CN105176925B

CN105176925B - 一种免疫细胞无血清培养基及其用途

Info

Publication number: CN105176925B
Application number: CN201510624087.4A
Authority: CN
Inventors: 曲宝赤
Original assignee: Uniom Hengye Biological Technology (beijing) Co Ltd
Current assignee: Youkang Houde Biotechnology (Beijing) Co.,Ltd.
Priority date: 2015-09-26
Filing date: 2015-09-26
Publication date: 2018-08-28
Anticipated expiration: 2035-09-26
Also published as: CN105176925A

Abstract

本发明涉及生物、医学领域，具体地是涉及一种免疫细胞的无血清培养基及其制备和用途。本发明的无血清培养基的主要成分为：地塞米松、人转铁蛋白、胰岛素、胆固醇、过氧化氢酶、亚硒酸钠和二巯基乙醇。本发明的无血清培养基对人体安全，能提高CIK细胞增殖速度和稳定细胞CD3⁺CD56⁺，并且有成分简单、性状稳定、诱导CIK增殖效率高、CD3⁺CD56⁺的阳性比例高，培养获得的CIK细胞质量稳定的优点。

Description

一种免疫细胞无血清培养基及其用途

技术领域

本发明涉及生物、医学领域，具体地是涉及一种免疫细胞的无血清培养基及其用途。

背景技术

肿瘤过继免疫治疗(adoptive immunotherapy，ACI)是指通过向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。它包括非特异性激活和特异性激活的效应细胞，前者是采用非特异性刺激因子(IL-2、干扰素)刺激前体效应细胞，使其活化为具有抗肿瘤活性的效应细胞，如LAK细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer cells，CIK)等；特异性激活的效应细胞是指采用肿瘤抗原作刺激物所诱导的抗肿瘤效应细胞，如树突状细胞(DC)，细胞毒T淋巴细胞(CD8⁺细胞)等。ACI可通过体外扩增筛选出高活性的免疫效应细胞，将其转入宿主体内并建立长期的特异性抗肿瘤免疫效应，克服了疫苗免疫治疗的诸多缺陷，具有良好的应用前景。

CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-γ，IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3⁺CD56⁺细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点。

传统对CIK体外扩增的方法为从人外周血内提取单个核细胞，体外添加干扰素、CD3、白介素2进行诱导培养连续14天。传统方法细胞增殖慢、倍增时间长、细胞CD3⁺CD56⁺阳性率比例不稳定。并且由于采用含有动物或人血清的细胞培养基培养，而动物或人血清中含有病原体或不确定物质，会对培养细胞带来危险或不确定的危害。并且传统培养基成分不稳定无法进行后期质量控制，无法在工业上大规模生产。

因此亟需开发能克服上述缺陷的无血清培养基。

发明内容

本发明将提供一种对人体安全的，能提高CIK细胞增殖速度和稳定细胞CD3⁺CD56⁺的培养基。

本发明提供一种免疫细胞细胞培养基，其特征在于包括如下成分：地塞米松、人转铁蛋白、胰岛素、胆固醇、过氧化氢酶、亚硒酸钠和二巯基乙醇。

优选的，其成分含量如下：地塞米松0.001～0.005mg/L、人转铁蛋白5～50mg/L、胰岛素8-20mg/L、纯化人转铁蛋白1-30mg/L、胆固醇20-60mg/L、过氧化氢酶20-50mg/L、亚硒酸钠17.3-35mg/L、1％二巯基乙醇溶液0.35-1.0ml/L。

最优选的，各成分含量为：地塞米松0.003mg/L、人转铁蛋白30mg/L、胰岛素10mg/L、纯化人转铁蛋白5mg/L、胆固醇40mg/L、过氧化氢酶35mg/L，亚硒酸钠17.3mg/L和1％二巯基乙醇溶液0.7ml/L。

进一步地本发明还提供一种培养基，还包括如下成分：L-精氨酸、CuSO₄·5H₂O、L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、Ni(NO₃)₂·6H₂O、L-谷氨酰胺、ZnSO₄·7H₂O、甘氨酸、CoCl2·6H₂O、L-组氨酸、NaSiO₃·9H₂O、L-异亮氨酸、Na₃VO₄·12H₂O、L-赖氨酸盐酸盐、SnC1₂·2H₂O、L-蛋氨酸、Na₂SeO₃、L-苯丙氨酸、FeSO₄·7H₂O、L-脯氨酸、葡萄糖、L-丝氨酸、维生素C、L-苏氨酸、对羟基苯甲酸、L-色氨酸、丙酮酸钠、L-缬氨酸、亚油酸、L-亮氨酸、β-巯基乙醇、二水L-酪氨酸二钠、乙醇胺、L-胱氨酸二盐酸。

优选的，其含量的成分如下，所述含量单位为mg/L：L-精氨酸100～300、CuSO₄·5H₂O0.0005～0.005、L-天门冬酰胺25～75、L-天门冬氨酸10～30、L-谷氨酸10～30、Ni(NO3)2·6H2O 0.00002～0.0002、L-谷氨酰胺200～500、ZnSO₄·7H₂O0.06～0.6、甘氨酸5～15、CoCl₂·6H₂O 0.001～0.008、L-组氨酸10～30、NaSiO₃·9H₂O0.001～0.01、L-异亮氨酸25～27、Na₃VO₄·12H₂O 0.0005～0.005、L-赖氨酸盐酸盐20～60、SnC1₂·2H₂O 0.00001～0.0001、L-蛋氨酸10～30、Na₂SeO₃ 0.002～0.01、L-苯丙氨酸10～30、FeSO₄·7H₂O 0.2～1.6、L-脯氨酸10～30、葡萄糖1000～4000、L-丝氨酸15～45、维生素C 0.176～0.704、L-苏氨酸10～30、对羟基苯甲酸0.5～1.5、L-色氨酸5～15、丙酮酸钠55～550、L-缬氨酸10～30、亚油酸0.01～0.05、L-亮氨酸25～75、β-巯基乙醇0.8～4.0、二水L-酪氨酸二钠144～432、乙醇胺1～5、L-胱氨酸二盐酸25～75。

本发明提供的培养基，可用于CIK细胞培养。

本发明还提供一种培养CIK细胞的方法，使用本发明的培养基培养。

本发明还提供一种培养基的检测方法，从如下几个方面检测细胞培养基：渗透压、内毒素指标、无菌性、支原体检测。

用本发明的培养基最终诱导的CIK细胞总数在14天内可达到2×10¹⁰个，CD3⁺、CD56⁺阳性率最低10％，最高可达到50％，细胞存活率大于95％，优于传统的培养基。本发明的培养基还有稳定性好、可质控的特点。

具体实施方式

实施例1

按如下配比称取试剂，其最终的浓度单位为mg/L：L-精氨酸300、CuSO₄·5H₂O0.005、L-天门冬酰胺75、L-天门冬氨酸30、L-谷氨酸30、Ni(NO₃)₂·6H₂O 0.0002、L-谷氨酰胺500、ZnSO₄·7H₂O 0.6、甘氨酸15、CoCl₂·6H₂O 0.008、L-组氨酸30、NaSiO₃·9H₂O 0.01、L-异亮氨酸27、Na₃VO_4·12H₂O 0.005、L-赖氨酸盐酸盐60、SnC1₂·2H₂O 0.0001、L-蛋氨酸30、Na₂SeO₃ 0.01、L-苯丙氨酸30、FeSO₄·7H₂O 1.6、L-脯氨酸30、葡萄糖4000、L-丝氨酸45、维生素C 0.704、L-苏氨酸30、对羟基苯甲酸1.5、L-色氨酸15、丙酮酸钠550、L-缬氨酸30、亚油酸0.05、L-亮氨酸75、β-巯基乙醇4.0、二水L-酪氨酸二钠432、乙醇胺5、L-胱氨酸二盐酸75、地塞米松0.005、人转铁蛋白50、胰岛素20、纯化人转铁蛋白、胆固醇60、过氧化氢酶50、亚硒酸钠35和1％二巯基乙醇溶液1.0ml/L。

实施例2

按如下配比称取试剂，其最终的浓度单位为mg/L：

L-精氨酸100、CuSO₄·5H₂O0.0005、L-天门冬酰胺25、L-天门冬氨酸10、L-谷氨酸10、Ni(NO₃)₂·6H₂O 0.00002、L-谷氨酰胺200、ZnSO₄·7H₂O0.06、甘氨酸5、CoCl₂·6H₂O0.001、L-组氨酸10、NaSiO₃·9H₂O0.001、L-异亮氨酸25、Na₃VO₄·12H₂O 0.0005、L-赖氨酸盐酸盐20、SnC1₂·2H₂O 0.00001、L-蛋氨酸10、Na₂SeO₃ 0.002、L-苯丙氨酸10、FeSO₄·7H₂O0.2、L-脯氨酸10、葡萄糖1000、L-丝氨酸15、维生素C 0.176、L-苏氨酸10、对羟基苯甲酸0.5、L-色氨酸5、丙酮酸钠55、L-缬氨酸10、亚油酸0.01、L-亮氨酸25、β-巯基乙醇0.8、二水L-酪氨酸二钠144、乙醇胺1、L-胱氨酸二盐酸25、地塞米松0.001、人转铁蛋白5、胰岛素8、纯化人转铁蛋白1、胆固醇20、过氧化氢酶20、亚硒酸钠17.3和1％二巯基乙醇溶液0.35ml/L。

实施例3

按如下配比称取试剂，其最终的浓度单位为mg/L：

L-精氨酸150、CuSO₄·5H₂O0.001、L-天门冬酰胺50、L-天门冬氨酸20、L-谷氨酸20、Ni(NO₃)₂·6H₂O 0.0001、L-谷氨酰胺300、ZnSO₄·7H₂O0.03、甘氨酸10、CoCl₂·6H₂O 0.004、L-组氨酸20、NaSiO₃·9H₂O0.008、L-异亮氨酸26、Na₃VO₄·12H₂O 0.0001、L-赖氨酸盐酸盐30、SnC1₂·2H₂O 0.00008、L-蛋氨酸20、Na₂SeO₃ 0.008、L-苯丙氨酸20、FeSO₄·7H₂O1.0、L-脯氨酸20、葡萄糖2000、L-丝氨酸30、维生素C 0.374、L-苏氨酸20、对羟基苯甲酸1.0、L-色氨酸10、丙酮酸钠350、L-缬氨酸20、亚油酸0.04、L-亮氨酸50、β-巯基乙醇2.3、二水L-酪氨酸二钠319、乙醇胺4、L-胱氨酸二盐酸50、地塞米松0.003、人转铁蛋白25、胰岛素10、纯化人转铁蛋白5、胆固醇40、过氧化氢酶30、亚硒酸钠17.3，以及1％二巯基乙醇溶液0.8ml/L

实施例4

CIK细胞获取

取患者外周血50ml，转入2支50ml离心管，1600rpm(400g)离心5min，吸取上层淡黄色血浆，转移至新的50ml离心管中，置于56℃灭活30min，2000rpm(900g)离心10min，取上清分装后置于4℃保存备用。

实施例5

CIK细胞诱导及测试准备

在上述分离的单个核细胞悬液中添加重组人IFN-γ终浓度为1000U/ml，然后均分为四份移入四个培养瓶中。其中1-3号培养瓶分别用实施例1-3的培养基调整细胞为1×10⁶/ml得到实验组细胞。第4号培养瓶用GT551培养基调整细胞为1×10⁶/ml,添加重组人IFN-γ终浓度为1000U/ml得到GT551对照组。所有培养瓶置于37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24小时，之后，每瓶添加人CD3单克隆抗体，人重组白介素1和人重组白介素2，终浓度分别为100ng/ml，100U/ml和500U/ml。此后，每隔48小时进行一次换液，培养至第14天后收集CIK细胞待用。

实施例6

CIK细胞增殖的对比测试试验

方法：细胞在37℃，5％CO₂饱和湿度条件下，在相应无血清细胞培养液中生长(14天)，观察细胞形态并进行细胞计数。

结果：培养(14天)的细胞一部分为圆形，一部分呈不规则形态，一部分悬浮生长，一部分抱团生长。14天后细胞计数，GT551组的细胞扩增了120倍左右，细胞数量为3x10⁹，本发明培养基组平均扩增了240倍，细胞数量6x10⁹。

实施例7

CD3⁺CD56⁺阳性率试验

方法：用荧光素标记的单克隆抗体及流式细胞仪检测细胞抗原CD3和CD56的表达。

结果：14天CD3⁺CD56⁺双阳性率，GT551组为11.59％，本发明培养基组平均为53.73％。

实施例8

细胞存活率试验

方法：用台盼蓝染色检测细胞存活率。

结果：14天细胞存活率，GT551组为90％，本发明培养基组平均为95％。

实施例9

质控方法

鉴别：

1、渗透压

按渗透压测量仪进行测定，渗透压在260～320mOsm/kg范围为合格。

2、内毒素

(1).标准品稀释：取10EU/支工作标准品1支，加BET水1ml，在漩涡混合器上混合15分钟后，制成10EU/ml的工作标准品母液；用检查用水将内毒素标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准溶液。

(2).根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ)用BET水将标准品母液稀释至2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30s。

(3).取鲎试剂2支加BET水0.2ml作为阴性对照，2支加0.1mlBET水和2λ的工作标准品0.1ml作为阳性对照。取鲎试剂各加0.1mlBET水和0.1ml2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的样品作为供试品管，放入37℃±1℃水浴，保温60±2分钟。产品内毒素指标小于0.1EU。

3、无菌

供试品的制备：用灭菌镊取出注射器，在火焰旁将针芯插入针管并安上针头，供试品瓶盖和注射器针头均应迅速通过火焰数次，用注射器吸取已混合好的供试品2ml。

取上述供试品在近火焰上以右手小指为主拔开培养基管的塞子，管口通过火焰后，移至火焰下侧，沿培养管壁分别接种于需氧菌、厌氧菌培养6管(其中1管于操作结束后移至接种室接种金黄色葡萄球菌对照菌液1ml)，真菌培养基5管，轻摇使匀，需氧菌、厌氧菌培养基在30-35℃培养，真菌培养基在20-25℃培养7日，培养期间应逐日检查是否有菌生长(阳性对照在24h内应有菌生长)，并填写检查记录。

在加入供试品后，培养基出现混浊，培养7日后，不能从外观上判断无微生物生长，可取该培养液适量接种于同种新鲜培养基中或斜面上，继续培养，细菌培养2日，真菌培养3日，观察是否再现混浊或斜面上有无菌落生长，在接种同时，取培养液少量，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长。

4、支原体检测

供试品如在分装后24小时内进行支原体检查可储存在2～8℃，超过24小时应置-20℃以下贮存。

检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基(或支原体琼脂培养基)，半流体培养基(或支原体琼脂培养基)121℃高压灭菌25分钟，冷却至56℃左右加入灭活的小牛血清(培养基：血清为8:2)并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。

取每支装量为10ml的支原体半流体培养基(已冷至36℃士1℃)和支原体肉汤培养基各4支，每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36℃士1℃培养21天。于接种后的第7天从4支中取2支进行次代培养，每1支培养基转种支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基各2支，置36℃士l℃培养21天，每隔3天观察1次。

结果判定：培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。

Claims

1.一种免疫细胞细胞培养基，其特征在于成分和含量如下，

单位为mg/L的成分为：

L-精氨酸100～300、CuSO₄·5H₂O 0.0005～0.005、L-天门冬酰胺25～75、L-天门冬氨酸10～30、L-谷氨酸10～30、Ni(NO₃)₂·6H₂O 0.00002～0.0002、L-谷氨酰胺200～500、ZnSO₄·7H₂O 0.06～0.6、甘氨酸5～15、CoCl₂·6H₂O 0.001～0.008、L-组氨酸10～30、NaSiO₃·9H₂O 0.001～0.01、L-异亮氨酸25～27、Na₃VO₄·12H₂O 0.0005～0.005、L-赖氨酸盐酸盐20～60、SnC1₂·2H₂O 0.00001～0.0001、L-蛋氨酸10～30、Na₂SeO₃ 0.002～0.01、L-苯丙氨酸10～30、FeSO₄·7H₂O 0.2～1.6、L-脯氨酸10～30、葡萄糖1000～4000、L-丝氨酸15～45、维生素C 0.176～0.704、L-苏氨酸10～30、对羟基苯甲酸0.5～1.5、L-色氨酸5～15、丙酮酸钠55～550、L-缬氨酸10～30、亚油酸0.01～0.05、L-亮氨酸25～75、β-巯基乙醇0.8～4.0、二水L-酪氨酸二钠144～432、乙醇胺1～5、L-胱氨酸二盐酸25～75、地塞米松0.001～0.005、人转铁蛋白25～50、胰岛素8-20、纯化人转铁蛋白1-30、胆固醇40-60、过氧化氢酶20-50、亚硒酸钠17.3-35，

单位为ml/L的成分为：

1％二巯基乙醇溶液0.35-1.0。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于地塞米松、人转铁蛋白、胰岛素、纯化人转铁蛋白、胆固醇、过氧化氢酶，亚硒酸钠和二巯基乙醇成分含量如下：地塞米松0.003mg/L、人转铁蛋白30mg/L、胰岛素10mg/L、纯化人转铁蛋白5mg/L、胆固醇40mg/L、过氧化氢酶30mg/L，亚硒酸钠17.3mg/L和1％二巯基乙醇溶液0.7ml/L。

3.一种培养CIK细胞的方法，其特征在于使用如权利要求1或2所述的培养基培养。