CN103642689A - 一种哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置及用其培养胚胎的方法 - Google Patents

一种哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置及用其培养胚胎的方法 Download PDF

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Abstract

一种哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置及用其培养胚胎的方法，它涉及一种胚胎的体外培养装置及用其培养方法。它解决哺乳动物胚胎体外摆动式微动态培养器的缺陷，解决了现有专利技术存在的不足。培养装置由玻璃微流通道层、主体层、气压室密封盖、导气管、注射器、电动马达和方波发生器构成。培养方法：一、设定方波发生器的频率和电动马达的伸缩速度；二、注入培养液和矿物油，并胚胎放入培养室；三、接通开关，进行培养。本发明应用于生物领域。

Description

一种哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置及用其培养胚胎的方法
技术领域
本发明涉及一种胚胎的体外培养装置及用其培养方法。
背景技术
为了模拟雌性哺乳动物生殖系统内环境，现在的体外培养装置基本采用摆动式微动态培养。摆动式微动态培养器容易导致培养液洒出，而且这样摆动和晃动导致胚胎不断撞击质地坚硬的培养皿的培养皿壁，影响胚胎发育；而且，培养皿要单独设计，底部设置有方形凸起，才能保证培养皿在培养过程中不会掉落或移动。
为了克服上述的缺陷，发明人发明了专利“一种哺乳动物胚胎体外培养器及其培养方法”（专利号：ZL201210416329.7，申请日：2012年10月26日），该发明专利体外培养器中培养液的液面是规律性上下波动，避免了“摆动或晃动”产生的问题。但是在使用过程中发现，该专利技术中仍存在诸多不足：①磁片与膜片容易分离脱落，导致培养器无法正常工作；②由于线圈产生的电磁辐射可能导致后期胚胎发育异常或畸形，在一定程度上对胚胎的发育产生不良影响；③磁片直接与培养液接触，需要选用特殊的材质如钕铁硼，导致成本升高，而且钕铁硼易于粉化腐蚀，表面的化学处理还可能影响胚胎的发育。④膜片的位移量是固定的，不能进行调节，不能适合不同哺乳动物胚胎发育的需求。
发明内容
本发明是为了解决哺乳动物胚胎体外摆动式微动态培养器的上述缺陷，也为了解决专利“一种哺乳动物胚胎体外培养器及其培养方法”（专利号：ZL201210416329.7）存在的不足，而提供的一种哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置及用其培养胚胎的方法。
哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置由玻璃微流通道层、主体层、气压室密封盖、导气管、注射器、电动马达和方波发生器构成；
其中，玻璃微流通道层上设置有凹陷的中央室和凹陷的流路通道，流路通道与中央室相通，中央室的凹陷深度大于流路通道；
主体层设置有气压室、培养室和膜片，主体层与玻璃微流通道层相连接，气压室和培养室贯穿主体层，培养室设置在流路通道末端并与流路通道相连通，气压室与中央室相对应，膜片设置在气压室底部；
气压室密封盖位于气压室上部，将气压室密封；
导气管一端穿过气压室密封盖位于气压室内，另一端与注射器相连；
注射器的活塞柄与电动马达固定连接，电动马达和方波发生器之间通过导线连接。
用上述体外微动态培养装置培养哺乳动物胚胎的方法：
一、按照不同哺乳动物胚胎发育所需条件，设定方波发生器的频率和电动马达的伸缩速度；
二、从培养室向流路通道和中央室中注入胚胎发育所需的培养液和矿物油，并将体外受精的胚胎放入培养室中同时通过显微镜观察确认胚胎已置于培养室；
三、固定注射器、接通方波发生器的开关，将该体外微动态培养装置放到二氧化碳浓度为5%的培养箱中进行培养，即可完成哺乳动物胚胎的体外微动态培养。
本发明哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置通过方波发生器控制电动马达的伸缩，电动马达的伸缩直接带动注射器活塞运动，改变气压室内的气压，膜片随压室内气压的变化而运动，从而使培养液、矿物油在中央室、流路通道和培养室内运动，模拟胚胎在哺乳动物体内的生长发育环境，刺激胚胎，使胚胎处于动态的、微观的、三维的生长环境，提高了囊胚发育率和增加囊胚内总的细胞数，进而可提高胚胎质量和着床率。
本发明操作简单、使用方便，适合推广应用。
本发明避免了因摆动和晃动导致培养液的洒落，避免了胚胎与坚硬培养皿壁的碰撞，不使用特殊结构的培养皿，无需担心培养皿在微动态培养过程中掉落。
本发明哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置采用气压推动膜片运动无需使用磁片，免除了磁片可能带来的不良影响。本发明哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置的中央室深度大，更为真实的模拟哺乳动物体内生长发育环境，并可以产生更大的流量同时为多个培养室提供模拟生长发育环境。本发明哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置通过对电动马达伸缩速度的调节控制膜片的形变量，可以适合不同哺乳动物胚胎的发育需求。
附图说明
图1是本发明哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置的结构示意图。
图2是本发明哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置玻璃微流通道层1的俯视图。
图3是本发明哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置玻璃微流通道层1的A-A剖面结构示意图。
图4是本发明哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置主体层2的B-B剖面结构示意图。
图5是本发明哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置主体层2的俯视图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：结合图1～5说明本实施方式，本实施方式哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置由玻璃微流通道层1、主体层2、气压室密封盖4、导气管5、注射器6、电动马达7和方波发生器8构成；
其中，玻璃微流通道层1上设置有凹陷的中央室1-1和凹陷的流路通道1-2，流路通道1-2与中央室1-1相通，中央室1-1的凹陷深度大于流路通道1-2；
主体层2设置有气压室2-1、培养室2-2和膜片2-3，主体层2与玻璃微流通道层1相连接，气压室2-1和培养室2-2贯穿主体层2，培养室2-2设置在流路通道1-2末端并与流路通道1-2相连通，气压室2-1与中央室1-1相对应，膜片2-3设置在气压室2-1底部；
气压室密封盖4位于气压室2-1上部，将气压室2-1密封；
导气管5一端穿过气压室密封盖4位于气压室2-1内，另一端与注射器6相连；
注射器6的活塞柄6-1-1与电动马达7固定连接，电动马达7和方波发生器8之间通过导线连接。
固定注射器6，然后打开方波发生器8的开关，通过方波发生器8控制电动马达7的伸缩，电动马达7的伸缩直接带动注射器6的活塞6-1运动，实现气体在气压室2-1的进出，随气压室2-1内气压的变化带动膜片2-3运动，从而使培养液、矿物油在中央室1-1、流路通道1-2和培养室2-2内运动，实现模拟胚胎在哺乳动物体内的生长发育环境。
本实施方式体外微动态培养装置还可以包括定时装置，定时装置用于定时控制方波发生器8，使得电动马达7定时伸缩和定时停止，达到模拟母体昼起夜伏的状态。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：气压室2-1的横截面与中央室1-1的横截面面积相等、形状相同。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：中央室1-1横截面为圆形，气压室2-1与中央室1-1的横截面为同轴圆。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一、二或三的不同点是：膜片2-3为弹性不透水膜片2-3。其它步骤及参数与实施方式一、二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同点是：流路通道1-2以中央室1-1为中心对称设置。其它步骤及参数与实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一的不同点是：流路通道1-2为2～8条。其它步骤及参数与实施方式一至五之一相同。
可以对应的设置2～8个培养室2-2。
具体实施方式七：结合图1～5说明本实施方式，本实施方式哺乳动物胚胎按以下步骤进行体外微动态培养：
一、按照不同哺乳动物胚胎发育所需条件，设定方波发生器8的频率和电动马达7的伸缩速度；
二、从培养室2-2向流路通道1-2和中央室1-1中注入胚胎发育所需的培养液和矿物油，并将体外受精的胚胎放入培养室2-2中同时通过显微镜观察确认胚胎已置于培养室2-2；
三、固定注射器6、接通方波发生器8的开关，将该体外微动态培养装置放到二氧化碳浓度为5%的培养箱中进行培养，即可完成哺乳动物胚胎的体外微动态培养。
实施例1
在同样的条件下完成小鼠的超数排卵、培养基准备、卵母细胞采取、小鼠精子采集、体外受精、胚胎的鉴定以及初步培养。初步鉴定培养后的胚胎在相同培养的条件下分三组进行对比试验，第一组胚胎植入普通培养皿，第二组胚胎植入现有专利技术（“一种哺乳动物胚胎体外培养器及其培养方法”，专利号：ZL201210416329.7）体外培养装置，第三组胚胎植入本发明体外微动态培养装置。
对比试验步骤：
1．超数排卵
取昆明品系60日龄段小鼠32只，在下午6时每只小鼠腹腔注射10IU的孕马血清促性腺激素，48小时后再注射10IU的人绒毛膜促性腺激素，对小鼠进行超数排卵处理，小鼠在注射人绒毛膜促性腺激素后13到18小时内收集卵母细胞。
2．培养基准备
采用市售的人输卵管培养基，于采卵前一天在直径35毫米的培养皿中做好6～10个培养液滴，用矿物油覆盖，放入37℃含5％的二氧化碳培养箱中平衡12小时以上。
3．卵母细胞的采取
颈椎脱臼的方法处死小鼠，剖腹取出连带输卵管和卵巢的子宫，然后剪下输卵管放入矿物油中，在输卵管的膨大部用解剖针稍稍刺破，将卵母细胞团引出，并导入到市售的磷酸缓冲液液滴中。然后用含有0.1%透明质酸酶的磷酸缓冲液脱颗粒细胞处理5至10分钟，然后用吸卵针反复吸吹，直到颗粒细胞完全脱落后用配制好培养基洗3次，备用。
4．小鼠精子采集与体外受精
4.1 小鼠精子采集
精子采集取昆明品系的雄性小鼠，3月龄左右的20只，按Nakagata的方法，颈椎脱臼处死后，连同附睾一起取出睾丸，剪下附睾的上体部，用解剖针刺破后挤出精子，再用解剖针挑取精子放入事先准备好的人输卵管培养基，在体外受精前放入二氧化碳培养箱中培养1小时，使精子充分获能，备用。
4.2 体外受精
将培养1小时的精子悬浮液在显微镜下检查精子活力和精子数量，然后用移液器按每个培养基液滴10微升，约含精子1000个/微升，移入卵母细胞10～15枚，放入二氧化碳培养箱中培养12小时。
4.3 2-细胞期胚胎的鉴定
在体外受精后5至7小时，将培养皿从二氧化碳培养箱中取出，用吸卵针将受精卵从受精液移入到新的胚胎培养基液滴中清洗3次后，再放入新的胚胎培养基液滴中，放回二氧化碳培养箱培养。
5.采用常规液滴培养法进行胚胎初步培养
将2-细胞期胚胎随机分为3组放入各组的培养装置中，培养液均采用CZB培养液（ChatotC.Z.,Ziomek C.A and Bavister B.D.培养液）。
第一组将CZB培养液倒入培养皿中，然后按常规方法将胚胎植入培养皿中，再移入含5%二氧化碳、温度为37℃的培养箱中培养。
第二组按以下步骤操作：
ⅰ、将方波发生器的频率设定在5～10赫兹；
ⅱ、从培养室向流路通道中注入小鼠胚胎发育所需的CZB培养液、矿物油，该矿物油为市售的胚胎培养用矿物油（mineral oil）；将体外受精的小鼠胚胎放入培养室中，同时将该培养器放置显微镜下，确认胚胎已置于培养室中；
ⅲ、接通线路开关；
ⅳ、将整个培养器放到含5%二氧化碳、温度为37℃的培养箱中培养。
第三组按本发明步骤操作：
一、按照不同哺乳动物胚胎发育所需条件，设定方波发生器8的频率为0.25Hz、电动马达7的伸缩速度为5mm/s，注射器6为5ml注射器；
二、从培养室2-2向流路通道1-2和中央室1-1中注入胚胎发育所需的培养液和矿物油，并将体外受精的胚胎放入培养室2-2中同时通过显微镜观察确认胚胎已置于培养室2-2；
三、固定注射器6、接通方波发生器8的开关，将该体外微动态培养装置放到二氧化碳浓度为5%、温度为37℃的培养箱中进行培养。
三组同时培养96小时，确认囊胚发育率和使用赫斯特荧光染料33342染色检查囊胚内的细胞数。
重复对比试验三次，并统计实验结果如表1所示。
表1
Figure BDA0000424357710000061
注：*胚胎畸形率计算标准：A级分裂对称，无碎片；B级分裂对称，碎片＜10%；C级分裂对称或不对称，10%≤碎片＜50%；D级碎片≥50%；C级和D级合并为畸形胚胎，胚胎畸形率=畸形胚胎数/供培养的胚胎数×100%。
实验证明利用本发明进行体外培养囊胚发育率更高，囊胚内的细胞数更多，胚胎畸形率大幅降低。本发明能够明显提高胚胎发育质量，可进一步提升胚胎着床率。

Claims (7)

1.一种哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置，其特征在于哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置由玻璃微流通道层（1）、主体层（2）、气压室密封盖（4）、导气管（5）、注射器（6）、电动马达（7）和方波发生器（8）构成；
其中，玻璃微流通道层（1）上设置有凹陷的中央室（1-1）和凹陷的流路通道（1-2），流路通道（1-2）与中央室（1-1）相通，中央室（1-1）的凹陷深度大于流路通道（1-2）；
主体层（2）设置有气压室（2-1）、培养室（2-2）和膜片（2-3），主体层（2）与玻璃微流通道层（1）相连接，气压室（2-1）和培养室（2-2）贯穿主体层（2），培养室（2-2）设置在流路通道（1-2）末端并与流路通道（1-2）相连通，气压室（2-1）与中央室（1-1）相对应，膜片（2-3）设置在气压室（2-1）底部；
气压室密封盖（4）位于气压室（2-1）上部，将气压室（2-1）密封；
导气管（5）一端穿过气压室密封盖（4）位于气压室（2-1）内，另一端与注射器（6）相连；
注射器（6）的活塞柄（6-1-1）与电动马达（7）固定连接，电动马达（7）和方波发生器（8）之间通过导线连接。
2.权利要求1所述的一种哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置，其特征在于气压室（2-1）的横截面与中央室（1-1）的横截面面积相等、形状相同。
3.权利要求2所述的一种哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置，其特征在于中央室（1-1）横截面为圆形，气压室（2-1）与中央室（1-1）的横截面为同轴圆。
4.权利要求1所述的一种哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置，其特征在于膜片（2-3）为弹性不透水膜片（2-3）。
5.权利要求1所述的一种哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置，其特征在于流路通道（1-2）以中央室（1-1）为中心对称设置。
6.权利要求5所述的一种哺乳动物胚胎的体外微动态培养装置，其特征在于流路通道（1-2）为2～8条。
7.用权利要求1所述的体外微动态培养装置培养哺乳动物胚胎的方法，其特征在于哺乳动物胚胎按以下步骤进行体外微动态培养：
一、按照不同哺乳动物胚胎发育所需条件，设定方波发生器（8）的频率和电动马达（7）的伸缩速度；
二、从培养室（2-2）向流路通道（1-2）和中央室（1-1）中注入胚胎发育所需的培养液和矿物油，并将体外受精的胚胎放入培养室（2-2）中同时通过显微镜观察确认胚胎已置于培养室（2-2）；
三、固定注射器（6）、接通方波发生器（8）的开关，将该体外微动态培养装置放到二氧化碳浓度为5%的培养箱中进行培养，即可完成哺乳动物胚胎的体外微动态培养。
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