试者的天然免疫力可以采用实例4的方法鉴定。这些受试者，即使以前未接触过病原体，可以鉴定作为可能的献血者，提供他们的血制品供诊断和治疗用途。
实例8利用公开的方法检测与怀孕、分娩有关的免疫性和免疫反应的变化，及鉴定出高 风险受试者进行治疗和管理，减少可能的感染性疾病
在怀孕期间，发生复杂的生理变化，包括免疫系统变化。这些变化是为了适应“外来”物体-胎儿的生长而需要发生的。众所周知，怀孕会影响免疫功能/对体液抗体反应的活性，这些我们的检验能够轻松检测出来。许多病毒性病原体，如巨细胞病毒(CMV)和流感病毒，其清除需要细胞介导的免疫反应，会导致孕妇严重的感染。对胎儿的影响从发育缺陷至死亡。奶牛在其过渡期(产前3周至产后3周)免疫系统受到抑制，更容易感染疾病，如乳腺炎。可以检测和监测所述免疫状态变化的检验将允许针对动物和人类开展选择性治疗和降低感染感染性疾病的风险。采用实例1、图1和图2A所述的检验方法，我们发现，在饲养小鼠的怀孕期间，怀孕小鼠的测试分数在产仔前几天明显增加(图17)。在此研究中，共对10对饲养小鼠和10只雌性对照小鼠进行了研究。所有怀孕小鼠都表现出非常类似的行为，而阴性对照雌性小鼠的测试分数在研究期间仅略微增加。这种测试分数增加反映了孕期小鼠的免疫状态变化。该检验，当应用于奶牛时，可用于鉴定高风险过渡奶牛，开展额外的治疗和管理，减少感染感染性疾病如乳腺炎的可能性。
实例9病原体如细菌作为“检验物质”，检测和定量对病原体具有阳性免疫反应的血液 样品
病原体(细菌、病毒等)可作为检验物质，用于检测和定量对病原体具有阳性免疫反应的血液样品。病原体通常是纳米颗粒或微粒。例如，金黄色葡萄球菌的直径是大约1μm；寨卡病毒的直径是大约100-150nm；巨细胞病毒的直径是大约150-200nm；衣原体原生小体的尺寸是大约200-300nm。这些纳米颗粒和微粒可以在不同的光学显微镜，如暗视野光学显微镜下观察。这些粒子还强烈散射光，因此，它们可以通过光散射方法检测。当血液样品包含与病原体结合的抗体和/或补体蛋白时，通过将血液样品(全血，或血浆或血清)和病原体样品混合，血液中的主动免疫分子(抗体，和/或补体)和病原体粒子之间的结合将导致病原体颗粒聚集在一起。图18是纯金黄色葡萄球菌(图18A)和混合一个阳性血清样品的细菌(图18B和C)的暗视野光学图像。该检验可用于鉴定对特定病原体具有强大免疫力的受试者，或用于鉴定以前或目前被这种病原体感染的受试者。该检验测定抗体和/或补体蛋白，以及其它血液蛋白和生物分子与病原体结合，导致形成病原体聚集体，并且标记病原体，通过噬菌作用或其它机制清除病原体的共同影响。虽然，此处以暗视野光学显微镜图像作为检测方法的实例，但是，病原体颗粒和血清之间的相互作用可以采用光散射技术(如动态光散射，测定检验产物的平均粒径变化)，浊度测定、光密度测定、沉降、荧光显微法等观察，这些方法都具有同样的效果。
虽然参考某些优选形式对本发明进行了相当详细的描述，但是，还可能有其它形式。因此，所附权利要求的精神和范围不应限于此处优选形式的说明。
读者的注意力涉及与此说明书同时提交、且与此说明书一起对公众审查开放的所有论文和文件，通过引用，所有这些论文和文件都纳入本申请中。
除非另外明确说明，本说明书(包括任何所附权利要求书、摘要和附图)中公开的所有特征可以被替代特征所代替，具有相同的、相当的或类似的用途。因此，除非另外明确说明，公开的每个特征仅仅是通用相当或类似特征系列的一个实例。
权利要求中未明确声明执行规定功能的“装置”，或执行特定功能的步骤的任何元件，并不应解释为35U.S.C§112中第6款规定的“装置”或“步骤”条款。特别是，此处权利要求中采用“步骤”并不旨在援引35U.S.C§112第6款的规定。

Claims (66)

1.一种评估受试者免疫系统功能、状态和/或活性的方法，所述方法包括：
将检验物质与受试者的血液或血液成分混合，形成包括至少一个单位所述检验物质和所述血液或血液成分至少一分子成分的检验产物；
在规定条件下分析检验产物，测定检验产物的性能，所述检验产物的性能包括物理性能、化学性能、光学性能、电性能、磁性能和/或机械性能；及
将检验产物的性能与未暴露检验物质的相关性能进行比较，得到比较数据值，其中所述比较数据值指示受试者免疫系统的功能、状态和/或活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个单位检验物质包括至少一种金属颗粒。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述检验物质包括至少一种乳胶颗粒。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述检验物质包括包被全部或部分病原体组分的材料。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述检验物质包括通过特异性或非特异性相互作用，能够与血液的一种成分相互作用的材料表面。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述材料是载玻片、镀金膜载玻片或塑料表面。
7.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述检验物质是金纳米颗粒。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述分析步骤包括测定所述检验产物的尺寸。
9.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述分析步骤包括观察或测定所述检验产物的颜色和/或光散射性能。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述测定所述检验产物的尺寸包括使检验产物经受动态光散射。
11.根据权利要求1-5、7或8任一项所述的方法，其中所述检验产物的性能是平均粒径。
12.根据权利要求1-4或7-11任一项所述的方法，其中所述未暴露检验物质包括至少一种金属颗粒。
13.根据权利要求1-4或7-12任一项所述的方法，其中所述相关性能是平均粒径。
14.根据权利要求1-4或7-13任一项所述的方法，其中所述比较数据值包括检验产物与未暴露检验物质的尺寸比或检验产物相对未暴露检验物质的尺寸百分数。
15.根据权利要求1-14任一项所述的方法，其中所述至少一分子成分包括抗体或补体蛋白，或它们的组合。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体是IgG抗体、IgM抗体，或它们的组合。
17.根据权利要求1-16任一项所述的方法，进一步包括从一组具有已知免疫系统功能、状态和/或活性的受试者获得平均对照数据值或一系列对照数据值；其中比较数据值偏离平均对照数据值或系列对照数据值将指示受试者的免疫功能、状态和/或活性升高或降低。
18.根据权利要求17所述的方法，其中当所述比较数据值低于平均对照数据值或系列对照数据值时，指示免疫功能下降。
19.根据权利要求17所述的方法，其中已知免疫系统功能、状态和/或活性包括已知拥有健康免疫功能、状态和/或活性的人群；其中当比较数据值高于平均对照数据值或系列对照数据值时，指示免疫反应提高。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述免疫反应提高是感染的结果。
21.根据权利要求1-20任一项所述的方法，其中所述免疫系统的功能、状态和活性指示受试者的健康状况。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述健康状况包括检测和/或诊断涉及免疫反应的疾病。
23.一种测定受试者免疫系统发育情况的方法，所述方法包括：
将至少一种金属纳米颗粒与受试者的血液或血液成分混合，形成包括至少一个单位所述检验物质和所述血液至少一分子成分的检验产物；
在规定条件下分析检验产物，测定检验产物的性能，所述检验产物的性能包括平均粒径或颜色或散射光；及
将所述检验产物的性能与从一组正常发育免疫系统人群得到的平均对照数值或系列对照数据值进行比较，其中当所述检验产物的性能值与所述对照数据值或系列值相比异常时，指示所述受试者的免疫系统和/或功能异常。
24.根据权利要求23所述的方法，其中当所述受试者经测定免疫系统发育不良时，进一步包括对所述受试者施用增强免疫的治疗。
25.根据权利要求19所述的方法，其中当所述受试者经测定免疫系统升高时，进一步包括施用抗感染治疗或免疫抑制治疗。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述检验物质和所述血液的分子成分通过非特异性相互作用结合。
27.一种评估受试者免疫系统功能、状态和/或活性的方法，所述方法包括：
将检验物质与受试者的血液或血液成分混合，形成包括至少一个单位所述检验物质和血液或血液成分至少一分子成分的检验产物，其中所述检验物质和所述分子成分通过非特异性相互作用结合；
在规定条件下分析所述检验产物，测定检验产物的性能，所述检验产物的性能包括物理性能、化学性能、光学性能、电性能、磁性能和/或机械性能；及
将所述检验产物的性能与未暴露检验物质的相关性能进行比较，得到比较数据值，其中所述比较数据值指示所述受试者免疫系统的功能、状态和/或活性。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述至少一个单位检验物质包括至少一种金属颗粒。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述检验物质包括至少一种乳胶颗粒。
30.根据权利要求27-29任一项所述的方法，其中所述检验物质包括包被全部或部分病原体组分的材料。
31.根据权利要求27所述的方法，其中所述检验物质包括通过特异性或非特异性相互作用，能够与血液的一种成分相互作用的材料表面。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述材料是载玻片、镀金膜载玻片或塑料表面。
33.根据权利要求27-28任一项所述的方法，其中所述检验物质是金纳米颗粒。
34.根据权利要求27-33任一项所述的方法，其中所述分析步骤包括测定所述检验产物的尺寸。
35.根据权利要求27-33任一项所述的方法，其中所述分析步骤包括观察或测定所述检验产物的颜色和/或光散射性能。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述测定所述检验产物的尺寸包括采用动态光散射法检测检验产物。
37.根据权利要求27-31、33或34任一项所述的方法，其中所述检验产物的性能是平均粒径。
38.根据权利要求27-30或33-37任一项所述的方法，其中所述未暴露检验物质包括至少一种金属颗粒。
39.根据权利要求27-30或33-38任一项所述的方法，其中所述相关性能是平均粒径。
40.根据权利要求27-30或33-39任一项所述的方法，其中所述比较数据值包括检验产物与未暴露检验物质的尺寸比或检验产物相对未暴露检验物质的尺寸百分数。
41.根据权利要求27-40任一项所述的方法，其中所述至少一分子成分包括抗体或补体蛋白。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述抗体是IgG抗体、IgM抗体，或它们的组合。
43.根据权利要求27-42任一项所述的方法，进一步包括从一组具有已知免疫系统功能、状态和/或活性的人群获得平均对照数据值或一系列对照数据值；其中当比较数据值偏离平均对照数据值或系列对照数据值时，指示所述受试者的免疫功能、状态和/或活性升高或降低。
44.根据权利要求43所述的方法，其中已知免疫系统功能、状态和/或活性包括已知拥有健康免疫功能、状态和/或活性的人群；其中当比较数据值高于平均对照数据值或系列对照数据值时，指示免疫反应提高。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述免疫反应提高是感染的结果。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述免疫反应提高是自身免疫性疾病的结果。
47.根据权利要求27-46任一项所述的方法，其中所述免疫系统的功能、状态和活性指示所述受试者的健康状况。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述健康状况包括检测和/或诊断涉及免疫反应的疾病。
49.一种用于开展权利要求1-48任一项所述方法的试剂盒，所述试剂盒包括开展所述方法的仪器，其中所述仪器包括至少一个容纳液体或固体形式所述检验物质的容器及至少一个转移所述样品至所述检验物质的装置。
50.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述至少一个容器包括顶端、底端和位于顶端和底端之间的本体部分，所述容器定义了放置所述检验物质的内室；及(i)其中所述至少一个装置包括量油计，量油计顶端配备盖，所述盖与容器配合，密封所述内室；或(ii)其中所述至少一个装置包括移液管，移液管顶端配备盖，所述盖与所述容器配合，密封所述内室。
51.一种开展权利要求1-48任一项所述方法的试剂盒，所述试剂盒包括开展所述方法的仪器，其中所述仪器包括底座部分和固定在底座上或可拆卸地放置在底座孔内的多个容器，所述底座和多个容器定义了一内室，所述内室具有与底座部分上表面近似对齐的底部。
52.根据权利要求51所述的试剂盒，其中所述多个容器包括用于密封容器的盖。
53.根据权利要求52所述的试剂盒，其中所述盖包括膜。
54.根据权利要求27所述的方法，其中所述检验物质和所述血液的分子成分通过非特异性相互作用结合。
55.一种从动物群体中选择动物用于育种的方法，所述方法包括：
将检验物质与动物群体内多个动物中每个动物的血液或血液成分混合，形成多种检验产物，其中多种检验产物中的每种检验产物包括至少一个单位所述检验物质和所述血液或血液成分至少一分子成分；
在规定条件下分析所述多个检验产物，测定所述多个检验产物中每个检验产物的性能，所述检验产物的性能包括物理性能、化学性能、光学性能、电性能、磁性能和/或机械性能；及
按照所述检验性能确定具有强大免疫系统的动物群体进行育种。
56.根据权利要求55所述的方法，其中按照下述方法确定所述具有强大免疫系统的动物：
将多个动物中一个动物的检验产物的性能与未暴露检验物质的相关性能进行比较，得到比较数据值，其中当比较数据值落在多个检验产物比较数据值的最低两个四分位数之内时，确定其具有强大的免疫反应。
57.一种方法，包括：
将检验物质与受试者的血液或血液成分混合，形成包括至少一个单位所述检验物质和所述血液或血液成分至少一分子成分的检验产物；
在规定条件下分析所述检验产物，测定检验产物的性能，所述检验产物的性能包括物理性能、化学性能、光学性能、电性能、磁性能和/或机械性能；
将所述检验产物的性能与未暴露检验物质的相关性能进行比较，得到比较数据值，其中所述比较数据值指示所述受试者的免疫反应；及
如果比较数据值指示受试者呈阳性免疫反应，从受试者得到一定数量的血液或血液成分。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述数量包括10ml或更多。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述获得血液或血液成分包括从所述受试者分离抗体。
60.根据权利要求57-59任一项所述方法得到的血液或血液成分。
61.一种治疗病原体感染受试者的方法，包括施用有效剂量的权利要求60所述的血液或血液成分。
62.根据权利要求1-48任一项所述的方法，其中所述受试者是怀孕者。
63.根据权利要求1-48和62任一项所述的方法，其中所述检验物质包括两种或多种不同的检验物质。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述两种或多种检验物质包括金属纳米颗粒、伪病原体、病原体或病原体替代或它们的组合。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述检验物质是金纳米颗粒。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述金纳米颗粒是柠檬酸盐配体戴帽金纳米颗粒。
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