CN105670931A

CN105670931A - 一种近交系小鼠胚胎腭突体外旋转培养仪及其培养方法

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Publication number: CN105670931A
Application number: CN201610239707.7A
Authority: CN
Inventors: 肖文林; 张岱尊
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-04-18
Filing date: 2016-04-18
Publication date: 2016-06-15

Abstract

本发明公开了一种近交系小鼠胚胎腭突体外旋转培养仪及其培养方法。旋转培养仪包括载物旋转盘和箱体，载物旋转盘位于箱体的上方；箱体内设置锂电池、和控制电路，锂电池、直流电机和控制电路互相连接，减速机与直流电机相连，载物旋转盘通过传动轴与减速机相连；转速调节阀与直流电机相连；箱体的外壁设有显示屏。培养腭突的方法包括下列步骤：（1）解剖显微镜下取材；（2）培养箱中培养；（3）第一次换液；（4）第二次换液；（5）降速。本发明的培养仪设计独特、结构紧凑、独立供电、操作方便。培养方法模拟腭突器官在近交系小鼠体内的显微环境，维持器官内部的发育分化以及结构与功能特征，可以更加直观地观察和研究腭突器官的发育及分化过程。

Description

一种近交系小鼠胚胎腭突体外旋转培养仪及其培养方法

技术领域

本发明涉及一种近交系小鼠胚胎腭突体外旋转培养仪及其培养方法，属于动物胚胎培养技术领域。

背景技术

先天性唇腭裂是人类最常见的出生缺陷之一，其发病机制复杂，涉及遗传、环境等多种因素的相互作用。虽然唇腭裂的确切病因和发病机制尚未完全阐明，但是体内和体外的实验研究在揭示唇腭裂的发病机制方面已经取得了很大的进展。运用唇腭裂动物模型进行体内实验，至今仍是最常用的实验方法。但是体内实验受机体本身多种因素的干扰。为排除体内因素的影响，器官培养就成为最主要的方法之一。所谓器官培养是指从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离而保持其原有器官的结构，直接将器官或器官的一部分在体外生长和移植。其目的是在体外情况下，维持器官内部的发育分化以及结构与功能特征，这样可以直观地观察和研究器官的发育分化过程。

20世纪中期，表面培养方法、悬浮培养方法以及金属栅栏式培养方法相继问世，随着分子生物学技术的进步，涉及唇腭裂发病的确切病因和机制正在趋向完善。体外的腭突器官研究在揭示唇腭裂发病机制上已经取得了很大进步，体外动物模型的建立模仿体内胚胎发育，至今仍然是最常用的实验方法。传统的腭突组织体外培养方法主要是为腭突组织提供一种静态的、二维的体外生长环境，但是此装置可以为腭突组织提供动态、三维生长，较好的模拟体内胚胎发育。使用此组织培养仪，进行小鼠腭突组织体外培养，可观察到腭突成功融合的现象。另外，在小鼠胚胎腭突组织培养过程中，腭突培养24h-48h期间，要进行培养液的更换，以保证体外腭突器官有足够的营养支持，除此之外，腭突器官培养也需要一定的物理性机械刺激，促进其生长发育融合，而这些物理性机械力的刺激是传统腭突组织体外培养方法无法达到的。

中国专利CN201210416329.7和CN201310617790.3公开了类似的培养器和培养方法，但是，他们是针对整个胚胎的培养。本发明在结合现有技术的基础上，进一步改良了腭突组织的培养方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种近交系小鼠胚胎腭突体外旋转培养仪及其培养方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

首先，本发明提供了一种近交系小鼠胚胎腭突体外旋转培养仪，包括载物旋转盘和箱体，载物旋转盘位于箱体的上方；

箱体内设置锂电池、和控制电路，锂电池、直流电机和控制电路互相连接，减速机与直流电机相连，载物旋转盘通过传动轴与减速机相连；

转速调节阀与直流电机相连；箱体的外壁设有显示屏。

所述的锂电池是可充电式锂电池。进一步的，箱体的外壁设有充电口，锂电池与充电口相连。

本发明所述的直流电机是微型直角涡轮减速直流电机，箱体是环保型防水密封优质的塑料箱体。锂电池选用轻薄型超能可组合的锂电池，不仅可以满足旋转载物台持续运转时间长的要求，而且相对减小了电池体积。实现了仪器可用于狭小空间的要求。采用了PWM控制方式，节能低耗、运转平稳、可实现线性无级调速。布线采用接插件排线模式，结构简单、装拆维护十分方便。根据锂电池的容量，充电一次可以旋转48小时以上，这样可以减少锂电池的体积，做到整个仪器的小型化，最终能放在细菌培养箱中。

本发明还提供一种利用所述的旋转培养仪培养近交系小鼠胚胎腭突的方法，包括下列步骤：

（1）将孕13.5天的近交系小鼠脱颈处死,在75%的酒精中浸泡消毒。无菌环境下，取出胚胎。在解剖显微镜下取材，将近交系小鼠胚胎上的融合前的腭突组织取出。

（2）将腭突组织放置于直径为3cm的培养皿内的微孔滤膜上并加入培养液，并保证滤膜漂浮在培养液表面；将置有腭突组织的培养皿放入载物旋转盘，设定旋转培养仪的转速为20-25转/分钟；一同放到含有5%的二氧化碳、37℃的培养箱中培养。

（3）步骤（2）培养24h后，无菌条件下取出旋转培养仪并更换培养皿中的培养液，加入相同的培养液，然后在培养液中额外加入壳聚糖，壳聚糖与培养液的重量比是1-2:10；同时将旋转培养仪的转速匀速升高到35-40转/分钟。

（4）步骤（3）培养12h后，无菌条件下取出旋转培养仪并更换培养皿中的培养液，加入相同的培养液，然后在培养液中额外加入胎牛血清FBS，胎牛血清FBS与培养液的重量比是2-3:10；同时将旋转培养仪的转速调整为30-35转/分钟。

（5）步骤（3）培养6h后，将旋转培养仪的转速匀速降低到零，每分钟降低0.5-1转；旋转培养仪静止后，继续培养6h，，直到腭突组织的双侧腭突完全融合，培养结束。

优选的，步骤（3）中，升高转速时每分钟升高0.5-1转。

另外，本发明的步骤（4）中，加入胎牛血清FBS可以换成牛血清白蛋白（BSA）。

本发明使用的培养液的成分为：DMEM/F12（1:1）培养基和10%胎牛血清FBS（Hyclone公司，美国），1%青霉素-链霉素溶液（Hyclone公司，美国）。

对于胚胎器官来说，其细胞生长活跃，迁移能力强，组织尚未完全分化，容易受外界的诱导而向其他方向分化生长，导致培养失败，因此为了维持器官的基本形态及结构，必须设置某种抑制物来防止细胞的迁移以及组织的分化。本发明中，通过在培养液中加入壳聚糖，起到了很好的防止细胞迁移以及组织分化的作用。本发明中加入壳聚糖的分子量是5万-10万。

另外，申请人通过研究发现，转速对胚胎腭突组织的培养非常重要，常规的静止培养法，腭突不是水平向生长、靠拢、最终融合，而是向下方生长；导致实验失败；通过旋转培养，旋转力可以克服重力，模拟了胚胎在子宫内的环境（有液体浮力可以减轻胚胎受到的重力）。腭突生长可能对重力很敏感，重力可以改变其生长方向。现有技术中，虽然出现了旋转培养胚胎的方法，转速恒定，但是腭突的培养并不能完全照搬胚胎的方法，腭突只是胚胎中的一个器官，对培养条件要求更高。

本发明的有益效果：

1.本发明的培养仪具有设计独特、结构紧凑、独立供电、操作方便、外形比例协调美观、功耗小、噪音低，耐温防潮、持续运行时间长、线性无级调速、运行平稳、显示直观等特点。专业用于医疗、生物以及农牧等科研机构。

2.本发明提供的培养方法模拟腭突器官在近交系小鼠体内的显微环境，维持器官内部的发育分化以及结构与功能特征，可以更加直观地观察和研究腭突器官的发育及分化过程。

本发明的近交系小鼠胚胎腭突体外旋转培养仪是在结合上述腭突培养方法及设备的优点的基础上设计而成的。一它允许以较容易的方法进行胚胎腭突取材，并且不破坏腭突的自然解剖位置，最大限度的模拟了自然状态下（体内）腭突的发育过程；二它利用自身的旋转平台来放置放有体外培养腭突的培养皿，可以在普通的细胞组织培养箱中培养，代替了旋转培养箱，使其可以普及应用。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1是本发明旋转培养仪的结构图。

图2是本发明体外培养不同发育时期的腭突体视显微镜下位置和形态的图像。

图3是本发明体外培养不同发育时期的腭突冠状位切片的HE染色图像。

1载物旋转盘，2箱体，3锂电池，4直流电机，5减速机，6控制电路，7转速调节阀，8显示屏，9充电口。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供了一种近交系小鼠胚胎腭突体外旋转培养仪，包括载物旋转盘和箱体，载物旋转盘位于箱体的上方；

转速调节阀与直流电机相连；箱体的外壁设有显示屏。

本实施例所述的直流电机是微型直角涡轮减速直流电机，箱体是环保型防水密封优质的塑料箱体。锂电池选用轻薄型超能可组合的锂电池，不仅可以满足旋转载物台持续运转时间长的要求，而且相对减小了电池体积。实现了仪器可用于狭小空间的要求。采用了PWM控制方式，节能低耗、运转平稳、可实现线性无级调速。布线采用接插件排线模式，结构简单、装拆维护十分方便。根据锂电池的容量，充电一次可以旋转48小时以上，这样可以减少锂电池的体积，做到整个仪器的小型化，最终能放在细菌培养箱中。

实施例2

利用实施例1提供的仪器，培养近交系小鼠胚胎腭突的方法，包括下列步骤：

（1）无菌环境下，解剖显微镜下取材，将近交系小鼠胚胎上的腭突组织取出。

（2）将腭突组织放置于直径为3cm的培养皿内的微孔滤膜上并加入培养液，并保证滤膜漂浮在培养液表面；将置有腭突组织的培养皿放入载物旋转盘，设定旋转培养仪的转速为22转/分钟；一同放到含有5%的二氧化碳、37℃的培养箱中培养。

（3）步骤（2）培养24h后，无菌条件下取出旋转培养仪并更换培养皿中的培养液，加入相同的培养液，然后在培养液中额外加入壳聚糖，壳聚糖与培养液的重量比是1-2:10；同时将旋转培养仪的转速匀速升高到38转/分钟。升高转速时每分钟升高0.5转。

（4）步骤（3）培养12h后，无菌条件下取出旋转培养仪并更换培养皿中的培养液，加入相同的培养液，然后在培养液中额外加入胎牛血清FBS，胎牛血清FBS与培养液的重量比是2-3:10；同时将旋转培养仪的转速调整为33转/分钟。

（5）步骤（3）培养6h后，将旋转培养仪的转速匀速降低到零，每分钟降低0.5转；旋转培养仪静止后，继续培养，直到腭突组织的双侧腭突完全融合，培养结束。

实施例3

（4）步骤（3）培养12h后，无菌条件下取出旋转培养仪并更换培养皿中的培养液，加入相同的培养液，然后在培养液中额外加入牛血清白蛋白（BSA），牛血清白蛋白（BSA）与培养液的重量比是2-3:10；同时将旋转培养仪的转速调整为33转/分钟。

实施例4

具体试验方法以及试验结果如下：

实验方法：

1、实验动物

取C57BL/6J近交系10周龄小鼠50只，在晚上8点进行按雌雄比例2:1合笼交配，次日早晨8点将雌鼠检出，并检查带有阴道栓者记为0.5d（day）。于孕鼠13.5d时断颈处死，无菌条件下，体式显微镜下剪取胚胎腭突。

2、培养液制备

3、腭突取材

将妊娠13.5d的C57BL/6J小鼠断颈处死，75%乙醇浸泡1min，无菌条件下取出胚胎眼科剪剪下鼠胚头部放入无菌CMFPBS液中洗涤3次，参照Shiota的方法并加以改进在体视显微镜下，沿胚胎颈部水平剪取胚胎头使胎头倒置，用显微外科直剪分别从左右口角处入路水平剪去下颌及舌体部分，暴露口腔内双侧腭，从双眼平面做水平切口切除双侧眼裂水平面以上部分，放到置于培养皿内的滤膜上，加入培养液然后放入37℃、5%二氧化碳培细胞培养箱中进行培养。具体培养方法按照实施例2的进行。

4、结果观察

为了观察不同发育时期的变化，分别于0h、24h、36h、48h后取出胚胎腭突，在放入4%甲醛固定前，用眼科镊将组织移行于倒置解剖显微镜下，观察体外培养不同发育时期的腭突位置和形态，结果如图2所示。另分别于0h、24h、36h、48h后取出胚胎腭突，放入4%甲醛固定。后续包埋，切片，结果如图3所示。

图2的A部分：在GD13.5时（刚取材后），双侧腭突体积较小，两腭突之间间隙较大，口腔面观察可以看到鼻腔底部结构；图3的A部分:在GD13.5时，双侧腭突体积较小，呈垂直向生长，腭突之间间隙较大。

图2的B部分：腭突体外器官培养24h后，两侧腭突体积增大，双侧腭突逐渐向水平方向靠近，双侧腭突间隙较前明显减小；图3的B部分：腭突体外器官培养24h后，双侧腭突逐渐向水平方向靠近，并逐渐呈水平向生长。

图2的C部分:腭突体外器官培养36h后，双侧腭突继续向中线方向靠近并部分区域接触、融合；图3的C部分：腭突体外器官培养36h后，双侧腭突继续靠近接触，形成了腭中嵴上皮缝（Medialepithelialseam，MES）。

图2的D部分：腭突体外器官培养48h后，体视显微镜下示双侧腭突与鼻腔侧完全接触融合，口腔面可见完整的上腭；图3的D部分：腭突体外器官培养48h后，双侧腭突完全融合，MES消失，腭突间充质细胞均匀，形成完整的上腭。

试验结果统计如下：

重复3次上述实验步骤，并将实验结果统计如下：共在无菌条件下取材36只胚胎腭突，并在培养36小时后，双侧腭突开始部分接触、融合，接触/融合率为61%(22/36)，并观察到有SEM（腭突中嵴上皮缝）的存在；48h后，双侧腭突完全融合，融合率100%，SEM消失。

需要说明的是：对整个培养过程来说，36小时的融合率并不重要，重要的是48小时的融合率。正常情况下（跟母体一样），48小时应该是完全融合的。本发明的培养方法48h后双侧腭突完全融合，融合率100%。

利用本发明的装置及方法，是模拟了母体。利用本发明的研究成果可以开展如下研究：如在孕前期给小鼠以致畸剂，再使其怀孕。此时我们可以应用体外培养看致畸剂是否影响腭突融合（48h后）。如影响，我们再对胚胎进行后续分子生物学研究。

根据试验结果，可进一步证明本发明所述的培养仪以及培养方法在进行小鼠腭突器官体外培养比较传统培养方法更为可靠，更具明显提高腭突融合率、腭突体外器官成活效率。

Claims

1.一种近交系小鼠胚胎腭突体外旋转培养仪，其特征在于，包括载物旋转盘和箱体，载物旋转盘位于箱体的上方；

转速调节阀与直流电机相连；箱体的外壁设有显示屏。

2.根据权利要求1所述的旋转培养仪，其特征在于，所述的锂电池是可充电式锂电池。

3.根据权利要求2所述的旋转培养仪，其特征在于，箱体的外壁设有充电口，锂电池与充电口相连。

4.利用权利要求1或2所述的旋转培养仪培养近交系小鼠胚胎腭突的方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）将孕13.5天的近交系小鼠脱颈处死,在75%的酒精中浸泡消毒，无菌环境下，取出胚胎，在解剖显微镜下解剖取材，将胚胎上的融合前的腭突组织取出；

（2）将腭突组织放置于直径为3cm的培养皿内的微孔滤膜上并加入培养液，并保证滤膜漂浮在培养液表面；将置有腭突组织的培养皿放入载物旋转盘，设定旋转培养仪的转速为20-25转/分钟；将旋转培养仪放到含有5%的二氧化碳、37℃的培养箱中培养；

（3）第一次换液：步骤（2）培养24h后，无菌条件下取出旋转培养仪并更换培养皿中的培养液，加入相同体积和成分的培养液，然后在培养液中额外加入壳聚糖，壳聚糖与培养液的重量比是1-2:10；同时将旋转培养仪的转速匀速升高到35-40转/分钟；

（4）第二次换液：步骤（3）培养12h后，无菌条件下取出旋转培养仪并更换培养皿中的培养液，加入相同的培养液，然后在培养液中额外加入胎牛血清FBS，胎牛血清FBS与培养液的重量比是2-3:10；同时将旋转培养仪的转速调整为30-35转/分钟；

（5）步骤（3）培养6h后，将旋转培养仪的转速匀速降低到零，每分钟降低0.5-1转；旋转培养仪静止后，继续培养6h，直到腭突组织的双侧腭突完全融合，培养结束。

5.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，升高转速时每分钟升高0.5-1转。