CN105296508A - 大肠杆菌锰氧化工程菌及在环境激素降解中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌锰氧化工程菌及在环境激素降解中的应用，通过构建了大肠杆菌Top10表面展示芽孢衣蛋白CotA的基因工程菌株，使大肠杆菌工程菌获得了锰氧化活性，该工程菌株可将Mn²⁺氧化为高价锰离子，锰氧化活性稳定，产生的锰氧化物为MnO₂、MnCO3、KMnO4，菌体、锰氧化物混合体系可迅速、完全的降解环境激素，并且降解产物毒性消失。利用本发明的菌株及其产生的混合体系可用于环境修复等领域。

Description

大肠杆菌锰氧化工程菌及在环境激素降解中的应用

技术领域

本发明涉及应用微生物技术领域及环境修复领域，具体涉及一种大肠杆菌锰氧化工程菌，还涉及该基因工程菌在环境激素降解中的应用。

背景技术

许多种微生物都能快速氧化Mn(Ⅱ)成锰氧化物，生物锰氧化物较化学合成氧化锰矿物结晶弱，粒径小，价态高，结构中八面体空穴多，比表面积大，具有比化学合成锰氧化物更强的吸附氧化和光还原溶解特性，生物锰氧化物能吸附多种重金属，氧化低价态重金属离子，并降解乙炔基雌二醇等有机污染物，是具有广泛应用前景的环境材料。

CotA蛋白广泛存在在多种芽胞杆菌中，其与多铜氧化酶具有许多相似之处，多铜氧化酶家族包含抗坏血酸氧化酶、血浆铜蓝蛋白、漆酶、锰氧化酶和其他酶类。漆酶是能够氧化多种酚类、二胺类的多酚氧化酶类，不同的漆酶底物专一性不同，细菌漆酶具有耐热性的特点，并且在中性和碱性条件下都具有活性。而真菌漆酶通常在酸性条件下具有活性。

内分泌干扰物(endocrinedisruptingchemicals,EDCs)是指能够干扰生物或人体内天然激素的合成分泌运输结合反应和代谢等，从而影响生物或人的生殖神经免疫等功能的外源性化学物质，EDCs毒理学关注阈值低，健康危害大，在污水厂进出水、地表水甚至饮用水中均有报道检出，近年来引起广泛关注。双酚A(bisphenol，BPA)，炔雌醇(17α-Ethinylestradiol，EE2)和壬基酚(4-n-nonylphenol，NP)被认为是中国污水处理厂二级出水中生态风险高应优先控制的EDCs。

壬基酚分子式为C₉H₁₉C₆H₄OH，相对分子量为220。NP是憎水性物质，在水中溶解度为5.43mg/L，环境中的壬基酚是壬基酚聚氧乙烯醚(NPnEO)分解或降解产生的，NPnEO进入环境后在生物作用下，逐步降解形成短链产物NP2EO、NP1EO和最稳定的产物NP。

NP具有亲油性，这造成了它比较容易吸附于水体底部的淤泥上并被浮游生物摄取,在生物体内积累，并通过食物链的循环进入人体。其在人体内具有雌激素效应和其他的生物毒性，对生物体产生的不良作用包括影响内分泌、影响生殖和发育、影响免疫及促癌作用等。

在NP的生物降解性方面，Staples等对NP的降解进行了实验室内的研究结果证明，即使是在有氧情况下NP也比NPnEO难于降解，NP结构上的苯环和它的长链烷基造成了NP的难降解性，但NP苯环上的烷基和羟基，是活化苯环的给电子基团，微生物降解NP的可能途径是苯酚途径的苯环开环和烷基苯途径的壬烷基断链，但关于NP的降解途径与机制目前没有定论。

双酚A是合成聚碳酸酯、环氧树脂及聚砜等的重要原料，分子式为C₁₅H₁₆O₂，分子量为228，不溶于水，主要用于有机合成生产各种高分子材料，是一种人工合成的化学物质，在自然界中原本不存在，由于现代社会化工产品的广泛应用，各种家居用品及医药用品中均能发现BPA的存在。

BPA具有雌激素活性，能干扰人体内正常激素的分泌，从而影响生殖功能，同时对脊椎动物及哺乳类动物均有较严重的负面效应。目前降解BPA的方法包括吸附法，生物法，电化学法和光催化氧化法，其中生物法应用最广泛，产生的副作用最小。Spivak、Lobus等用纯的BPA降解菌进行试验，揭示了BPA可能的降解途径，85％的BPA经由2,2-二(4-羟苯基)-2-丙醇，转化为4,4-二羟基-A-甲基苯乙烯，再转化为4-羟基苯甲酸+CO2+Cell+Grouth，15％的BPA经由2,2-二(4-羟苯基)–1,2-丙二醇，转化为4,4-二羟基-A-甲基苯乙烯，再转化为4-羟基苯甲酸和2-对羟苯基-2-酮基-1-乙醇。

EE2是一种人工合成的雌激素，是避孕药的主要成分，分子式为C₂₀H₂₄O2，分子量为296，不溶于水，溶于乙醇，乙醚等。

EE2具有极强的雌激素活性，刘宝敏等研究证明，EE2可导致美国红鱼幼鱼个体异常，甚至死亡，同时对美国红鱼的肥满度！肾脏指数和肝胰脏指数均有影响。Purdom等人发现了鱼类的雌雄同体现象，其中EE2是出现该现象的主要原因。对于EE2的治理，目前使用的方法有活性炭吸附，光降解，臭氧氧化，二氧化锰氧化，生物降解等。其中生物降解中，通过活性污泥的作用，EE2浓度下降并产生亲水性物质。

环境激素的降解途径可能受到污染物结构、微生物特性及环境条件等多方面因素的影响。比较重要的几个因素是氧气，温度与pH。Hesselsoe等实验证明,NP在好氧条件下才能降解。而Tanghe等的实验指出在20℃以上NP的降解才能达到一个较快的速率。Ying等研究表明BPA厌氧条件下几乎不降解。

这几种典型酚类环境激素污染物具有疏水性、脂溶性及可降解性差等特点，痕量浓度的污染物可通过食物链经生物富集达到较高的浓度水平，从而给人体健康带来一定的影响。同时环境激素是激素类物质，它可以通过与人体内激素的竞争，与激素受体结合,从而影响其表达，扰乱人体的内分泌系统，改变体内激素水平，人如果长期处于内分泌紊乱的状态,将会导致失眠头痛,月经不调，皮肤衰老等症状。

目前对环境激素的生物降解研究主要集中于某些菌体产生的特殊酶类对该类物质的作用，但有关氧化物与漆酶共同作用降解的研究较少，且已有的技术仅能使环境激素转化为较低毒性的物质，不能够完全脱毒，仍存在一定的安全问题。处理过程中，随着酶的活性降低，降解效果也会产生影响。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种大肠杆菌锰氧化工程菌，通过构建了大肠杆菌Top10表面展示芽孢衣蛋白CotA的基因工程菌株，使大肠杆菌工程菌获得了锰氧化活性。

本发明另一个目的在于提供了一种大肠杆菌锰氧化工程菌在环境激素降解中的应用。利用细菌表面展示的CotA蛋白漆酶活性及培养过程中产生的锰氧化物降解环境激素，将环境激素无毒化，可解决处理环境激素过程中的毒性残留及降解效果的持效性的问题，从而达到修复环境的作用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种大肠杆菌锰氧化工程菌，通过以下步骤构建得到：

(1)人工合成cotA基因，具体如下：

>cotA

ATGAACCTAGAAAAATTTGTTGACGAGCTGCCAATTCCAGAAGTCGCAGAGCCCGTC

AAAAAAAACCCAAGACAAACGTATTATGAAATCGCTATGGAGGAGGTGTTCCTCAAA

GTTCATAGAGATCTGCCCCCAACCAAGCTATGGACCTATAATGGCAGTTTGCCGGGTC

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AGAGGTTTACGAATACCCTAATCATCAGCAAGCATGCACATTGTGGTATCACGATCAT

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CAGATGCGTTTGAAAAATCACTCGAATTACCGAAAGATGAATATGATATCCCTTTAAT

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CTTACGAAAACCAAACGATTGTTTTAAAAAATACGGCAGGCTGCGGTCAGGAAGTCA

ATCCAGAAACAGATGCGAACATTATGCAATTTAAAGTCACTCGACCGCTCAAAGGAA

GAGCAGCTAAAACATTACGTCCGATCTTCAAACCACTTCCACCACTCCGGCCGAGCC

GAGCTGATAACGAGCGAACGCTGACCCTTACTGGCACACAAGATAAATATGGGCGCC

CTATTTTATTACTAGATAACCAGTTTTGGAATGATCCTGTTACGGAAAATCCTCGACTT

GGCAGTGTAGAGGTATGGAACATCGTTAACCCAACAAGGGGCACACACCCTATTCAT

TTACATCTTGTTCAATTTCGGGTGATTGATAGAAGACCATTCGATACAGACATCTATC

AATCAACAGGTGAAATCGTGTACACGGGACCAAATGAAGCGCCTCCTTTGCATGAAC

AAGGATACAAGGATACAATTCAGGCGCATGCCGGTGAAGTCATTCGCATCATCGCTC

GGTTTGTCCCATATAGCGGACGATATGTGTGGCATTGTCACATATTAGAACACGAGG

ATTATGACATGATGCGGCCGATGGATATTATTTAG

(2)将步骤(1)合成的cotA基因和质粒pMB102(pTrcHisC-inaQN-gfp，Improvedphosphatebiosorptionbybacterialsurfacedisplayofphosphate-bindingproteinutilizingicenucleationprotein.FEMSMicrobiolLett2009,299,(1),44-52.)用限制性内切酶BamHI和EcoRI进行酶切，回收所需片段，在T4连接酶作用下进行酶连，得到重组质粒pMB500(图2)，重组质粒pMB500转化大肠杆菌DH5α，将转化子进行快检和PCR扩增验证，分别PCR扩增inaQ-N和cotA基因片段，将验证正确的质粒转化大肠杆菌Top10菌株，重组菌株命名为MB500。

经western-blot，流式细胞仪，荧光显微镜等技术验证，证明CotA已被转运并锚定在细胞表面。

表面展示CotA蛋白的大肠杆菌重组菌株，在加入至终浓度为1mmol/L氯化锰溶液的lept培养基中，30℃条件下培养5天。经LBB法测定后发现该重组菌株具备了锰氧化活性。一种大肠杆菌锰氧化工程菌在环境激素降解中的应用，其应用过程如下：

MB500工程菌株在30℃条件下培养5天，直至产生锰氧化物，将该菌体及锰氧化物混合物用于降解环境激素。

具体的培养方法如下：

挑取单菌落接种到含200mLlept培养基的500ml三角瓶中(1Llept培养基含0.5g酵母膏，0.5g络蛋白氨基酸，0.9g葡萄糖，0.0555g氯化钙，2.383gHepes，1ml微量元素；1L微量元素含10mg五水硫酸铜，44mg七水硫酸锌，20mg六水氯化钴，13mg二水钼酸钠)，加入Mn²⁺离子(终浓度1mmol/L)和浓度为0.1mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导，在30℃摇床连续培养5天，沉淀物用PBS溶液(pH7.4)连续洗三遍，MB500与锰氧化物混合物离心(5000r/min，5min)收集，沉淀用醋酸钠溶液悬浮。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明首次构建了大肠杆菌Top10表面展示芽孢衣蛋白CotA的基因工程菌株，使大肠杆菌工程菌获得了锰氧化活性，该工程菌株可将Mn²⁺氧化为高价锰离子，锰氧化活性稳定，产生的锰氧化物为MnO₂、MnCO3、KMnO4，菌体、锰氧化物混合体系可迅速、完全的降解环境激素，并且降解产物毒性消失。

2.可以通过回收菌株，再次培养达到反复利用的目的，节省治理污染的成本。

3.相比单纯只用漆酶蛋白或锰氧化物进行降解，本发明将两者结合获得了更强的降解能力，且降解范围广泛，可降解底物广泛及应用环境广泛。

4.不需要其他辅助因子参与降解过程。

5.表面展示的漆酶固定于细胞外表面，无须额外的蛋白纯化和固定化操作，省略了操作步骤，漆酶表面展示后能够提高它的热稳定性以及对各种极端条件和有机试剂的抗性，相对于游离态的漆酶具有更高的实用价值。

附图说明

图1为是CotA和其他锰氧化酶的保守铜离子位点分析示意图。

图2为表面展示重组质粒pMB500的构建示意图。

图3为质粒pMB500PCR电泳结果示意图。

图4为MB500细胞各组分Westernblot分析示意图

图5为重组菌MB500的流式细胞仪分析结果示意图。

图6为重组菌MB500荧光显微镜观察结果示意图。

图7为LBB法测定锰氧化活性示意图。

图8为GC/MS检测降解产物示意图。

图9为不同初始浓度下三种降解材料对环境激素降解的影响示意图。

图10为环境中可能对降解产生影响的因素及产物毒性的分析示意图。

具体实施方式

实施例1：

A56锰氧化菌株中扩增芽孢衣蛋白cotA基因，并分析CotA蛋白功能。

申请人在实验室已分离得到的具有高锰氧化活性的芽胞杆菌A56，从中进行cotA基因的扩增。A56中cotA的基因共有1530bp，序列为SEQIDNO.1所示。

用DNAMAN对A56的CotA氨基酸序列进行分析，CotA由509个氨基酸组成，蛋白质分子量为58.6kDa，等电点为6.12。将氨基酸序列通过NCBI进行保守结构域的分析，得到结果显示，CotA中含有三个保守的铜离子结合位点，与细胞色素C氧化酶亚基结构域相似，并且与多种多铜氧化酶同源。因此CotA是一种多铜氧化酶。并且不含信号肽序列和跨膜结构阈。

将CotA中的铜离子结合位点与已报道的锰氧化酶的铜离子结合位点进行对比，结果如图1，CotA与锰氧化酶都具有保守的铜离子结合位点，并且有保守的组氨酸，每个结合位点中组氨酸之间的距离也是保守的。

实施例2：

大肠杆菌锰氧化工程菌的构建，步骤如下：

人工合成A56菌株的cotA基因，基因序列为SEQIDNO.1所示，将cotA片段和质粒pMB102(pTrcHisC-inaQN-gfp)(Improvedphosphatebiosorptionbybacterialsurfacedisplayofphosphate-bindingproteinutilizingicenucleationprotein.FEMSMicrobiolLett2009,299,(1),44-52.)用限制性内切酶BamHI和EcoRI进行酶切，回收所需片段，在T4连接酶作用下进行酶连，得到重组质粒pMB500，如图2，pMB500转化大肠杆菌DH5α，将转化子进行快检和PCR扩增验证，分别PCR扩增inaQ-N(inpN1,TGCCATGGATCTCGAVAAGGCGTTGGTGC；inpN2,TAAGATCTGGTCTGCAAATTCTGCGGCGTCG)和cotA基因(cotF2，5'GCGGGATCCATGAACCTAGAAAAATTTG3'；cotR2，5'CTAGAATTCCTAAATAATATCCATCGG3')片段，将验证正确的质粒转化大肠杆菌Top10菌株，重组菌株命名为MB500，即本发明所述的大肠杆菌锰氧化工程菌。

western-blot验证

(1)转膜，SDS-PAGE电泳完毕后，切除浓缩胶，将分离胶浸润在转膜缓冲溶液中，电转移1h。用去离子水漂洗NC，随后以封闭液封闭NC膜，4℃封闭过夜；

(2)杂交：将NC膜于TBST中漂洗3次后，转入含一抗杂交液的90cm平皿中，水平摇床上作用1h；TBST洗涤15min1次，5min2次；将膜转入新90cm的平皿中加入二抗杂交液，水平摇床上作用1h；以TBST振荡洗涤5次，每次2～3min；

(3)显色：按照DAB显色试剂盒使用说明书，将膜与DAB试剂反应，进行显色。

结果图4所示，CC为细胞质组分；CW为细胞壁组分；WC为全细胞裂解液。全细胞裂解液中的蛋白含量最多，其次是细胞质组分，最后是细胞壁组分。说明表面展示CotA的重组菌，能够将一部分CotA展示在细胞表面，但在细胞质中含有大量的CotA。

流式细胞仪验证，收集培养过夜的菌体，用PBS(pH7.4)洗涤3次，在含有芽胞衣蛋白A的多克隆抗血清(1：100)的1％BSA-PBS中避光冰浴1.5h，离心收集菌体(8000r/min2min)，PBS(pH7.4)洗涤3次；用含有Cy5标记的羊抗兔IgG二抗(1：1000)的1％BSA-PBS中避光冰浴1.5h，离心收集菌体(8000r/min2min)；用PBS(pH7.4)洗涤3次，并用PBS(pH7.4)重悬。将Cy5标记的细胞通过流式细胞仪在激发波长为635nm下检测Cy5荧光。

流式细胞仪分析的结果表示为检测到荧光强度大于等于10的Cy5标记荧光细胞数占待测细胞总数的百分比，即成功表面展示的重组菌占菌株总数的百分比。每组实验的待测细胞数为100,000。

结果图5所示，A为对照菌株，B为重组菌株。对照菌株几乎没有荧光活性，而重组菌株在Cy5的激发波长下有70.88％可以发出荧光，并且平均荧光强度达到467.97，说明CotA已经成功的锚定在细胞的表面，并且展示效率较高。

荧光显微镜验证，以大肠杆菌Top10为对照菌株，将对照菌株和重组菌MB500通过CotA一抗和Cy5二抗杂交，制成水玻片，进行荧光显微镜观察。

结果图6所示，A为对照菌株，B为重组菌株，对照菌株没有荧光，而重组菌株MB500表面有强烈的红色荧光，说明CotA已被转运和锚定在细胞的表面。

以上实验证明，证明CotA已被转运并锚定在细胞表面。

实施例3：

MB500基因工程菌的制备方法：

使用LB培养基进行重组菌的传代培养(1LLB培养基：酵母膏5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，pH7.0-7.2。)。挑取单菌落接种到含LB培养基的5mlPA瓶中，37℃培养过夜。

实施例4：

MB500基因工程菌锰氧化活性的测定，其步骤如下：

挑取MB500单菌落接种到含200mLLept培养基的500ml三角瓶中，待生长至对数期后，加入终浓度为1mmol/L氯化锰终和浓度为0.1mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导，30℃条件下培养5天。此时MB500的全细胞漆酶活性为19.1U/mL，利用LBB法测定后，换算得到锰氧化物浓度为75.4μM。

将培养物取1mL菌液，离心去上清，用10mMHEPES(50μL)溶液悬浮菌体，按1:5的比例加入250μLLBB(Leukoberbelinblue)试剂，在暗处反应30min后，观察液体颜色变化。

结果如图7。作为对照Top10基本上没有颜色变化，而重组菌株MB500的培养物沉淀在与LBB反应后显现出深蓝色，表明MB500具有锰氧化活性。

MB500的锰氧化活性的效果可通过高锰酸钾标准曲线进行测定(高锰酸钾标准曲线制作方法：1.精确称取KMnO4，制备0.01M/L的KMnO4，煮沸30min，静置一周后，用草酸钠反滴定，记录其终浓度。2.根据制备的KMnO4的浓度，稀释至100，150，200，250，300，350μM/L。取这六个浓度的KMnO4溶液各50μL，再分别加入0.04％LBB溶液250μL(1：5，V：V)于暗处常温反应约30min。3.用分光光度计测各反应液在620nm下的吸光值，以KMnO4的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，以LBB作为空白对照。)具体步骤为：将培养物取1mL菌液，离心去上清，用10mMHEPES(50μL)溶液悬浮菌体，按1:5的比例加入250μLLBB(Leukoberbelinblue)试剂，在暗处反应30min后，离心(12000r/min,30s)，取上清测定吸光值(620nm)。

所述的lept培养基的配方为：

1Llept培养基含0.5g酵母膏，0.5g络蛋白氨基酸，0.9g葡萄糖，0.0555g氯化钙，2.383gHepes，1ml微量元素；1L微量元素含10mg五水硫酸铜，44mg七水硫酸锌，20mg六水氯化钴，13mg二水钼酸钠。

实施例5：

一种大肠杆菌锰氧化工程菌在环境激素降解中的应用，其应用过程如下：

挑取单菌落接种到含200mLlept培养基的500ml三角瓶中(1Llept培养基含0.5g酵母膏，0.5g络蛋白氨基酸，0.9g葡萄糖，0.0555g氯化钙，2.383gHepes，1ml微量元素；1L微量元素含10mg五水硫酸铜，44mg七水硫酸锌，20mg六水氯化钴，13mg二水钼酸钠)，待生长至对数期，加入终浓度为1mmol/L氯化锰和终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导，30℃条件下培养5天沉淀物用PBS溶液(pH7.4)连续洗三遍，MB500与锰氧化物混合物离心(5000r/min，5min)收集，沉淀用醋酸钠溶液悬浮。

所述的锰氧化物经X射线衍射分析(XRD)测定，其成分为MnO₂、MnCO3、KMnO4的混合物。

降解实验中环境激素浓度为2ppm、锰氧化物初始浓度为65ppm，漆酶浓度800U/mL，反应在0.1M醋酸钠缓冲液进行，在25℃，pH3.0条件下，反应60min后，GC/MS检测结果如图8所示，图8A为MB500菌体及其锰氧化物混合物降解BPA后的质谱图，图8B为MB500菌体及其锰氧化物混合物降解EE2后的质谱图，图8C为MB500菌体及其锰氧化物混合物降解NP后的质谱图。结果显示这三种环境激素已完全降解，线虫毒性实验检测发现反应产物已完全无毒。

比较三种降解材料MBMN，MN，MB的降解能力：

挑取MB500单菌落接种到含200mLLept培养基的500ml三角瓶中，待生长至对数期后，加入终浓度为1mmol/L氯化锰终和浓度为0.1mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导，30℃条件下培养5天。然后收集菌体，一部分用PBS洗涤三次后重悬在乙酸钠缓冲液中，这部分是MB500和锰氧化物的混合体物，命名为MBMN(以下同)。

另一部分用乙酸钠洗涤后用压力破碎仪在15000psi的压力下破碎六次，再次洗涤移除菌体和细菌残留物后，这部分只剩锰氧化物，命名为MN(以下同)。

第三部分是MB500在不含锰离子的LEPT培养基中培养8小时后，收集菌体，用PBS洗涤后重悬在乙酸钠中。这部分命名为MB(以下同)。

利用三种环境激素不同的初始浓度分别进行了实验。分别选取了0.1，0.2，0.5，0.8，1，2ppm等五个浓度，在25℃，pH3.0条件下反应1h，。降解率通过初始浓度Co和终浓度Cf的差值计算得来。降解率＝(％)＝[(C_O-C_f)/C_O]×100。所有的实验在同样条件下重复三次，然后计算平均值。

三种材料，在实验环境中的浓度分别为：锰氧化物(MN)初始浓度为65ppm，漆酶活性800U/mL(MB),MBMN初始浓度为前两者结合。

结果如图9所示，MB为MB500菌体，MN为MB500产生的锰氧化物，MBMN为MB500菌体和锰氧化物混合物，图9A显示三种不同的材料对PBA不同初始浓度的降解率；图9B显示三种不同的材料对EE2不同初始浓度的降解率；图9C显示三种不同的材料对NP不同初始浓度的降解率。结果显示在0.1-2ppm的浓度范围内，三种EDCs都可以被三种降解材料分别有效移除。三种环境激素初始浓度为0.1ppm时，三种降解材料对环境激素的降解率都达到100％，当初始浓度上升至2ppm时，MB，MBMN，MN对BPA的降解效率分别为98％，98％，85％，对EE2的降解效率分别为84％，89％，81％，对NP的降解效率分别为95％，95％，86％。对三种环境激素降解效果最好的是MBMN，最低可降解0.1ppm的环境激素，降解率达到100％。

实施例6：

对该发明实际应用过程中降解效率可能产生影响的因素，模拟不同水体条件进行分析，对降解后的产物使用秀丽隐杆线虫作为毒性评估生物评估最终产物毒性，其分析过程如下：

温度和pH对降解材料MBMN降解效率的影响：实验过程中采用的环境激素的初始浓度均为2ppm，降解材料为800U/mL漆酶活性的细菌及其产生的锰氧化物(锰氧化物浓度为65ppm)。测试的pH值为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0(pH测试时温度为25℃)，温度为15℃，25℃，35℃，45℃，55℃(测试温度时pH为3.0)，所有实验反应时间为1h。降解率通过初始浓度Co和终浓度Cf的差值计算得来。降解率＝(％)＝[(C_O-C_f)/C_O]×100。所有的实验在同样条件下重复三次，然后计算平均值。

结果如图10所示，图10A为不同pH条件下的降解效果，在pH3.0时具有最大的降解效率，60分钟反应降解率均接近100％，随着pH的升高，降解率逐渐降低，当pH达到8.0时，降解率接近0，pH为4,5,6,7时其对BPA的降解率分别为79％，62％，51％，41％；对EE2的降解率分别为73％，51％，41％，33％；对NP的降解率分别为76％,62％,47％,35％。这说明偏酸性的pH环境对该材料的活性都是必须的，图10B为不同温度条件下的降解效果，MBMN在25-55℃和pH3.0的条件下，60分钟可以都可以移除99％以上的EDCs。说明该材料较能适应温度的变化。在25℃时具备最大的降解效率，可以去除98％以上的环境激素，15℃时降解效率最低，对BPA，EE2,NP的降解率分别为85％，79％，83％。

测试了降解产物对模式生物秀丽隐杆线虫的毒性，作为生物安全评估的参考数据，环境激素曾被报道对秀丽隐杆线虫的生殖力有负面影响(Hoss,S.,Weltje,L.2007.Endocrinedisruptioninnematodes:effectsandmechanisms.Ecotoxicology,16(1),15-28.)。所以这里使用多代实验来检测降解产物对线虫的生殖力影响。具体实验方法为：将L4幼虫时期线虫转移至特定浓度的待测溶液中暴露一段时间，然后置于正常的NGM培养基(1LNGM培养基含：NaCl3g，琼脂17g，蛋白胨2.5g，加水至1L,120℃高压蒸气灭菌50分钟。冷却至55℃的时候加入以下成分：1MCaCl₂1ml，2mg/ml尿嘧啶1ml，10mg/ml胆固醇(酒精溶解)0.5ml，1M磷酸钾缓冲液，pH6.025ml，1MMgSO₄1ml)上培养，每隔12h移一次盘，直至该线虫产完所有的卵，记录其孵化出的所有后代数目作为后代数目指标。实验中使用的环境激素浓度均为1ppm，降解材料为800U/mL漆酶活性的细菌及其产生的锰氧化物(锰氧化物浓度为65ppm)

control组为无污染的水；MBMN组为无污染水中投入MBMN。

结果如图10C所示，未经过MBMN处理的环境激素均对线虫的生殖力产生损害，经BPA，EE2，NP溶液处理后的线虫后代数分别下降至70,85,51，而经MBMN处理相同浓度的环境激素后，残留产物对线虫均不再具备激素活性，线虫后代数目与对照接近，对照实验组为无污染的纯净水即图中control，实验组为MBMN处理BPA，EE2，NP后的产物溶液，图中为BPA降解产物，EE2降解产物，NP降解产物，说明本材料可以有效去除生态中的高浓度环境激素，消除其负面影响。

SEQUENCELISTING

<110>华中农业大学

<120>大肠杆菌锰氧化工程菌及在环境激素降解中的应用

<130>大肠杆菌锰氧化工程菌及在环境激素降解中的应用

<160>1

<170>PatentInversion3.1

<210>1

<211>1530

<212>DNA

<213>芽孢杆菌

<400>1

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Claims (8)

1.一种分离的基因，其序列为SEQIDNO.1所示。

2.包含有权利要求1所述基因的重组质粒。

3.包含有权利要求1所述基因或权利要求2所述重组质粒的基因工程菌。

4.一种大肠杆菌锰氧化工程菌，其制备步骤如下：

（1）人工合成cotA基因，所述基因序列为SEQIDNO.1所示；

（2）将步骤（1）合成的cotA基因和质粒pMB102用限制性内切酶BamH和EcoR进行酶切，回收所需片段，在T4连接酶作用下进行酶连，得到重组质粒pMB500；

（3）重组质粒pMB500转化大肠杆菌DH5α，将转化子进行快检和PCR扩增验证，将验证正确的质粒转化大肠杆菌Top10菌株，重组菌株命名为MB500，即得到一种大肠杆菌锰氧化工程菌。

5.权利要求4所述的大肠杆菌锰氧化工程菌在降解环境激素中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的环境激素为双酚A。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的环境激素为炔雌醇。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的环境激素为壬基酚。