CN102226160A - 军团菌分离培养痰消化液 - Google Patents

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朱庆义
胡朝晖
赵利伟
刘洋敏
陈文聪
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Abstract

本发明公开了一种新型的军团菌分离培养痰消化液，既可以用作军团菌分离培养痰液消化，又可用作临床痰常规细菌培养消化液，其组分的质量配比如为二硫苏糖醇2.0g，乙二胺四乙酸0.894g，氯化钾0.4g，磷酸氢二钾3.6g，磷酸二氢钾0.4g，水100g。该痰消化液应用DTT，使粘蛋白中的二硫键断裂，从而降解粘蛋白，使痰液消化。在消化液中添加EDTA能和碱金属、稀土元素和过渡金属等形成稳定的水溶性络合物，避免重金属盐类对军团菌的毒害。缓冲系统由KCl、K2HPO4和KH2PO4等钾盐组成，避免Na+离子对军团菌的抑制作用，从而提高对军团菌的分离培养阳性率。

Description

军团菌分离培养痰消化液
技术领域
这种发明涉及一种痰消化液，具体是一种适合对临床痰标本中军团菌分离培养用的痰消化液。
背景技术
军团菌是引起军团病的重要病原体，特别是嗜肺军团菌感染，是引起军团菌肺炎的主要病原菌，对于军团病的诊断，细菌分离培养是金标准。目前，国内外对临床痰标本细菌分离培养所使用的痰消化液是由英国OXOID公司生产Sputasol(Liquid)SR0233。这种消化液只适用于临床痰标本常规细菌培养，不适用于军团菌培养。因为在该痰消化液中含有抑制军团菌生长的Na+离子，不能用于军团菌分离培养的痰标本的消化。因此，国内外尚没有一种适合军团菌分离培养用的痰消化液。
发明内容
本发明的目的是针对军团菌分离培养中，至今尚无一种用于军团菌分离培养的痰消化液之不足，提供一种成本低、适用于提高军团菌分离培养的痰消化液。本发明解决了军团菌分离培养用的痰消化液，以提高对军团菌分离培养的阳性率。
为了实现以下目的，本发明是一种军团菌分离培养痰消化液，其组分的质量含量如下：二硫苏糖醇1.0～3.0g，最佳为2.0g；乙二胺四乙酸0.890～0.898g，最佳为0.894g；氯化钾0.2～0.6g，最佳为0.4g；磷酸氢二钾3.2～4.0g，最佳为3.6g；磷酸二氢钾0.2～0.8g，最佳为0.4g；水100g。
军团菌分离培养痰消化液的配制方法的步骤如下：首先，配制一份痰消化液作为贮存液，调正pH 7.4，分装小瓶，每瓶4～6mL；然后液配制工作液，将取贮存液1份加无菌蒸馏水95ml混合，制成0.1％浓度；最后，取痰液1mL，加工作液，经37℃水浴，消化10～20min，10000rpm/min，离心5min，取沉淀物供细菌培养或用作DNA提取，供PCR试验。
在新型军团菌痰消化液中，添加二硫苏糖醇(DTT)和乙二胺四乙酸(EDTA)，对军团菌分离培养的痰液进行消化的同时，可以避免重金属盐类对军团菌的毒害；在缓冲系统中采用钾盐，避免Na+离子对军团菌的抑制作用，从而提高了对军团菌属细菌分离培养的阳性率。在军团菌分离培养前对痰标本预先进行消化，再行酸处理和热处理，可减少杂菌污染，提高军团菌分离培养阳性率的痰消化液。
在本发明中包含二硫苏糖醇(1，4～dithiothreitol，DTT)，是一种抗氧化剂，可作为酶或其他带巯基蛋白质的稳定剂，无DNase和RNase活性，用作蛋白质琉基保护剂，用于蛋白质二硫键的裂解和顺序分析，以使痰液消化；乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)，简称EDTA，是一种重要的络合剂，能和碱金属、稀土元素和过渡金属等形成稳定的水溶性络合物，也可用来使有害放射性金属从人体中迅速排泄，起到解毒作用；缓冲系统由氯化钾、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾等钾盐组成，避免Na+离子对军团菌的抑制作用，从而提高对军团菌的分离培养阳性率。
与现有技术相比，本发明军团菌分离培养痰消化液有益效果是：(1)添加二硫苏糖醇(DTT)用于蛋白质二硫键的裂解，促使痰液消化，便于消化后进行酸处理和热处理，减少杂菌污染，有利于分离军团菌目标菌；(2)添加乙二胺四乙酸(EDTA)使有害重金属等形成稳定的水溶性络合物，起到解毒作用，有利于军团菌生长，提高对军团菌属分离培养阳性率；(3)缓冲系统采用钾盐代替钠盐，避免Na+对军团菌生长的抑制作用；(4)该痰消化液对其他非军团菌属细菌没有影响，可同时用于常规细菌培养痰液消化；(5)降低检测成本、经济实用，解决这类试剂长期依赖于进口的困难局面，便于临床推广应用。
本发明之军团菌分离培养痰消化液，既可用于军团菌分离培养痰液消化，避免Na+对军团菌的抑制作用，大大提高军团菌分离培养检出阳性率。又可当作英国OXOID公司进口的Sputasol痰消化液，用于常规痰液消化细菌培养。
具体实施方式
实施例1
1.贮存液配制(DTT～PBS 100ml)：如表1，称取二硫苏糖醇(DTT)2.0g，乙二胺四乙酸(EDTA)0.894g，氯化钾(KCL)0.4g，磷酸氢二钾(K2HPO4)3.6g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.4g加水(H2O)100mL，混合溶解，调正pH 7.4，分装小瓶，每瓶5mL，室温可保持6个月。
表1.军团菌分离培养痰消化液(贮存液100ml量)
 成分   含量(g)
 二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)   2.0
 乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)   0.894
 氯化钾(Potassium chloride，KCl)   0.4
 磷酸氢二钾(Dipotassium hydrogen phosphate，K2HPO4)   3.6
 磷酸二氢钾(Potassium dihydrogen phosphate，KH2PO4)   0.4
 水(H2O)   100
2.工作液配制(0.1％DTT痰消化液)：取贮存液(DTT～PBS)1份(5ml)加无菌蒸馏水95ml混合，使用时新鲜配制，于2～8℃可保存48h。
3.痰液消化步骤：取痰液1mL，加等量工作液(0.1％DTT痰消化液)，37℃水浴，消化10～20min，10000rpm/min，离心5min，取沉淀物供细菌培养或用作DNA提取，供PCR试验。
实施例2
1.贮存液配制(DTT～PBS 100ml)：如表2称取二硫苏糖醇(DTT)1.5g，乙二胺四乙酸(EDTA)0.892g，氯化钾(KCL)0.5g，磷酸氢二钾(K2HPO4)3.2g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.8g加水(H2O)100mL，混合溶解，调正pH 7.4，分装小瓶，每瓶4mL，室温可保持6个月。
表2.军团菌分离培养痰消化液(贮存液100ml量)
 成分  含量(g)
 二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)  1.5
 乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)  0.892
 氯化钾(Potassium chloride，KCl)  0.5
 磷酸氢二钾(Dipotassium hydrogen phosphate，K2HPO4)  3.2
 磷酸二氢钾(Potassium dihydrogen phosphate，KH2PO4)  0.8
 水(H2O)  100
2.工作液配制(0.1％DTT痰消化液)：取贮存液(DTT～PBS)1份(4ml)加无菌蒸馏水95ml混合，使用时新鲜配制，于2～8℃可保存48h。
3.痰液消化步骤：取痰液1mL，加等量工作液(0.1％DTT痰消化液)，37℃水浴，消化10～20min，10000rpm/min，离心5min，取沉淀物供细菌培养或用作DNA提取，供PCR试验。
实施例3
1.贮存液配制(DTT～PBS 100ml)：如表3称取二硫苏糖醇(DTT)3.0g，乙二胺四乙酸(EDTA)0.896g，氯化钾(KCL)0.3g，磷酸氢二钾(K2HPO4)4.0g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g加水(H2O)100mL，混合溶解，调正pH 7.4，分装小瓶，每瓶6mL，室温可保持6个月。
表3.军团菌分离培养痰消化液(贮存液100ml量)
 成分  含量(g)
 二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)  3.0
 乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)  0.896
 氯化钾(Potassium chloride，KCl)  0.3
 磷酸氢二钾(Dipotassium hydrogen phosphate，K2HPO4)  4.0
 磷酸二氢钾(Potassium dihydrogen phosphate，KH2PO4)  0.2
 水(H2O)  100
2.工作液配制(0.1％DTT痰消化液)：取贮存液(DTT～PBS)1份(6ml)加无菌蒸馏水95ml混合，使用时新鲜配制，于2～8℃可保存48h。
3.痰液消化步骤：取痰液1mL，加等量工作液(0.1％DTT痰消化液)，37℃水浴，消化10～20min，10000rpm/min，离心5min，取沉淀物供细菌培养或用作DNA提取，供PCR试验。

Claims (4)

1.一种军团菌分离培养痰消化液，其特征在于，其组分的质量配比如下：
2.根据权利要求书1所述的军团菌分离培养痰消化液，其特征在于，其组分的质量配比如下：
Figure FSA00000497280800012
3.一种根据权利要求书1所述的军团菌分离培养痰消化液的应用，其特征在于，用作军团菌分离培养痰液消化，或用作临床痰常规细菌培养消化液。
4.一种根据权利要求书1所述的军团菌分离培养痰消化液的配制方法，其特征在于步骤如下：首先，配制一份痰消化液作为贮存液，调正pH7.4，分装小瓶，每瓶4～6mL；然后液配制工作液，将取贮存液1份加无菌蒸馏水95ml混合，制成0.1％浓度；最后，取痰液1mL，加工作液，经37℃水浴，消化10～20min，10000rpm/min，离心5min，取沉淀物供细菌培养或用作DNA提取，供PCR试验。
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