CN101148655B - 一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法 - Google Patents
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Abstract
一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，包括如下步骤：a将U251和IN1612系的脑胶质瘤细胞在有血清培养基中常规培养；b采用胰酶消化步骤a培养的细胞液，制作单细胞悬液；c将单细胞悬液移入置有盖玻片的多孔培养板，用含血清的培养基培养；d培养24～48小时后，当细胞贴底后，弃去原培养基，添加相应的含有生长因子的无血清培养基，并每隔3～5天更换一次此种新培养基，所述生长因子为bFGF和EGF，生长因子添加量为20～25ug/ml；e培养10～20天，在盖玻片上即生长出可明显观察到的脑胶质瘤细胞克隆球，继续培养，直到脑胶质瘤细胞克隆球的大小达到实验需要，然后吸除培养基，清洗后进行存贮处理或直接使用。本发明直接在盖玻片上生长贴附细胞克隆球，可满足相应使用需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养细胞克隆球的方法，尤其是指一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法。
背景技术
细胞培养是许多生物学、医学和药学研究中的基本步骤，在肿瘤细胞和干细胞研究中，有时希望在盖玻片上生长克隆球，以方便后续研究(后续研究例如用抗体标记细胞膜、细胞质，或者细胞核之蛋白质等)。目前细胞克隆球培养主要在培养瓶和培养皿中进行，尚无在盖玻片上直接生长贴附的细胞克隆球的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，其能直接在盖玻片上生长贴附的细胞克隆球。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，包括如下步骤：
a.将U251和IN1612系的脑胶质瘤细胞在有血清培养基中常规培养；
b.采用胰酶消化步骤a培养的细胞液，制作单细胞悬液；
c.将步骤b制得的单细胞悬液移入放置有盖玻片的多孔培养板，用含血清的培养基培养；
d.培养24～48小时后，当细胞贴底后，即弃去原培养基，根据需要而添加相应的新培养基，并每隔3～5天更换一次此种新培养基，所述新培养基为含有生长因子的无血清培养基，所述生长因子为bFGF和EGF，生长因子添加量为20～25ug/ml；
e.培养10～20天，在盖玻片上即生长出可明显观察到的脑胶质瘤细胞克隆球，继续培养，直到脑胶质瘤细胞克隆球的大小达到实验需要，然后吸除培养基，清洗后进行存贮处理或直接使用。
本发明的有益效果是：本发明方法简单实用，由于可直接在盖玻片上生长贴附细胞克隆球，从而可满足相应的使用需求，例如：在干细胞理论研究领域，在盖玻片上生长细胞克隆球可直接细胞表面抗原鉴定实验；在新药开发方面，在盖玻片上生长细胞克隆球可进行药物筛选实验。
具体实施方式
本发明提供一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，包括如下步骤：
a.将U251和IN1612系的脑胶质瘤细胞在有血清培养基中常规培养；
b.采用胰酶消化步骤a培养的细胞，制作单细胞悬液；
c.将步骤b制得的单细胞悬液移入放置有盖玻片的多孔培养板，用含血清的培养基培养；
d.培养一定时间后，一般在培养24～48小时后，当细胞贴底后，即弃去原培养基，添加含有生长因子的无血清培养基进行培养，并每隔3～5天更换一次此种无血清培养基，所述生长因子为bFGF和EGF，生长因子添加量为20～25ug/ml；
e.培养10～20天，在盖玻片上即生长出可明显观察到的脑胶质瘤细胞克隆球，继续培养，直到脑胶质瘤细胞克隆球的大小达到实验需要，然后吸除培养基，清洗后即供存贮或直接使用。
上述各步骤的操作均在无菌条件下进行。
若要获得干细胞克隆球，需要用相应的干细胞培养基。
下面以一个实例来进一步对本发明方法作详细描述：
实例
具体培养步骤如下：
a.将脑胶质瘤细胞在有血清培养基中常规培养；
b.用常规酶消化培养的细胞液，制作单细胞悬液；
c.将单细胞悬液移入事先放置有圆形盖玻片的24孔培养板，用含血清的培养基培养，细胞初始密度为1000～10000个/ml，每孔0.3～0.5ml；
d.培养24～48小时后，当细胞贴底，细胞覆盖率达到60％以上时，即弃去原培养基，并添加含有生长因子无血清培养基，3～5天更换一次此种无血清培养基，在培养脑胶质瘤细胞系U251和IN1612时，添加的无血清培养基含有的生长因子为bFGF和EGF两种，添加量为20～25ug/ml；
e.培养约10～20天，即在盖玻片上生长出可明显观察到的脑胶质瘤细胞克隆球，此时，可继续培养，直到脑胶质瘤细胞克隆球的大小达到实验需要，吸掉培养基，用HBSS液清洗3次，即可供存贮或直接使用。当要进行存贮时，先空气干燥10-15小时，然后即可将盖玻片(仍可放在原24孔培养板上)放入-80℃冰箱冻存，以供后续实验用。若直接用于实验，则在空气干燥后即可直接使用，对于需使用活的脑胶质瘤细胞克隆球进行实验时，则不需进行干燥而直接进行后续实验。
Claims (4)
1.一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.将U251和IN1612系的脑胶质瘤细胞在有血清培养基中常规培养；
b.采用胰酶消化步骤a培养的细胞液，制作单细胞悬液；
c.将步骤b制得的单细胞悬液移入放置有盖玻片的多孔培养板，用含血清的培养基培养；
d.培养24～48小时后，当细胞贴底后，即弃去原培养基，根据需要而添加相应的新培养基，并每隔3～5天更换一次此种新培养基，所述新培养基为含有生长因子的无血清培养基，所述生长因子为bFGF和EGF，生长因子添加量为20～25ug/ml；
e.培养10～20天，在盖玻片上即生长出可明显观察到的脑胶质瘤细胞克隆球，继续培养，直到脑胶质瘤细胞克隆球的大小达到实验需要，然后吸除培养基，清洗后进行存贮处理或直接使用。
2.如权利要求1所述的一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，其特征在于：步骤e中，吸除培养基后是采用HBSS液清洗3次。
3.如权利要求1所述的一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，其特征在于：步骤e中，清洗后，还进行空气干燥处理，干燥时间为10～15小时，干燥后即进行存贮或直接使用。
4.如权利要求1所述的一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，其特征在于：各步骤的操作均在无菌条件下进行。
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